Name: Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Découvrez l'isolation de capillaires cérébraux humains à partir de tissu frais pour étudier la barrière hémato-encéphalique. Cette méthode permet d'analyser les voies de signalisation et la fonction barrière in vitro.

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Nous remercier et remercier Dr Peter Nelson et Sonya Anderson à la Banque de tissus du cerveau UK-ADC permettant de cerveau humain tous les échantillons de tissus (numéro de licence de NIH : P30 AG028383 du National Institute on Aging). Nous remercions Matt Hazzard et Tom Dolan, Services informatiques, technologie universitaire et Engagement de faculté, Université du Kentucky pour assistance graphique. Ce projet a été soutenu par grant 1R01NS079507 numéro du National Institute of Neurological Disorders et accidents vasculaires cérébraux (à B.B.) et par grant 1R01AG039621 numéro du National Institute on Aging (à A.M.S.H).. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la National Institute of Neurological Disorders et accident vasculaire cérébral ou l’Institut National sur le vieillissement. Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Les informations ci-dessous repose sur la sécurité actuelle et des normes de réglementation à l’Université du Kentucky, Lexington, KY, é.-u.. Par mesure de précaution, se référer au programme de biosécurité de l’institution et les plus récents règlements et recommandations avant de travailler avec les tissus humains.
ATTENTION : Le tissu humain peut être une source de pathogènes à diffusion hématogène, y compris le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), virus de l’hépatite B (VHB), virus de l’hépatite C (VHC) et d’autres. Travailler avec des tissus humains pose le risque d’infection par des pathogènes à diffusion hématogène. Par conséquent, certaines considérations réglementaires et de sécurité sont indispensables lorsque vous travaillez avec des tissus humains pour protéger le personnel de laboratoire. L’utilisation de tissus humains aux Etats-Unis exige un laboratoire de niveau 2 de biosécurité ainsi que de mesures de sécurité et de formation conformément aux NIH Section IV-B-7, Loi OSHA de 1970 Clause 5(a)(1) et programme de biosécurité institutionnels de l’utilisateur. En général, approbation Comité institutionnel de biosécurité et/ou Institutional Review Board doit être obtenue avant d’effectuer toute recherche impliquant le matériel humain (tissus, fluides corporels). La formation est nécessaire pour tout le personnel travaillant avec des matériaux humains et comprend la formation de sécurité de laboratoire de base, par exemple, chimique hygiène et sécurité en laboratoire, ainsi qu’une formation spécifique sur la sécurité biologique, déchets dangereux et l’homme agents pathogènes transmissibles par le sang. Tout le personnel travaillant avec des matériaux humains est fortement recommandé afin d’obtenir des vaccins contre l’hépatite B, avant de travailler avec le matériel humain. Le personnel est tenu de porter un équipement de protection individuelle spécifique tout en travaillant avec le matériel humain, par exemple., une blouse collerette et un visage de bouclier et porter des gants en tout temps. Tous les travaux dans une placard de biosécurité (classe 2). Tout le matériel qui vient en contact avec le matériel humain et tout déchet de matériel humain est géré adéquatement pour éviter la contamination ou infection du personnel. Tous les équipements et les surfaces sont nettoyées avec 10 % d’éthanol eau de Javel et 75 % après chaque procédure impliquant le matériel humain. Un déversement avec matériel humain doit être immédiatement nettoyé. Verrerie est stérilisé après chaque utilisation. Déchets, y compris les interprétations des tissus humains, sont recueillie dans un sac à déchets étiquetés biohazard et stérilisés à l’autoclave. Objets pointus ou tranchants sont recueillies dans un récipient et fuite-résistant à la perforation étiqueté comme biologiques dangereuses. Tous les déchets de matériel humain respect des normes de sécurité biologique de l’institution.
NOTE : Notre laboratoire obtient des échantillons frais de cortex frontal de personnes décédées à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M). Critères d’inclusion sont : inscription à l’étude de cohorte longitudinale autopsie UK-ADC et un intervalle Post-Mortem (PMI) ≤4 h64. Autopsies suivent un protocole standard et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Un PMI court de moins de 4 h est de la plus haute importance pour assurer la viabilité capillaire après l’isolement. Les tissus frais et congelés peuvent être utilisés. Si le gel est nécessaire, tissus cérébraux humains fraîchement obtenu devraient être choc congelés dans l’azote liquide et conservés à-80 ° C. Tissu fraîche ou décongelé devrait être stocké dans le tampon d’isolement (voir ci-dessous) et traité rapidement. Nous trouvons que 10 g de tissu humain frais fournit environ 100 mg des capillaires de cerveau (poids humide).
