Name: Un îlots pancréatiques Murine Cell-based Screening for diabétogène Environmental Chemicals (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Découvrez l'isolation d'îlots pancréatiques murins pour le criblage de xénobiotiques inducteurs de ROS et l'évaluation de leur potentiel diabétogène. Cette méthode permet d'analyser la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une subvention de projet pilote du CREH Centre parrainé par NIEHS et par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 31572626).

Toutes les expériences animales ont été exécutés dans le respect de toutes les directives pertinentes, des règlements et des organismes de réglementation. Le protocole fait la démonstration a été réalisé sous la direction et l’approbation des institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) de la Texas A & M Institut pour la médecine génomique.
1. préparation de la solution
<ol><li>Diluer la solution saline équilibrée de Hank de x 10 à 1 x avec double distillée H2O et conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer la solution d’isolation en ajoutant HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) et du glucose (5 mM). Ajuster le pH à 7,4 et rester sur la glace.</li>
	<li>Préparer la solution de collagénase de collagénase de Type 4. Remarque : Plus précisément, la collagénase de Type 4 contient 160 U par milligramme de poids sec. 1 g de collagénase de Type 4 est dilué dans 5 mL double distillée H2O avec une concentration de 200 mg/mL. 2 mL de la collagénase dilué on ajoute 30 mL de solution d’isolation froid glace et 6 mL de solution de collagènase est transférée dans un tube de 50 mL pour chaque souris.</li>
	<li>Préparer la solution de lavage en ajoutant 1 mM CaCl2 à la solution d’isolation.</li>
	<li>Préparer la solution de purification avec la solution de diatrizoate froid polysucrose/sodium (1,1119 g/mL, 5 mL).</li>
	<li>Préparer 500 mL de milieu de culture des îlots en ajoutant de la L-glutamine (20 mM), la pénicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) et sérum fœtal (SVF) (10 %) dans un milieu RPMI.</li>
	<li>Préparer la solution mère de DHFC-DA en dissolvant la poudre dans l’eau distillée à 200 µM et conserver à-20 ° C. Remarque : Le ROS solution de coloration est fraîchement préparés en diluant la solution-mère à la concentration finale de 5 µM de RPMI DHFC-DA. Ce réactif doit être protégé de la lumière.</li>
</ol>2. préparation chirurgicale
<ol><li>Injecter par voie intrapéritonéale de (I.P.) une souris avec avertin (2,5 % avertin, 0,4 mL/20 g). Après que la souris est complètement anesthésiée et ne répond plus à hind pied pincées, euthanasier la souris et déplacez la hotte biologique.</li>
	<li>Placez la souris euthanasiée face abdominale vers le haut et pulvériser la peau avec l’éthanol à 70 % pour la stérilisation.</li>
	<li>Ouvrir la cavité abdominale avec un U-incision de 1 cm sur le haut de l’abdomen et se rétracter de la peau dans la direction rostrale sur la poitrine pour exposer la cavité abdominale.</li>
</ol>3. enlèvement et la Perfusion de pancréas
<ol><li>Tel qu’illustré à la Figure 1, recherchez l’emplacement de l’ampoule. Utiliser une paire de pinces courbée afin de serrer le duodénum à proximité de la position du sphincter d’Oddi. Utiliser une autre paire de pinces courbée afin de serrer la paroi du duodénum pour bloquer la voie de la bile dans le duodénum. Remarque : L’ampoule n’a pas été inséré dans cette étape. Cette étape vise à bloquer la voie de la bile dans le duodénum.</li>
	<li>Repositionner la souris avec la tête proximale et distale en ce qui concerne le chercheur pieds.</li>
	<li>Trouver le canal cholédoque et injecter lentement 3 mL de solution de collagènase avec une seringue de 5 mL et de l’aiguille 30 G. Assurez-vous que la voie biliaire principale et le pancréas sont gonflés après l’injection.</li>
	<li>Enlever le pancréas distendu à l’aide de la pince courbée et des ciseaux pour le séparer du côlon descendant, intestins, estomac et rate. Placer le pancréas dans un tube de 50 mL contenant 3 mL de solution de collagénase et le maintenir sur la glace.</li>
