Name: Préparation, Purification et l’utilisation de Liposomes contenant de l’acide gras (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Découvrez la préparation et la purification de liposomes d'acides gras pour la biologie synthétique. Cette méthode permet de produire des vésicules monodisperses à haut rendement pour étudier les cellules minimales et les protocellules artificielles.

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J.W.S. est un enquêteur du Howard Hughes Medical Institute. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention (290363) de la Fondation Simons à J.W.S. A.E.E. tant K.P.A. souligner le soutien des fonds de démarrage de l’Université du Minnesota.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Liposomes formés à partir des acides gras ont été suggérées par beaucoup comme des modèles potentiels pour des cellules primitives en raison de leur haute perméabilité et les propriétés dynamiques. Le groupe de tête carboxylique des acides gras à chaîne unique ne permet auto-assemblage dans les membranes dans une gamme restreinte de pH, et les membranes qui en résultent sont très sensibles à la présence de sels. Ainsi, les vésicules acides gras nécessitent différente préparation et manipulation des méthodes par rapport à des vésicules phospholipidiques.
Dans ce protocole, même si nous utilisons l’acide oléique à titre d’exemple pour la formation de liposomes, autre longue chaîne des acides gras insaturés (C14) et leurs dérivés (ca. acide myristoléique, acide palmitoléique et les alcools correspondants et des esters de glycérol) constituent également des vésicules suivant la méthode de réhydratation de minces tant que la concentration de lipides totaux est au-dessus de la cmc et le pH tampon hydratation se trouve à proximité de la pKa des acides gras au sein de la membrane. Autre que tampon tris-HCl utilisé dans le présent protocole, autres systèmes tampon (ca. bicine, phosphate, borate) ont été signalés à soutenir la formation de vésicules acides gras, si vésicules formées dans un tampon phosphate ou borate sont habituellement très perméables13. Les vésicules acides gras qui en résulte après réhydratation sont polydispersés et multilamellaires, mais sont facilement converti en vésicules unilamellaires petit monodispersés par extrusion, tel que décrit. Comparé à sonication comme une méthode alternative pour générer de petites vésicules, extrusion offre plus d’options pour le contrôle de la taille de la vésicule en appliquant les membranes de taille de pore différente. Vésicules après extrusion sont généralement légèrement plus grands que la taille des pores membranaires, mais en augmentant le nombre de cycles d’extrusion, avec une granulométrie plus étroite et une taille moyenne proche de taille des pores de la membrane des vésicules peuvent être obtenus.
Pour synthétiser protocells fonctionnelle, vésicules acides gras doivent les réactions biochimiques spécifiques hôte résultant de l’encapsulation d’ARN ou d’autres blocs de construction. La méthode de réhydratation minces fournit un moyen facile de vésicules de forme contenant des matériaux encapsulés désirées. Cependant, l’efficacité d’encapsulation est relativement faible et une grande partie des matériaux précieux tels que RNA sont généralement perdues pendant le processus de purification. Dans certains cas l’efficacité de l’encapsulation peut être légèrement améliorée par cycles de gel-dégel répétés avant extrusion. Microfluidique de méthodes pour la préparation de rendement élevé de liposomes de phospholipides permettent presque efficacité d’encapsulation de 100 %, mais des méthodes analogues n’ont pas encore été développés pour vésicules acides gras.
Quelle manipulation protocells avec chélatés ou libre Mg2 +, purification après addition de solution de magnésium et repurification avant chaque instant assure l’enlèvement de fuite encapsulé matériel susceptibles d’affecter la précision de la vitesse de réaction mesures à l’intérieur des vésicules. Puisque chaque purification prend au moins 10 min pour atteindre la bonne séparation et collecter des fractions de la vésicule, l’analyse des réactions rapides est difficile, et la réaction doit être arrêtée avant la repurification de la colonne.
Le protocole que nous présentons ici est bien adapté pour la construction des liposomes d’acide gras qui hébergent des réactions imitant ceux qui pourraient se produire dans les cellules primitives. Nos protocoles permettent également des applications potentielles dans le développement de systèmes biomédicaux et autres réactions biochimiques les bioréacteurs.