1. le programme d’installation
<ol><li>
Préparation du tampon Remarque : Le volume de tampon nécessaire dépend de la quantité de tissu. Tous les volumes de mémoire tampon dans le protocole suivant sont basés sur 10 g de tissus de cortex cérébraux humains.<ol>
<li>L isolement tampon : Utiliser 1,5 L de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD ; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) et compléter avec le D-glucose (1,35 g 5 mM ) et pyruvate de sodium 1 mM (0,165 g). Après avoir ajouté du glucose et du pyruvate, ajuster le pH 7,4 avec l’hydroxyde de sodium. Laisser refroidir et stocker le tampon à 4 ° C avant de l’utiliser.</li>
		<li>L’albumine sérique bovine (BSA) : Ajouter 10 g de poudre de BSA à 1 L de tampon d’isolement à une concentration finale de BSA de 1 %. Remuez lentement pour éviter les bulles, ajuster le pH 7.4 et conserver à 4 ° C durant la nuit. Immédiatement avant utilisation, remuer doucement ; éviter la formation de bulles pour éviter la dénaturation de l’albumine.</li>
		<li>milieu de gradient de densité : peser 18 g de milieu de gradient de densité dans une bouteille en verre et ajouter un magnétique. Ajouter 60 mL de tampon d’isolement et agiter vigoureusement pendant 5 min jusqu'à ce que toute la poudre est suspendue. Magasin pendant la nuit à 4 ° C pour permettre le milieu de gradient de densité à dissoudre. Remuez pendant 10 min juste avant utilisation.</li>
		<li>Stocker tous les tampons à 4 ° C ; garder tous les outils et les tampons sur la glace lors de la procédure d’isolement complet. Mélanger tous les tampons avant utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage expérimental
	<ol>
<li>Monter le pilon de la meuleuse de tissu Potter-Elvehjem sur l’agitateur électronique généraux. Placez le moulin de tissu de Potter-Elvehjem et l’homogénéisateur Dounce avec pilon sur la glace sous le capot. Préparer une maille de filtre de 300 µm (5 x 5 cm2), pliez-le à un cône et insérer et attachez-le à un 50 mL tube Falcon avec du ruban adhésif (Figure 1 a).</li>
		<li>Placez les bagues d’étanchéité raccordement et de filtres de souche de cellules (taille des pores : 30 µm) sur tubes Falcon de 50 mL. Préparer des sacs de déchets biologiques. Placer les équipements requis dans la prévention des risques biotechnologiques armoire (voir Table des matières).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation des échantillons de cerveau
Remarque : La Figure 1 a montre le diagramme de flux de travail de la technique d’isolation complet décrit ci-dessous. Le tissu de cerveau humain peut provenir de n’importe quelle partie du cortex et peut être utilisé frais ou congelés. Tissu cérébral congelés peut être décongelé à température ambiante (pas de mémoire tampon ; ~ 30 min pour 10 g). Pour obtenir des résultats comparables, le tissu cérébral devrait provenir de la même région du cerveau pour chaque expérience. Ce protocole est optimisé pour les frais (PMI < 4 h) cortex cérébral humain qui n’a pas été congelé.