</ol>4. la Digestion du pancréas
<ol><li>Placez chaque tube de 50 mL dans un bain d’eau 37 ° C. Incuber pendant 15-20 min (temps varie selon la souche et l’âge des souris).</li>
	<li>Vibrer le tube à l’aide d’un vortex.</li>
	<li>Poule 4-5 pancréas digérées dans une passoire grand évier stérile et un scoop pour rendre le pancréas se désagrège complètement. Utiliser une seringue aiguille et 10 mL de 23 G contenant la solution de lavage pour pipeter avec force les cellules digérées hors de l’écran. Recueillir la solution de lavage dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 97 x g à 4 ° C pendant 1 min et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 25 mL de solution de lavage dans les tubes et remettre en suspension le tissu doux vortexer. Tournez en bas les tissus à 97 x g à 4 ° C pendant 1 min et éliminer le surnageant. Répéter 3 fois. Veillez à ne pas déloger le même tissu.</li>
</ol>5. purification des îlots
<ol><li>Ajouter 10 mL de solution de purification à la pastille de tissu lavé et resuspendre doucement le contenu.</li>
	<li>5 mL de solution d’isolation sur la solution de purification de superposition doucement. Veillez à conserver une interface liquide forte entre les deux solutions.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 560 x g à 4 ° C pendant 15 min avec une accélération lente et sans frein. Insérer la pipette dans l’interface et recueillir la couche des îlots dans des nouveaux tubes de 50 mL.</li>
	<li>Laver les îlots comme indiqué au point 3.5.</li>
</ol>6. électrodéposition et le traitement des cellules des îlots pancréatiques
<ol><li>Remettre en suspension les îlots dans 10 mL de la solution nutritive îlots, doucement bien mélanger et placer 100 µL/puits avec une pipette multicanaux pour une plaque à 96 puits. Placer environ 5 îlots par 96 bien.</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 12 h.</li>
	<li>Centrifuger (112 x g) la plaque 96 puits et enlever le milieu de culture.</li>
	<li>Diluer les produits chimiques environnementaux dans le milieu de culture des îlots. Ajouter 100 µL de chacune des diluants chimiques dans des puits séparés de la plaque. Remettre en suspension les îlots dans chaque puits et incuber pendant 12 h à 37 ° C (la concentration varie selon les différents produits chimiques environnementaux).</li>
</ol>7. ROS souillure et la mesure
<ol><li>Après le traitement d’îlots, laver avec du PBS 1 x (200 µL à chaque puits-96). Remarque : La concentration des substances chimiques est comme suit : AFB1 : 3 µM, Atrazine : 100µm, BaP : 10 µM, BPA : 100 µM, β-oestrogène, PCB126 : 10 µM, nonylphénol et BPA : 100 µM.</li>
	<li>Utiliser le N-acétyl cystéine (NAC) en tant qu’antioxydant pour étancher ROS. Ajouter 5 mM de la NAC dans les diluants chimiques induite par le ROS et incuber pendant 12 h à 37 ° C.</li>
	<li>Centrifuger la plaque 96 puits à x 112 g et incuber 5 solution µM de sonde fluorescente (H2-DHFC-DA dissous en milieu RPMI) à 37 ° C pendant 60 min.</li>
	<li>Laver les cellules des îlots pancréatiques traitée 3 fois avec du PBS et mesurer la fluorescence avec un lecteur de microplaques à 488 nm. Remarque : L’accumulation de DCF dans des cellules peut être mesurée par une augmentation de fluorescence à 530 nm quand l’échantillon est excitée à 488 nm.</li>
	<li>Effectuer l’insuline stimulée par le glucose sécrétion (GSIS) dosage9 sur ROS induisant des xénobiotiques traités îlots et îlots non traitées pour mesurer les xénobiotiques effets sur la fonction physiologique des îlots pancréatiques.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Accumulant les preuves suggère que l’exposition aux produits chimiques environnementaux joue un rôle important dans le développement de T2DM. Induite par le xénobiotiques ROS a été reconnue comme un facteur étiologique potentiel, contribuant au développement de T2DM. Les humains sont exposés à un large éventail de produits chimiques xénobiotiques et il y a un grand besoin de techniques de recherche novateurs pour identifier efficacement les substances toxiques du pancréas et d’étudier le mécanisme de toxicité spécifique ...