Liposomes ou vésicules – compartiments délimitées par des membranes de bicouche composés de lipides amphiphiles - ont trouvé usage dans de nombreuses applications biomédicales, comme véhicules de livraison pour les produits pharmaceutiques, les modèles des membranes cellulaires et pour le développement du synthétique cellules. Nous et autres avons également employé des liposomes comme modèles de membranes de cellules primitives en début de vie. 1 , 2 , 3 , 4 en règle générale, dans ces systèmes, nous employons amphiphiles chaîne unique contenant la queue d’hydrocarbure de lipides qu’une seule (par exemple, l’acide oléique), que ces molécules sont plus simples à synthétiser sans le bénéfice des enzymes des protéines codées cellules modernes emploient.
Liposomes composés de lipides de chaîne unique sont semblables à ceux formés à partir de diacylphospholipids (p. ex., 1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycéro-3-phosphocholine ou POPC) car la limite est constituée de membranes bicouches. Liposomes formés de deux classes de lipides peuvent retenir une charge dissoute et peuvent être réduits et purifiées par différentes techniques. Plusieurs différences importantes résultent les caractéristiques chimiques des lipides de chaîne unique. Vésicules, formés par des phospholipides sont stables sur une plage de pH large, tandis que les vésicules acides gras ne sont pas stables à pH neutre à légèrement base (ca. 7-9), qui exige certaines tampon de pH pour la préparation de la vésicule. La plupart du temps, ce tampon peut également contenir des molécules solubles spécifiques pour l’encapsulation de vésicules, qui peut être soit matériaux fonctionnels (p. ex., RNA) pour les réactions biochimiques compartimentées ou des colorants fluorescents simples (p. ex., calcéine ) pour la caractérisation de la vésicule.
La présence d’une chaîne unique d’hydrocarbures produit une membrane qui est plus perméable aux solutés, tant que plus dynamique. En outre, le groupe acide carboxylique tête présent dans les résultats des acides gras dans les vésicules qui sont plus sensibles à la présence de cations divalents et de sels (p. ex., Mg2 +). Le magnésium est un des plus importantes cations divalents pour catalyser des réactions biochimiques dans protocells pour les études de l’origine de la vie. Au début de la vie, avant l’évolution des enzymes de protéines sophistiqué, RNA peut avoir été le polymère dominant, en raison de sa double capacité à se répliquer et d’effectuer de catalyse. Un exemple représentatif d’un ARN nécessitant de magnésium associés réaction est non enzymatiques ARN copie, la première fois dans les années 1960. 5 lorsque les nucléotides de RNA chimiquement activés (c.-à-d. les nucléotides 2-methylimidazolide) lient à un complexe amorce-modèle préexistant, le groupe hydroxyle en 3' de l’apprêt attaque la 5'-phosphate d’un monomère activé adjacent à déplacer le groupe (c'est-à-dire 2-méthylimidazole) laissant et formes un nouveau phosphodiester bond. Cette chimie copie RNA exige une forte concentration de Mg2 +, qui doit être chélaté pour être compatible avec les acides gras protocells. 6 un autre Mg2 +-dépendante réaction est catalysé par le ribozyme hammerhead, qui est peut-être l’ARN catalytique mieux caractérisé. Cette ribozyme, qui peut être reconstitué à partir de deux courts oligonucléotides, effectue une réaction auto-clivage qui est pratique pour surveiller par un décalage de gel. Par conséquent, il est fréquemment employé comme un ribozyme de modèle dans les études de l’origine de la vie. 7 en raison d’une exigence de cette ribozyme aboutissent magnésium, liposomes sont généralement construits par un mélange d’acides gras et esters de glycérol d’acides gras, qui sont plus stables au magnésium. 8 , 9 dans le présent protocole, nous présentons les techniques nous ont mis au point pour la préparation, la manipulation, la caractérisation de ces vésicules et démontrer l’application de ces vésicules protocells à l’hôte non enzymatique RNA copie et marteau ribozyme catalyse.