<ol><li>Préparation du tissu de cerveau humain : documenter le poids du tissu cérébral. Tous les numéros dans le protocole suivant sont appropriés pour 10 g de tissu cérébral humain frais. Placer le tissu cérébral dans une boîte de Pétri de 100 mm. Enlevez soigneusement toutes les méninges avec une pince. Utiliser un scalpel pour couper la matière blanche.</li>
	<li>Hacher du tissu cérébral humain : soigneusement découpé le tissu cérébral et il mâche avec un scalpel. Hacher finement pendant environ 5 min (morceaux de 2 à 3 mm). Transférer le tissu cérébral à la meuleuse de tissu de Potter-Elvehjem. Ajouter 30 mL de tampon de l’isolement. Remarque : Les morceaux de tissus hachées sont difficiles à voir car le tissu cérébral se transforme en bouillie par le processus de hachage.</li>
</ol>3. homogénéisation
<ol><li>Moulin de tissu Potter-Elvehjem (clairance : 150 – 230 µm) : homogénéiser chaque échantillon avec 100 coups à une vitesse d’homogénéiseur de 50 tr/min. Le document le temps chaque 25 coups et le temps total nécessaire pour 100 coups. Voir le tableau 1 pour un protocole proposé homogénéisation ; la durée totale de 10 g de cortex frontal humain l’homogénéisation est d’environ 22 min. Ne remuez pas dans l’air pour éviter les bulles.</li>
	<li>Dounce homogénéisateur (clairance : 80 – 130 µm) : transférer l’homogénat dans un homogénéisateur Dounce sur glace. Homogénéiser la suspension avec 20 coups (~ 6 s/course, total d’environ 2 min). Éviter les bulles.</li>
</ol>4. centrifugation
<ol><li>Distribuer l’homogénat de cerveau également dans quatre tubes de centrifugation de 50 mL et le volume total de l’homogénat de document. Distribuer 50 mL de tampon de gradient de densité dans les tubes de centrifugation (12,5 mL par tube). 10 mL de tampon d’isolement permet de rincer le pilon et l’homogénéisateur et distribuer dans les quatre tubes de centrifugation (~2.5 mL par tube).</li>
	<li>Bien fermer les tubes de centrifugeuse avec bouchons. Mélanger l’homogénat, milieu de gradient de densité et tampon en secouant vigoureusement les tubes. Centrifuger à 5 800 x g pendant 15 min à 4 ° C (rotor angle fixe) ; Sélectionnez une vitesse de décélération moyenne pour garder le culot au tube. Jeter le surnageant et remettre chaque culot en suspension dans 2 mL de 1 % de BSA.</li>
</ol>5. filtration
NOTE : Pour séparer les capillaires de globules rouges et autres débris cellulaires, plusieurs étapes de filtration sont nécessaires.
<ol><li>300 µm maille : après re-suspension du culot, filtrer la suspension à travers les mailles de 300 µm. Capillaires sont filtrés à travers les mailles, considérant que les navires plus grands et plus gros débris de cerveau demeurent sur le maillage. Laver soigneusement la maille avec jusqu'à 50 mL, de 1 % de BSA. Jeter le filet. Remarque : Cette étape de filtration efface la suspension capillaire de plus gros navires ou morceaux de débris de cerveau.</li>
	<li>
Filtre de 30 µM cellule souche Remarque : Cette étape de filtration sépare les capillaires des globules rouges et autres débris de cerveau.<ol>
<li>Distribuer le filtrat capillaire de l’étape 6.1 sur les filtres de déformation de cellule cinq 30 µm (environ 10 mL de filtrat capillaire par filtre de cellule souche). Capillaires sont freinés par ce filtre, tandis que les globules rouges monocellules et autres débris de petit cerveau passent par le filtre et sont rassemblés dans le filtrat.</li>
		<li>Lavez chaque filtre avec 25 mL de 1 % de BSA. Par la suite, tous les filtrats Napper le sixième filtre pour augmenter le rendement. Lavez chaque filtre avec 50 mL de BSA 1 % ; conserver la cellule souche filtres avec contenant les capillaires et d’ignorer le filtrat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. capillaire Collection
<ol><li>Renversez les filtres et laver les capillaires avec 50 mL de BSA 1 % pour chaque filtre en tubes de 50 mL. Doucement, appliquer une pression avec la pointe de la pipette d’une pipette de 5 mL et déplacez-le dans le filtre pour éliminer les capillaires du cerveau.</li>
	<li>Assurez-vous de laver tous les capillaires de cerveau, en particulier de la jante du filtre. Éviter les bulles car cela complique le processus de filtration et augmente les risques de perte capillaire.</li>
</ol>7. laver