Augmentation de la prévalence de T2DM est devenus une crise de santé mondiale ces dernières années, posant une menace sérieuse pour la santé publique1. Plusieurs facteurs ont été trouvés à être causalement liée au développement de T2DM, parmi lesquels, récurrents résultats suggèrent que l’un points convergents communs pour ces facteurs sont l’induction de stress oxydatif, ce qui conduit à la génération d’excessive ROS2 , 3.
Un large éventail de produits chimiques environnementaux, y compris les BPC, les dioxines et BaP s’est avéré d’induire un stress oxydatif, qui peuvent nuire au fonctionnement des cellules β pancréatiques et conduire à l’insulino-résistance et T2DM4. Bien que le niveau physiologique de ROS joue un rôle important dans les fonctions cellulaires, exposition aux offices récepteurs qui dépasse la capacité du système antioxydant se traduit par des dommages aux cellules/tissus et conduit à des maladies5. Les cellules β du pancréas expriment un faible taux d’enzyme antioxydante et sont donc une cible sensible pour l’induite par le stress oxydatif6,7. Une exposition chronique à des concentrations élevées de ROS a été démontrée que la cause de dysfonctionnement des cellules pancréatiques induite par le stress5 ainsi que de la résistance à l’insuline dans le foie et le tissu adipeux8.
L’objectif global de ce projet est de développer un test d’amplification cellulaire aux produits chimiques pour leurs potentiels diabétogène basés sur leur induction de ROS dans les cellules du pancréas. Le pancréas n’a pas de détoxification métabolique et est une cible sensible pour les dommages causés par les xénobiotiques6,7. Par conséquent, de mesurer directement la ROS générées dans les cellules du pancréas, ce test devrait fournir une approximation directe de la lésion induite par le produit chimique dans le pancréas. Pour développer cette méthode, nous isolé des îlots pancréatiques de souris cultivées l’îlot isolé sous condition de culture cellulaire avec des produits chimiques et utilise la génération de ROS induite par le produit chimique comme la lecture. Cette procédure est simple et efficace pour identifier les ROS-induisant des produits chimiques dans l’îlot isolé ; Il peut être développé pour l’étude des mécanismes de toxicité qui sont spécifiques à la pancréas in vitro.

<table><tbody><tr><td>10&fois ; Hank' solution saline équilibrée</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>solution de polysaccharose/diatrizoate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-dichlorofluorescéine (DCFH-DA)</td><td>Lecteur de</td> microplaques à fluorescence <td>Sigma D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>streptomycine</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Souris Insuline ELISA Kit</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>pour centrifugeuse à plaques à 96 puits</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>pour la lecture de fluorescence</td></tr></tbody></table>

un îlots pancréatiques murine cell-based screening for diabétogène environmental chemicals

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

L’exposition à certains produits chimiques environnementaux chez l’homme et les animaux s’est avérée de causer des dommages cellulaires des cellules β pancréatiques qui conduira au développement du diabète de type 2 (T2DM). Bien que les mécanismes pour les dommages de cellules β induite par le produit chimique étaient peu claires et susceptibles d’être complexe, une constatation récurrente est que ces produits chimiques provoquent un stress oxydatif conduisant à la génération de trop reactive oxygen species (ROS) qui provoquent des dommages aux la cellule β. Pour identifier les produits chimiques environnementaux de potentiel diabétogène, les auteurs ont isolé des cellules des îlots pancréatiques de souris C57BL/6 et des cellules des îlots cultivés dans des plaques de 96 puits cellulaires de la culture ; Ensuite, les cellules des îlots pancréatiques ont été dosés avec des produits chimiques et la production de ROS a été détectée par 2', 7'-dichlorofluorescéine (DHFC-DA) colorant fluorescent. En utilisant cette méthode, nous a constaté que le bisphénol A (BPA), Benzo [a] pyrène (BaP) et les polychlorobiphényles (PCB), risque d’entraîner des niveaux élevés de ROS, suggérant qu’ils peuvent induire potentiellement des dommages dans les cellules des îlots pancréatiques. Cette méthode devrait être utile pour le dépistage des xénobiotiques diabétogène. En outre, les cellules des îlots pancréatiques cultivées peuvent également être adaptés pour in vitro d’analyse de la toxicité induite par le produit chimique dans les cellules du pancréas.