<table><tbody><tr><td>sephorose 4B</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>4B200</td><td></td></tr><tr><td>calcein</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>C0875-10G</td><td></td></tr><tr><td>tris-HCl pH8.0 1M</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>AM9851</td><td></td></tr><tr><td>acide citrique</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>251275-500G</td><td></td></tr><tr><td>hydroxyde de sodium</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>71690-250G</td><td></td></tr><tr><td>hydroxyde de potassium</td><td>Sigma</td><td>30614</td><td></td></tr><tr><td>acide oléique</td><td>Nu-Chek</td><td>U-46-A</td><td></td></tr><tr><td>monooléate de glycérol</td><td>Nu-Chek</td><td>M-239</td><td></td></tr><tr><td>Liss Rhodamine-PE</td><td>LIFE TECHNOLOGIES CORP</td><td>L1392</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de magnésium</td><td>Fisher/Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>concentré de séquage</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-830</td><td></td></tr><tr><td>sequagel DILUENT</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-840</td><td></td></tr><tr><td>15 % TBE-UREA</td><td>GEL Thermo Fisher Scientific</td><td>EC68852BOX</td><td></td></tr><tr><td>urée</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504-500G</td><td></td></tr><tr><td>titon-100x</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNA primer</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG</td><td></td></tr><tr><td>RNA modèle</td><td>IDT</td><td>5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC</td><td></td></tr><tr><td>marteau brin de substrat</td><td>IDT</td><td>5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC</td><td></td></tr><tr><td>marteau ribozyme brin</td><td>IDT</td><td>5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG</td><td></td></tr><tr><td>ensemble d’extrudeuse de vésicule</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>collecteur de fractions</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td>171041</tr><tr><td>plaques à 96 puits</td><td>Fisher</td><td>NC9995941/675</td><td></td></tr><tr><td>lecteur de plaques</td><td>Molecular Devices</td> Microscope confocal <td>SpectraMax i3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R MP Scanner à gel confocal</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon</td><td></td> 9410</tr></tbody></table>

préparation, purification et l’utilisation de liposomes contenant de l’acide gras

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes contenant la chaîne unique amphiphiles, particulièrement les acides gras, présentent des propriétés distinctes par rapport à ceux contenant du diacylphospholipids en raison des propriétés chimiques uniques de ces amphiphiles. En particulier, les liposomes d’acide gras améliorent caractère dynamique, en raison de la solubilité relativement élevée de la chaîne unique amphiphiles. De même, les liposomes contenant des acides gras libres sont plus sensibles aux cations divalents et de sels, en raison de l’interaction forte entre l’acide carboxylique groupes de tête et les ions métalliques. Ici, nous illustrons techniques de préparation, de purification et utilisation des liposomes, composé en partie ou totalité d’amphiphiles seule chaîne (par exemple, les acides oléique).