<ol><li>Après avoir recueilli les capillaires, centrifuger les échantillons à 1 500 x g pendant 3 min à 4 ° C (balancement seau rotor). Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans environ 3 mL de tampon d’isolement. Combiner tous les granulés resuspendues dans un échantillon dans un tube conique de 15 mL et remplissez-le avec le tampon de l’isolement. Centrifuger à nouveau à 1 500 g pendant 3 min à 4 ° C et laver deux fois plus.</li>
	<li>Le document la pureté capillaire avec un microscope (grossissement de X 100) et l’appareil photo (Figure 1 b). Remarque : Le rendement de capillaire de cerveau de 10 g de tissus cérébraux humains est habituellement environ 100 mg. Les capillaires cérébraux isolés peuvent maintenant être utilisés pour des expériences, transformés (p. ex.., lysat, isolation membrane), ou être congelés flash et stockées à-80 ° C dans des cryotubes pour un minimum de 6 à 12 mois (éviter de multiples cycles de gel-dégel).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le présent protocole décrit l’isolement des capillaires de cerveau humain intact et viable de tissus frais. Dans cette section, nous discutons en détail de ce qui suit : 1) les modifications au protocole 2) dépannage des messages d’erreur, 3) les limites de la technique, 4) l’importance du modèle en ce qui concerne l’existant et des modèles alternatifs de barrière hémato - encéphalique, et 5). applications potentielles pour les capillaires du cerveau humain isolé.
Le protocole décrit ici est o...

La barrière hémato - encéphalique est une interface étroitement contrôlée entre le sang et le cerveau qui détermine ce qui se passe dans et sort du cerveau. Anatomiquement, cellules endothéliales composent la barrière hémato - encéphalique et forment un réseau capillaire complexe et continu. Physiologiquement, ce réseau capillaire alimente le cerveau en oxygène et en nutriments tout en simultanément élimination du dioxyde de carbone et les déchets métaboliques. Ce qui est important, la preuve étaye que les modifications apportées à la barrière contribuent à nombreuses pathologies comme la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie et AVC1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerveau cellules endothéliales servent également un obstacle au traitement en bloquant l’absorption de drogues dans le cerveau, par exemple., chimiothérapie du glioblastome multiforme suite tumeur résection8,9, 10. À cet égard, les capillaires du cerveau humain isolé représentent un modèle de barrière hémato - encéphalique unique ex vivo qui ressemble étroitement à barrière propriétés in vivo, qui permet l’étude de la fonction de barrière et de dysfonctionnement en santé et la maladie. Dans cet article, nous fournissons un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du cerveau humain à une qualité constante capillaire et le rendement afin d’étudier la barrière hémato - encéphalique.
En 1969, Siakotos et al. 11 ont été le premier à signaler l’isolement des capillaires de cerveau du tissu de cerveau bovines et humaines utilisant la densité gradient centrifugation et verre perle colonne séparation. Plus tard, Goldstein et al. 12 ce procédé amélioré en ajoutant plusieurs étapes de filtration pour diminuer la quantité de tissu nécessaire pour étudier les capillaires de cerveau isolées de rats, tout en maintenant l’activité métabolique du transport du glucose. Depuis lors, les chercheurs optimisé la technique d’isolation capillaire maintes fois, amélioration du procédé et cerveau modèle capillaire avec chaque itération13,14,15. Par exemple, airelles et al. 16 isolé bovines capillaires à l’aide de la digestion enzymatique et non homogénéisation mécanique et puis par la suite passé une suspension capillaire à travers un filtre à tamis 210 µm et une colonne de perle de verre. Ces modifications amélioré la tache d’exclusion bleu trypan des capillaires cérébraux isolés et ainsi, augmenter la viabilité des cellules endothéliales. Dans les années 1990, Dallaire et al. 17 isolées des bovins et rat des capillaires qui étaient claires de contamination neuronale et maintient l’activité métabolique des γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) et la phosphatase alcaline. En 2000, Miller et al. 18, utilisé isolé du rat et des capillaires de cerveau porcin en combinaison avec la microscopie confocale à montrer l’accumulation des substrats de transport dans la lumière des capillaires. Par