Un balayage de l’îlot isolé sain est montré dans la Figure 2, dans lequel les îlots ont une forme ronde ou ovale avec grandeur relativement uniforme (bien que l’uniformité de la taille peut varier d’une souche à). Nous avons ensuite étudié les fonctions d’îlots pancréatiques lors d’un test in vitro en isolant l’îlot et en stimulant la sécrétion de l’insuline dans les îlots de culture. La figure 3 montre notre analyse typ...

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les cellules des îlots pancréatiques souris pour contrôler les inductions de ROS par les xénobiotiques afin d’identifier les potentiels chimiques xénobiotiques diabétogène.

Un îlots pancréatiques Murine Cell-based Screening for diabétogène Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Les cellules du pancréas sont une cible sensible aux dommages induits par les ROS, qui sont associés au développement du diabète de type 2. Un test basé sur des cellules du pancréas aidera à identifier les produits chimiques inducteurs de ROS. Le principal avantage de cette technique est d’utiliser des cellules isolées des îlots pancréatiques pour une identification simple et efficace des produits chimiques inducteurs de ROS qui peuvent avoir des potentiels diabétogènes supplémentaires.Cette méthode peut également être utilisée pour une analyse in vitro des effets de produits chimiques sur une fonction physiologique du pancréas, comme une sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. À l’aide d’une paire de pinces incurvées, fixez le duodénum près de la position du sphincter d’Oddi. À l’aide d’une autre paire de pinces incurvées, clampez la paroi du duodénum pour bloquer la voie biliaire.Trouvez le canal cholédoque et, à l’aide d’une aiguille de calibre 30 et d’une seringue de cinq millilitres, injectez lentement trois millilitres de solution de collagénase. Ensuite, repositionnez la souris avec la tête proximale et les pieds distoraux. Assurez-vous que le canal cholédoque et le pancréas sont gonflés après l’injection.À l’aide de la pince incurvée et de ciseaux fins, retirez le pancréas distendu pour le séparer du côlon, des intestins, de l’estomac et de la rate qui descendent. Ensuite, placez l’organe dans un tube de 50 millilitres contenant trois millilitres de solution de collagénase et conservez-le sur de la glace. Placez chaque tube de 50 millilitres dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez-les pendant 15 à 20 minutes.Vortex les tubes, puis regroupez quatre à cinq organes digérés dans une grande passoire d’évier stérile et utilisez une cuillère pour bien briser le pancréas. À l’aide d’une aiguille de calibre 23 et d’une seringue de dix millilitres contenant une solution de lavage, retirez vigoureusement les cellules digérées de l’écran. Ensuite, récupérez la solution de lavage dans un tube de 50 millilitres.Centrifugez les tubes à 97 g et quatre degrés Celsius pendant une minute et décantez le surnageant. Ajoutez 25 millilitres de solution de lavage dans les tubes et remettez le tissu en suspension en tourbillonnant doucement. Ensuite, faites tourner le tissu et décantez le surnageant.Répétez le lavage trois fois en prenant soin de ne pas déloger le tissu granulé. Pour purifier les îlots, ajoutez dix millilitres de solution de purification à la pastille de tissu lavé et remettez doucement le contenu en suspension. Superposez délicatement cinq millilitres de solution d’isolement sur la solution de purification.Assurez-vous qu’une interface liquide nette est maintenue entre les deux solutions. Centrifugez le tube à 560 g à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, avec une accélération lente et sans pause. Ensuite, insérez la pipette dans l’interface et récupérez la couche d’îlots.Transférez la solution dans de nouveaux tubes de 50 millilitres avant de laver l’îlot comme nous venons de le démontrer. Après avoir retiré le lavage final, ajoutez dix millilitres de solution de culture d’îlots et mélangez doucement et soigneusement pour remettre les îlots en suspension. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 microlitres par puits dans les puits d’une plaque de 96 puits.Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 12 heures. Ensuite, centrifugez la plaque à 112g et retirez le milieu de culture. Diluer les produits chimiques de l’environnement dans le milieu de culture des îlots.Ajoutez 100 microlitres de chacun des diluants chimiques dans des puits séparés de la plaque. Remettez les îlots en suspension dans chaque puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Après le traitement chimique des îlots, utiliser 1x PBS pour laver les échantillons.Ensuite, ajoutez cinq millimolaires de N-acétylcystéine ou NAC dans les puits, comme antioxydant pour éteindre les ROS et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Centrifugez la plaque à 96 puits à 112 g, puis ajoutez une solution de sonde fluorescente à cinq micromolaires et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Utilisez le PBS pour laver les cellules d’îlots pancréatiques traitées trois fois et utilisez un lecteur de microplaques à 480 nanomètres pour mesurer la fluorescence.Enfin, effectuez le dosage de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, ou GSIS, sur les îlots traités et non traités par les ROS, afin de mesurer les effets xénobiotiques sur la fonction physiologique des îlots pancréatiques. Ici, des îlots pancréatiques sains, isolés de souris C57 Black/6, de forme ronde ou ovale et de taille relativement uniforme. Dans ce test GSIS, en utilisant des îlots isolés stimulés par du glucose pour sécréter de l’insuline, une réponse dose-dépendante a été observée.Lorsque des îlots isolés ont été traités avec les xénobiotiques énumérés ici, plusieurs produits chimiques, dont l’atrazine, le BaP, le BPA et les PCB, ont provoqué une induction significative d’espèces réactives de l’oxygène. Cependant, l’ajout de NAC a permis d’éteindre la production de ROS par les traitements chimiques. De plus, les îlots pancréatiques prétraités avec du PCB126 et du BPA ont montré une diminution significative de la sécrétion d’insuline par rapport au groupe témoin, confirmant le rôle important des ROS dans les dommages causés à la fonction physiologique des cellules bêta pancréatiques qui conduisent au DT2.Une fois maîtrisée, l’isolation des îlots pancréatiques peut se faire en deux heures si elle est réalisée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser la centrifugation à gradient pour purifier les îlots loin des autres débris pancréatiques. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les effets des produits chimiques sur les fonctions physiologiques des îlots pancréatiques.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie pour explorer les potentiels diabétogènes des produits chimiques environnementaux dans les cellules isolées des îlots pancréatiques de souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les îlots pancréatiques de souris et d’utiliser ces cellules d’îlots pancréatiques pour l’identification.

a-murine-pancreatic-islet-cell-based-screening-for-diabetogenic

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Isolement murin îlots pancréatiques

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.

In Vitro Colony Assays pour Caractériser les cellules progénitrices Tri-puissants Isolée des adultes murins Pancréas

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Une méthode d'évolution dirigée roman spécifique au domaine de l'ingénierie thermostabilité a été développé et validé par conséquent, pour les enzymes bactériolytiques. Après un seul tour de mutagenèse aléatoire, une enzyme bactériolytique évolué, PlyC 29C3, affichée deux fois supérieure à l'activité résiduelle par rapport à la protéine de type sauvage après incubation à température élevée.

Une nouvelle méthode de dépistage pour l&#39;évolution dirigée des enzymes thermostables bactériolytique

Découvrez l'isolation d'îlots pancréatiques murins pour le criblage de xénobiotiques inducteurs de ROS et l'évaluation de leur potentiel diabétogène. Cette méthode permet d'analyser la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.

Un îlots pancréatiques Murine Cell-based Screening for diabétogène Environmental Chemicals

Explorer plus de vidéos