Généralement, nous effectuons des purifications liposome sur colonnes d’exclusion stérique. Liposome typique préparations contiennent un fluorophore quelconque. Lorsque les liposomes sont générées et extrudés, l’espèce doit être encapsulée est présente à l’intérieur et à l’extérieur les liposomes. Par épuration des liposomes sur une résine d’exclusion stérique (Sépharose 4 b), des solutés capsulées sont retenues dans les pores de la résine, tandis que les liposomes plus gros ne sont pas et Éluer la première (Figure 1 a). Rassemblant des fractions et le tracé de fluorescence par rapport au nombre de fraction (Figure 1 b) en général donne une trace de deux de pointe, avec les fractions à élution de début correspondant aux liposomes, qui sont ensuite collectés et utilisés dans des applications ultérieures.
Nous examinons fréquemment des réactions non-enzymatique primer extension, qui constituaient un moyen susceptible de réplication RNA avant l’émergence des ribozymes et axée sur la protéine ARN polymérases. Ces réactions emploient généralement un apprêt fluorescent étiqueté (Figure 2 a), qui s’étend de monomères activés. Ces réactions peuvent être surveillées par électrophorèse sur gel (Figure 2 b) et la résultante électrophérogrammes intégrée pour obtenir les constantes de vitesse pour un État donné de réaction (Figure 2).
Pour démontrer que RNA pouvait fonctionner à l’intérieur de la protocells, nous employons hammerhead ribozyme self-clivage (Figure 3 a) comme une réaction catalytique de RNA de modèle. Cette réaction nécessite gratuit Mg2 + à la catalyse, et c’est pourquoi nous avons utilisé des vésicules OA/OGM puisqu’ils sont plus stables en présence de 5 mM Mg2 +. Similaires aux réactions d’extension amorce, la réaction de self-clivage de ribozyme hammerhead peut également être surveillées par électrophorèse sur gel (Figure 3 b) et plus tard analysées afin d’acquérir la constante de vitesse dans des conditions particulières (Figure 3).
Nous avons l’image liposomes qui emploient les deux fluorescence et diascopie. Liposomes peuvent être étiquetés à l’aide de lipides fluorescents, qui donnent une étiquette de membrane (Figure 4 a), ou un soluté fluorescent dans leur lumière (Figure 4 b). Lumière transmise permet également d’observer les vésicules (également illustrées dans la Figure 4 b).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tableau 1.1 d’acide oléique pur dans le chloroforme</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Composant</td>
			<td>Stock</td>
			<td>Montant</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acide oléique</td>
			<td>&gt; 99 %</td>
			<td>11,7 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Chloroforme</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tableau 1.2 acide oléique et monooléate de glycérol (9:1) dans le chloroforme</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Composant</td>
			<td>Stock</td>
			<td>Montant</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acide oléique</td>
			<td>&gt; 99 %</td>
			<td>10.5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Monooléate de glycérol</td>
			<td>&gt; 99 %</td>
			<td>1,4 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Chloroforme</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acide oléique tableau 1.3 avec 0.2mol% Rhodamine-PE dans le chloroforme</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Composant</td>
			<td>Stock</td>
			<td>Montant</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acide oléique</td>
			<td>&gt; 99 %</td>
			<td>1,6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Rhodamine-PE dans le chloroforme</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Chloroforme</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Solutions de chloroforme de l’acide gras.
<img alt="Procédé de chromatographie des vésicules de calcéine ; Schéma et graphique de fluorescence montrant les résultats de séparation." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Vésicule purification et fluorescence caractérisation de la fraction de la purification. A. séparation des vésicules contenant de calcéine de calcéine gratuit sur une colonne de Sépharose 4 b. B. vésicule et détection de pics de calcéine gratuit en traçant la fluorescence dans chaque puits par rapport au nombre bien après la collecte de la fraction. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme du processus d’extension de l’ADN, résultats de l’électrophorèse sur gel et graphique d’analyse cinétique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Réplication de RNA non enzymatique à l’intérieur de vésicules OA. A. schéma d’extension d’amorce RNA non enzymatiques. B. les image de PAGE d’une réaction d’extension amorce à l’intérieur de vésicules d’acide oléique pur, aux conditions qu’à l’article 4. C. linéaire ajustement du logarithme naturel du ratio de quantité d’apprêt reste au compte tenu du point dans le temps du montant initial de primer vs temps plus 30 h Vitesse de réaction, calculée à partir de la pente du temps de vs ln (P/P,0), est 0,058 h-1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="diagramme de clivage de l’ARN, électrophorèse sur gel, tableau d’analyse cinétique ; Procédé de substrat marqué Cy3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Clivage de ribozyme Hammerhead dans les vésicules OA/OGM. A. plan de clivage ribozyme hammerhead du brin de substrat fluorescent étiquetés (en haut). B. image de la PAGE du clivage ribozyme hammerhead à l’intérieur de vésicules OA/OGM avec 5 mM Mg2 +. C. Ribozyme activité à l’intérieur des vésicules. Ajustement linéaire du logarithme naturel du ratio de quantité de substrat restant au compte tenu du point dans le temps à la quantité de substrat / temps en h 4 première réaction initiale taux, calculé à partir de la pente du temps vs de ln (s/s,0), est de 0,36 h-1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57324/57324fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Images en double microscopie de vésicules lipidiques, imagerie par fluorescence et contraste de phase." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57324/57324fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Vésicules de géant des acides gras pour la microscopie. A. image de microscopie confocale d’un PE de Rhodamine étiqueté acide oléique vésicule, échelle bar 10 μm. B. image de microscopie confocale d’acide oléique vésicule contenant Alexa488 étiqueté RNA avec membrane montré dans le canal de transmission détecteur (TD), échelle bar 5 μm.

Liposomes contenant la chaîne unique amphiphiles, particulièrement les acides gras, présentent des propriétés distinctes par rapport à ces diacylphospholipids contenant en raison des propriétés chimiques uniques de la seule chaîne amphiphiles. Nous décrivons ici les techniques de préparation, purification et utilisation des liposomes, composé en partie ou totalité de ces amphiphiles.

Préparation, Purification et l’utilisation de Liposomes contenant de l’acide gras