la suite, notre laboratoire a continué d’optimiser la procédure d’isolement capillaire de cerveau et nous avons établi des essais de transport afin de déterminer la P-glycoprotéine (P-gp)19,20,21, le cancer du sein résistance à la protéine (BCRP)22,23et multirésistance protéine 2 (Mrp2) activité de transport de24 . En 2004, nous avons publié deux rapports où nous avons utilisé des capillaires de cerveau de rat isolé pour enquêter sur les différentes voies de signalisation. Hartz et al. 21, nous avons trouvé que le peptide de l’endothéline-1 rapidement et de façon réversible réduit fonction transport P-gp dans les capillaires de cerveau en agissant par l’intermédiaire du récepteur de l’endothéline récepteur B (ETB), l’oxyde nitrique synthase (NOS) et protéine kinase C (PKC). Dans Bauer et al. 19, nous avons démontré l’expression du récepteur récepteur nucléaire pregnane X (PXR) et montre PXR-modulation de la P-gp expression et transport fonction dans les capillaires du cerveau. Dans des expériences avec des souris transgéniques de PXR humanisés, nous avons élargi cette ligne de recherche et montré in vivo de serrage de la barrière de ses P-gp et hPXR activation25. En 2010, Hartz et al. 26 a utilisé cette méthode pour restaurer l’expression des protéines P-gp et transporter l’activité chez les souris de protéine (hAPP) précurseur de l’amyloïde humain transgénique qui surexpriment hAPP. En outre, rétablir la P-gp dans hAPP souris réduit significativement la bêta-amyloïde (Aß)40et taux bêta-amyloïdes dans le cerveau42.
En plus d’étudier les voies de signalisation, les capillaires cérébraux isolés peuvent être utilisés pour déterminer les changements dans la perméabilité capillaire que nous appelons une fuite capillaire. En particulier, le test de fuite de Texas Red est utilisé pour évaluer la fuite du colorant fluorescent Texas rouge de la lumière capillaire dans le temps et ces données sont ensuite utilisées pour analyser le taux de fuite. Les taux de fuite capillaire accrue par rapport à celles des capillaires de contrôle indiquent des changements dans l’intégrité physique de la barrière hémato - encéphalique2. C’est précieux parce qu’il y a de nombreux états pathologiques liés à la rupture de la barrière, par exemple., épilepsie, sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer et traumatisme cérébral lésion27,28,29, 30. Autres groupes ont également utilisé des capillaires isolées pour discerner les voies de signalisation qui régulent l’expression de la protéine et l’activité de transport des protéines31,32,33,34, 35,36,37. Enfin, nous avons continué à optimiser cette méthode pour l’isolement des capillaires du cerveau humain et, récemment, nous avons montré expression accrue de la P-gp à l’humaine barrière hémato - encéphalique chez les patients atteints d’épilepsie par rapport aux individus de témoin sans saisie38 . Pris ensemble, ces développements démontrent que les capillaires cérébraux isolés peuvent servir d’un modèle polyvalent pour étudier la fonction de barrière.
Divers in vivo, ex vivoet in vitro de barrière hémato - encéphalique modèles ont été utilisés en recherche fondamentale et de dépistage des drogues industrielle, principalement dans le but de tester des medicaments pour le cerveau39,,40,41 ,42,43,44. Outre isolés ex vivo le capillaires du cerveau, les modèles actuels de barrière hémato - encéphalique comprennent des modèles de in silico , in vitro culture cellulaire des cellules endothéliales des capillaires cérébraux isolés ou de lignées cellulaires immortalisées par divers espèces, la culture in vitro des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) qui se différencient en cellules endothéliales capillaires du cerveau et des modèles sur une puce microfluidique.
In silico modèles sont plus couramment utilisés dans le développement de médicaments pour la sélection des candidats-médicaments basés sur prédite d’absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) Propriétés. Méthodes telles que les modèles de relation (QSPR) quantitative structure-propriété et quantitative structure-activité (RQSA) sont des méthodes populaires utilisés dans le criblage à haut débit des bibliothèques pour prédire la pénétration de cerveau de candidats-médicaments 45 , 46. ces modèles sont utiles aux molécules d’écran des propriétés de barrière de la pénétration.
