Titrage ELISA comme une méthode pour déterminer la constante de Dissociation de l’Interaction Ligand du récepteur

L'objectif global de ce dosage ELISA de titration est de déterminer la constante d'affinité de deux partenaires de liaison d'une manière reproductible et efficace en utilisant un nouvel algorithme. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés non seulement dans le domaine de l'interaction ligand-protéine et de la recherche sur les récepteurs, mais aussi dans les sciences de la vie appliquées telles que la recherche pharmaceutique et la pharmacologie. Le principal avantage de cette technique est que la constante d'affinité d'une interaction ligand-récepteur peut être facilement déterminée en titrant un récepteur avec un ligand sur une plaque ELISA et en utilisant un nouvel algorithme d'évaluation.

Commencez cette procédure en diluant la solution de stock d'Intégrine Alpha 2 A Domain à une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre dans un tampon TBS chlorure de magnésium. Un type sauvage et un domaine A d'Intégrine Alpha 2 mutant seront utilisés dans cette démonstration. Remplissez chaque puits d'une rangée sur une demi-plaque microtitre avec 50 microlitres de la solution de revêtement du domaine A d'Intégrine Alpha 2.

Effectuez chaque rangée de titration au moins en doubles. Dans cet exemple, chaque rangée de titration est effectuée en quadruplets. Scellez la plaque avec du papier d'aluminium et laissez la plaque à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, retirez la solution de revêtement et remplissez chaque puits avec 15 microlitres de tampon TBS chlorure de magnésium. Retirez la solution de lavage et remplissez les puits avec une nouvelle solution de lavage. Les lavages élimineront les molécules de récepteur solubles qui n'ont pas été immobilisées sur la surface en plastique par absorption physique.

L'étape suivante consiste à bloquer les sites de liaison non spécifiques en ajoutant 50 microlitres d'une solution de BSA à un pour cent dans le tampon TBS chlorure de magnésium à chaque puits. Re-scellez la plaque et incubez à température ambiante pendant une heure. Pendant que les puits de la plaque microtitre sont bloqués avec de la BSA, préparez une dilution sérielle du ligand Rhodocetin.

Une concentration de départ de 243 Rhodocetin érodée par l'émail et un facteur de dilution de 2,3 sont utilisés dans ce cas. Pour les huit courbes de titration dans cette expérience, préparez 920 microlitres de solution de Rhodocetin à la concentration la plus élevée dans un pour cent de BSA dans le chlorure de magnésium TBS dans le tube numéro un. Pipettez 520 microlitres d'une solution de BSA à un pour cent dans le chlorure de magnésium TBS dans chacun des dix autres tubes de test numérotés de deux à onze.

Transférez 400 microlitres de la solution de Rhodocetin du tube de test au tube de test numéro deux. Mélangez les deux solutions par chut-ter-a-tion puis transférez 400 microlitres de ce mélange au tube de test numéro trois. Continuez cette dilution sérielle jusqu'au tube de test numéro onze.

Pour le succès de cette procédure, il est important de toujours remplir rapidement chaque puits de solution pour s'assurer que les puits ne sèchent pas. À la fin de l'incubation d'une heure, retirez la solution de blocage des puits de la plaque microtitre. Ajoutez immédiatement 50 microlitres de la solution de Rhodocetin du tube de test numéro un dans les puits de la colonne numéro un, la solution du tube de test numéro deux dans les puits de la colonne numéro deux, et continuez jusqu'à la colonne numéro onze.

Ajoutez 50 microlitres d'un pour cent de BSA et de chlorure de magnésium TBS en tant que contrôle sans ligand dans les puits de la colonne douze. Re-scellez la plaque et incubez à température ambiante pendant une heure et demie. Pour éliminer les molécules de ligand non liées, retirez la solution de liaison et remplissez chaque puits avec 50 microlitres de tampon HBS chlorure de magnésium.

Ensuite, retirez le tampon HBS et ajoutez un nouveau tampon HBS. Pour fixer chimiquement le récepteur et le ligand lié, remplissez chaque puits de la plaque microtitre avec 50 microlitres d'une solution de glutaraldéhyde à 2,5 pour cent dans le tampon HBS chlorure de magnésium. Incubez la plaque microtitre à température ambiante pendant dix minutes.

Retirez et inactivez l'excès de glutaraldéhyde en retirant la solution de fixation et en remplissant chaque puits avec 50 microlitres de tampon chlorure de magnésium TBS. Retirez le tampon de lavage et ajoutez un nouveau tampon de lavage dans chaque puits. Pour commencer cet essai, retirez le tampon de lavage de tous les puits de la plaque microtitre et ajoutez dans chaque puits 50 microlitres de la solution d'anticorps primaire, diluée de un à deux mille dans un pour cent BSA TBS chlorure de magnésium.

Re-scellez la plaque et incubez-la à température ambiante. Retirez la solution d'anticorps primaire de tous les puits et ajoutez à chaque puits 50 microlitres de tampon chlorure de magnésium TBS. Lavez trois fois avec le tampon chlorure de magnésium TBS.

Ensuite, ajoutez à chaque puits 50 microlitres de la solution d'anticorps secondaire, diluée de un à deux mille dans un pour cent de BSA dans le chlorure de magnésium TBS. Re-scellez la plaque et laissez-la se tenir à température ambiante. Retirez la solution d'anticorps secondaire des puits et ajoutez à chaque puits 50 microlitres de tampon chlorure de magnésium TBS.

Lavez trois fois. Après le troisième lavage, tapotez la plaque microtitre sur un tissu pour éliminer toutes les traces de liquide. À l'aide d'une pipette multicanal, ajoutez rapidement 50 microlitres de la solution de détection de la phosphatase alcaline dans chaque puits de la plaque microtitre pour démarrer la conversion enzymatique aussi simultanément que possible.

Incubez la plaque à température ambiante jusqu'à ce que la solution dans les puits avec la concentration en ligand la plus élevée devienne jaune. Selon l'intensité du signal, le temps d'incubation peut varier entre cinq minutes et une heure. Arrêtez la conversion du substrat de phosphatase en utilisant une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres d'une solution de sodium hydroxide à 1,5 molaire dans chaque puits dans le même ordre que la solution de détection de la phosphatase alcaline a été ajoutée.

Laissez la plaque pendant plusieurs minutes pour assurer un mélange sans traînée des deux solutions. Mesurez la densité optique à 405 nanomètres de chaque puits à l'aide d'un lecteur ELISA. Commencez l'analyse des données en ouvrant le tableau de données brutes.

Copiez les colonnes du fichier Excel, ouvrez Graph Pad Prism Five, ouvrez un nouveau fichier de projet dans le menu principal et sous nouvelle donnée et graphique, choisissez le format X Y. Choisissez l'option Entrer et Tracer un point unique pour chaque valeur pour l'axe Y et collez-les dans la feuille de données de Graph Pad Prism en tant que valeurs X et y respectivement. Transposez les valeurs de densité optique à 405 nanomètres en format de colonne.

Dans la feuille de données, la première colonne représente les concentrations en tant que ligand ajouté en tant que valeurs X, tandis que les colonnes à droite contiennent les valeurs de signal des huit courbes de titration en tant que valeurs Y. Comme un tracé semi-logarithmique sera tracé, la dernière ligne