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

L’objectif global de cette procédure est de préparer, de purifier et d’utiliser des liposomes composés en partie ou en totalité d’acides gras. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie synthétique et en études sur l’origine de la vie, telles que la définition de cellules minimales et la construction de protocellules artificielles. Le principal avantage de ce protocole est qu’il présente un moyen facile et peu coûteux de produire des vésicules d’acides gras monodispersés à haut rendement et de les manipuler dans une gamme de conditions expérimentales.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car les vésicules d’acides gras sont plus délicates que les vésicules phospholipidiques, en particulier en présence de Pour préparer de minces films de lipides séchés, utilisez des seringues étanches aux gaz pour transférer une quantité spécifique de lipides dans le chloroforme dans un flacon en verre. Évaporez le chloroforme sous un courant d’azote ou d’argon dans la hotte. Soumettez la couche mince obtenue à l’aspirateur domestique pendant au moins deux heures pour éliminer tout chloroforme résiduel.À ce stade, le lipide pourrait être laissé sous vide pendant la nuit. Pour réhydrater les vésicules, pipetez 250 microlitres de tampon d’hydratation dans un tube vide, puis ajoutez 1,875 microlitres d’hydroxyde de sodium à 10 molaires pour une base finale de 75 millimolaires. Transférez la solution dans la fine pellicule de lipide sec pour former des vésicules avec la concentration totale d’acides gras de 0,15 molaire, puis utilisez un vortex à grande vitesse pour vortex le mélange résultant pendant quatre à cinq secondes.Agitez le mélange de tampon lipidique sur un agitateur rotatif à basse vitesse pour le réhydrater pendant la nuit. Pour générer des vésicules de taille uniforme, utilisez une pince à épiler pour appliquer un support de filtre sur chaque surface interne des orifices de seringue de l’extrudeuse de liposomes. Mouillez chaque support de filtre avec 250 millimolaires de Tris-HCL pH 8.À l’aide d’une pince à épiler, appliquez une gravure sur une piste sur une membrane en polycarbonate de 100 nanomètres sur l’un des joints toriques de l’extrudeuse et des supports de filtre. En prenant soin de ne pas déchirer ou perforer la membrane, poussez doucement la membrane dans le joint torique afin d’établir un bon contact entre les deux surfaces. Ensuite, assemblez l’extrudeuse en prenant soin de ne pas déplacer la membrane et les supports du filtre.Remplissez une seringue d’extrudeuse avec environ 0,5 millilitre de Tris-HCL pH 8 de 250 millimolaires. Insérez cette seringue dans un côté de l’extrudeur. Insérez une seringue vide de l’autre côté de l’extrudeuse.Poussez lentement le piston et le tampon contenant la seringue à la main et vérifiez que la résistance est ressentie, indiquant que la membrane gravée est en place et intacte. Il est utile de pratiquer cette étape sans membrane en place afin d’évaluer le niveau de résistance attendu. Retirez et videz les deux seringues.Il n’est pas nécessaire de nettoyer les deux seringues à ce stade car elles contiennent un tampon de composition identique à la préparation de liposomes. Ensuite, chargez la préparation liposomale dans l’une des deux seringues. Remontez l’extrudeuse avec la seringue contenant l’échantillon de vésicule sur le côté gauche et une seringue vide sur le côté droit.Ensuite, poussez très lentement à la main le piston de la seringue contenant l’échantillon de vésicule. Observez attentivement la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse. Le tampon transparent pénètre d’abord dans le côté droit de l’extrudeuse en raison du volume mort interne de l’extrudeur, suivi d’un petit panache de liposomes extrudés.Arrêtez immédiatement de pousser à ce stade. Retirez la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse et jetez la solution. Replacez la seringue sur le côté droit de l’extrudeuse et extrudez jusqu’à ce que la seringue gauche soit vide.Inversez l’orientation de l’extrudeuse et répétez le remplacement de la seringue. Continuez pendant le nombre de cycles souhaité. Un nombre impair est toujours utilisé pour s’assurer que les liposomes ne sont pas prélevés dans la seringue contenant à l’origine des liposomes non extrudés.Enfin, versez doucement le contenu de la seringue droite dans un tube Eppendorf. Placez le tube sur un agitateur rotatif à basse vitesse pendant environ 30 minutes. Pour préparer la phase mobile de purification des vésicules, préparez cinq millilitres de tampon d’hydratation Tris-HCL pH 8 de 250 millimolaires dans un tube Falcon de 15 millilitres.Ajoutez ensuite 37,5 microlitres d’hydroxyde de sodium 10 molaires au tampon d’hydratation. Pipetez 235 microlitres d’acide oléique pur dans le tube Falcon, ce qui permet d’obtenir une solution vésiculaire avec 0,15 molaire de lipides totaux. Ensuite, utilisez un vortex à grande vitesse pour vortex le mélange