Adaptation de 3' Amplification rapide des ADNc se termine pour mapper les transcriptions en Cancer

L’objectif global de cette procédure est de déterminer les séquences de transcrits d’ARNm de l’extrémité à trois premiers jusqu’aux régions de la région codante de la protéine en utilisant des amorces imbriquées spécifiques au transcrit dans deux PCR ultérieures et en séquençant les produits de PCR purifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine génétique, telles que la détermination du signal de polyadénylation, du codon stop et de la séquence de la région non traduite à trois premiers du transcrit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée à n’importe quel transcrit si la séquence de la petite région du cadre de lecture ouvert est L’implication de cette technique s’étend au diagnostic du cancer, car elle peut détecter des gènes de fusion spécifiques à la tumeur et des variantes d’épissage.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons identifié de nouveaux transcrits avec des régions non traduites à trois amorces auparavant non caractérisées. Pour commencer le protocole, décongelez le mélange de cellules d’isothiocyanate de phénol et de guanidine sur de la glace. Une fois décongelé, ajoutez 100 microlitres de chloroforme dans le tube de microcentrifugation dans une hotte PCR.

Agitez l’échantillon pendant 10 à 15 secondes jusqu’à ce que le mélange soit rose et opaque. Ensuite, incubez l’échantillon sur de la glace pendant 15 minutes. Après l’incubation, centrifugez l’échantillon pendant 15 minutes à 20, 800 g et quatre degrés Celsius.

Retirez soigneusement la phase aqueuse incolore supérieure et transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, passez à la précipitation et ajoutez un volume égal d’isopropanol à l’échantillon. Ajoutez un microlitre de co-précipitant à l’échantillon pour agir comme un support pour l’ARN et pour aider à visualiser l’ARN dans les étapes ultérieures.

Incuber les échantillons à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Après l’incubation, transférez l’échantillon dans une centrifugeuse refroidie et faites-le tourner pendant 35 minutes à 20 800 g et quatre degrés Celsius. Après le spin, l’ARN apparaîtra sous la forme d’une tache bleue au bas du tube.

Retirez soigneusement l’isopropanol de l’échantillon. Ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 80 % et remettez le granulé en suspension en tourbillonnant brièvement pendant trois secondes. Centrifugez à nouveau l’échantillon.

Retirez tout l’éthanol de l’échantillon et laissez l’échantillon sécher à l’air libre pendant environ 10 minutes. Une fois l’échantillon sec, mettez-le en suspension dans 35 microlitres d’eau sans RNase. Ensuite, placez l’échantillon sur un bloc de chaleur.

Réglez à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes pour vous assurer que l’ARN est complètement en solution. Après avoir chauffé, placez immédiatement le tube sur de la glace. Pour un volume de réaction final de 50 microlitres, ajoutez quatre microgrammes d’ARN total avec de l’eau ajoutée à un volume total de 22 microlitres dans un nouveau tube.

Ajoutez deux microlitres de l’amorce Oligo dT 25 à partir de la solution d’amorce de 10 micromolaires. À partir du kit de transcription inverse, ajoutez deux microlitres de l’inhibiteur de la RNase, huit microlitres du tampon de réaction 5x, quatre microlitres de dNTP de 10 millimolaires et deux microlitres de transcriptase inverse. Mettre en place une réaction sans transcriptase inverse pour agir comme un contrôle négatif.

Incuber le tube à 42 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, transférez le tube directement sur de la glace avant de le transporter vers le bloc chauffant. Ensuite, chauffez le tube à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après l’avoir chauffé à 75 degrés Celsius, placez le tube sur de la glace. Transférez deux microlitres d’ADNc dans un tube PCR frais de 0,5 millilitre. Ajoutez un microlitre d’amorce avant et un microlitre d’amorce inverse à partir d’une solution d’amorce de 10 millimolaires.