pendant quatre à cinq secondes.Ensuite, faites culbuter sur un agitateur rotatif à basse vitesse pendant au moins deux heures. La préparation lipidique peut être laissée toute la nuit sur le shaker rotatif à ce stade. Filtrez la phase mobile à travers une unité de filtre à seringue de 0,22 micron pour éliminer tout agrégat potentiel.Pour purifier les vésicules, préparez d’abord la colonne Sepharose 4B comme indiqué dans le protocole de texte et fixez-la sur le support de l’autoclave. Connectez ensuite l’extrémité de la colonne avec le connecteur du robinet d’arrêt et connectez le tube au collecteur de fractions. Ajoutez une autre portion de tampon pour rincer le tube et fermez le robinet d’arrêt lorsque le niveau de liquide dans la colonne s’approche du haut de la résine.Ensuite, appliquez les vésicules extrudées sur le dessus de la résine à l’aide d’une pipette de 200 microlitres en prenant soin d’appliquer la préparation des vésicules aussi uniformément que possible sur la résine sans toucher le lit de résine ou la paroi de la colonne. Ouvrez le robinet d’arrêt pour commencer l’écoulement et commencez à collecter les fractions dans une plaque de 96 puits. Appliquez la phase mobile de purification des vésicules sur le dessus du lit de résine en portions de 0,5 à un millilitre au fur et à mesure que le tampon s’épuise, en prenant soin de ne pas laisser le lit de résine se dessécher.Ensuite, collectez l’éluant en fractions de cinq gouttes, en recueillant au moins 36 puits. Pour caractériser les fractions de purification, lire la plaque à 96 puits sur un lecteur de plaques. Tracez les données de fluorescence résultantes en fonction de la fluorescence en nombre de fractions.Les vésicules éluent en premier, suivies de la fraction non encapsulée. Lors de l’utilisation de magnésium ligandé, prémélanger le chlorure de magnésium et le citrate de potassium au rapport spécifié dans un tampon Tris-HCL pH 8 de 250 millimolaires. Ici, un rapport de un à quatre est utilisé pour les vésicules d’acide oléique stables.N’oubliez pas de toujours prémélanger la solution de magnésium et de ligand. N’exposez jamais les vésicules d’acides gras au magnésium non chélaté seul. Ajouter la solution de citrate de magnésium prémélangée à l’échantillon de vésicules.Agitez brièvement le mélange. Laissez l’échantillon de vésicule sur un gobelet pendant au moins 30 minutes avant la repurification, comme décrit dans le protocole textuel. Assurez-vous d’ajouter la même concentration de magnésium et de citrate que dans l’échantillon de vésicule à la phase mobile de repurification.Mélangez la solution de magnésium avec des vésicules purifiées comme décrit dans le protocole de texte pour initier la réaction d’auto-clivage. Pour les études cinétiques, prélever 100 microlitres du mélange à chaque point temporel et repurifier directement cette aliquote à travers une colonne d’exclusion de taille Sepharose 4B avec 250 millimolaires de Tris-HCL pH 8 comme phase mobile. Récupérez la fraction vésiculaire.Préparez l’échantillon de charge d’ARN comme décrit dans le protocole texte. Placez le gel d’urée 15 % TBE coulé dans le commerce dans la boîte de gel et remplissez la boîte de gel avec 1X tampon de gel TBE. Après avoir chauffé les échantillons sur un bloc chauffant à 80 degrés Celsius pendant une minute, chargez cinq microlitres de chaque échantillon par puits.Faites fonctionner le gel avec une tension constante de 200 volts pendant environ une heure. Enfin, scannez le gel et quantifiez-le à l’aide d’un programme d’analyse. Pour démontrer que l’ARN peut fonctionner à l’intérieur des protocellules, l’auto-clivage du ribozyme de la tête de marteau avec le brin de substrat marqué par fluorescence a été utilisé comme réaction catalytique de l’ARN modèle.Cette réaction nécessite du magnésium libre pour faciliter la catalyse. Par conséquent, des vésicules monooléates d’acide oléique/glycérol ont été utilisées car elles sont stables en présence de cinq millimolaires de magnésium. La réaction d’auto-clivage du ribozyme de la tête de marteau peut être surveillée par électrophorèse sur gel.Après avoir quantifié l’image de la page, un ajustement linéaire du logarithme népérien du rapport entre la quantité de substrat restante à un point donné et la quantité initiale de substrat en fonction du temps est généré. Ce graphique peut être utilisé pour le calcul de l’activité des ribozymes. Une fois maîtrisés, les liposomes d’acides gras avec colorant encapsulé ou ARN peuvent être préparés et purifiés en 24 heures.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de former des liposomes d’acides gras dans la bonne plage de pH et de maintenir la concentration totale de lipides au-dessus de la concentration critique d’agrégation du lipide pour éviter la dissolution des vésicules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les liposomes d’acides gras et de les utiliser pour héberger des réactions biochimiques.

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