Préparez jusqu’à 12,5 microlitres en ajoutant 8,5 microlitres d’eau sans nucléase et ajoutez 12,5 microlitres du 2x PCR au mélange maître de gel. Ensuite, entrez les conditions de cycle thermique de la PCR répertoriées à l’écran et exécutez la PCR. Après la PCR, préparez un gel d’agarose à 1 % coloré au bromure d’éthidium.

Dissoudre un gramme d’agarose dans 100 millilitres de triacétate ou de tampon TAE dans une fiole de 250 millilitres. Faites bouillir le contenu au micro-ondes. Laissez le gel refroidir pendant une minute et ajoutez 7,5 microlitres de solution de bromure d’éthidium dans une hotte.

Bien mélanger en remuant la fiole. Versez le contenu dans un appareil de gel horizontal et laissez le gel se solidifier à température ambiante dans la hotte pendant au moins 30 minutes. Couvrez le gel avec 1x tampon TAE et chargez 10 microlitres du produit PCR sur le gel d’agarose avec trois à cinq microlitres de l’échelle de poids moléculaire de l’ADN.

Faites fonctionner le gel à 175 volts pendant 10 minutes. Pour la première PCR, transférez un microlitre d’ADNc dans un tube PCR et ajoutez cinq microlitres de tampon de réaction 10x Pfu. Ajoutez un microlitre de la première amorce avant imbriquée, un microlitre de l’amorce T7 Oligo dT 25 et un microlitre de dNTP à partir d’une solution de 10 millimolaires.

Préparez jusqu’à 49 microlitres de volume total en ajoutant 40 microlitres d’eau. Ajouter un microlitre d’ADN polymérase Pfu et bien mélanger. Ensuite, exécutez la PCR.

Ensuite, préparez la deuxième PCR. Transférez deux microlitres des produits de la première PCR dans un nouveau tube PCR et mélangez-le avec cinq microlitres de 10x Pfu ultra deux tampons de réaction. Ajoutez un microlitre de la deuxième amorce PCR imbriquée, un microlitre de l’amorce T7 et un microlitre de dNTP.

Produisez jusqu’à 49 microlitres de volume de réaction total en ajoutant 39 microlitres d’eau et ajoutez un microlitre d’ADN polymérase Pfu. Exécutez la PCR en utilisant le même profil PCR que la première configuration de PCR. Alternativement, au lieu d’utiliser l’ADN polymérase Pfu, une ADN polymérase chimérique peut être utilisée dans les deux PCR différentes.

Prenez cinq à dix microlitres du deuxième produit PCR et faites-le fonctionner sur un gel d’agarose. Enfin, visualisez le résultat sur un imageur. Ce gel d’agarose présente deux produits PCR distincts qui utilisent la même amorce directe mais des amorces inverses différentes et un produit PCR distinct qui a une amorce directe et une amorce inverse distinctes.

Les amorces idéales à utiliser pour la réaction basée sur la PCR sont celles qui donnent un produit PCR distinct. Les produits de la deuxième réaction PCR avec l’ADN polymérase Pfu et l’ADN polymérase chimérique ont produit des produits PCR de la même taille, bien que les conditions de cycle PCR soient différentes pour le RACE à trois primes. Les témoins négatifs de la transcriptase inverse n’ont montré aucune contamination génomique de l’ARN utilisé dans la synthèse de l’ADNc ainsi que dans les réactions ultérieures en aval.

Des produits PCR purifiés au gel ont été envoyés pour séquençage. Une séquence de Sanger représentative d’un chromatogramme séquentiel a identifié l’emplacement du codon stop, du signal de polyadénylation présumé et du site ainsi que de la queue poly A dans le produit RACE à trois primes. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de porter un équipement de protection et des gants en tout temps.

De plus, utilisez de la DNase et de la RNase stériles pour vos tubes de réactifs et autres produits jetables. N’oubliez pas que travailler avec du phénol et du chloroforme peut être extrêmement dangereux. Et des précautions telles que l’utilisation des réactifs dans une hotte et l’élimination des matériaux dans un conteneur à déchets désigné doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.