Betz et al. 47 a créé monocouches de cellules endothéliales des capillaires cerveau cultivé comme un système de modèle in vitro barrière hémato - encéphalique. In vitro cell cultures de modèles à l’aide de tissu frais ou lignées de cellules endothéliales immortalisées comme les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébrale humaine (hCMECs) peuvent être un autre outil de criblage à haut débit pour la pénétration du cerveau ou des études mécanistes. Cependant, les modèles de culture de cellules endothéliales capillaires cerveau n’ont pas la contrainte de cisaillement physiologique du débit sanguin à l’intérieur de la lumière capillaire, sont limitées à une complexité biologique dans l’ensemble et subissent des changements dans l’expression et la localisation des composants de la barrière importante comme les protéines des jonctions serrées, ion, les transporteurs, les enzymes et les récepteurs de surface de canaux48,49,50. À l’inverse, monocouches endothéliales dérivé de hPSCs, présenter une perméabilité de saccharose faible par rapport aux cultures hCMEC/D3 et contenir l’expression polarisée de certains transporteurs de barrière hémato - encéphalique, molécules d’adhérence et de jonctions serrées51, 52. Cependant, ces cellules sont également sous réserve de modification des propriétés dans la culture et le système doit être validé pour sa récapitulation de in vivo de propriétés de barrière52.
Nouvelles tendances dans la recherche de la barrière hémato - encéphalique incluent utilisant des systèmes de culture de tissu 3D pour créer artificielles capillaires, utilisant la technologie de l’orgue-on-chip pour générer des dispositifs microfluidiques, ou utilisant les fibres creuses technologie53, 54 , 55. les capillaires artificiels, cependant, ont significativement plus grands diamètres (100 – 200 µm) que des capillaires de cerveau (3 – 7 µm). Par conséquent, les forces de cisaillement l’in vitro ne ressemblent pas entièrement à la situation in vivo . Ceci est abordé dans la microfluidique « blood-brain-barrier-on-a-chip », où les membranes artificielles forme « sang » et le « cerveau » compartiments et fluides sont pompés grâce à ces dispositifs de génération de forces de cisaillement microfluidique. De même, des cultures de cellules endothéliales dans différentes combinaisons avec les astrocytes et les cellules musculaires lisses vasculaires ont également été utilisés avec la technologie de fibres creuses pour recréer les paramètres rhéologiques présents sous in vivo des conditions56 , 57 , 58. Toutefois, on ignore comment ce modèle reflète les autres propriétés de la barrière hémato - encéphalique, tels que le transport, le métabolisme, de signalisation et d’autres. Ces modèles capillaire et puce artificiels ne conviennent pas pour le criblage à haut débit des médicaments, mais les cellules utilisées pour générer ces modèles sont également sujettes à modification durant la culture.
Tranches de cerveau gelé et fixe ou cerveau primitif des cultures de cellules endothéliales capillaires sont des modèles supplémentaires qui peuvent être utilisé pourétudier la microcirculation humaine5,59,60,61. Par exemple, immunohistochimie des tissus cérébraux fixe est utilisée pour déterminer la localisation des protéines et expression en bonne santé par rapport aux tissus malades.
En plus de modèles in vitro et de tranches de tissus capillaires du cerveau décrit ci-dessus, fraîchement isolées peuvent être utilisés pour étudier la fonction de barrière hémato - encéphalique. Limites de ce modèle capillaire isolé comprennent la difficulté pour obtenir des tissus du cerveau humain frais, absence d’astrocytes et les neurones et un processus relativement long isolement. Un avantage du modèle capillaires cérébraux isolés est que ce modèle ressemble beaucoup à la situation in vivo et, par conséquent, peut être utilisé pour caractériser la dysfonction et la fonction de barrière. Ce qui est important, il peut être également utilisé de discerner les mécanismes de signalisation à l’aide d’une multitude de tests et techniques moléculaires3,19,62,63.
Notre laboratoire a accès à ces deux tissus de cerveau humain frais et surgelés à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M)64. Dans ce contexte, les autopsies suivent un protocole standard, les cerveaux est obtenus en < 4 h et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Compte tenu de cet accès unique aux tissus du cerveau humain, nous avons établi et optimisé un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain qui se traduit par un rendement élevé des capillaires de cerveau humain intact et viables. Deux points de terminaison communes d’intérêt sont à déterminer l’expression de la protéine et l’activité. À cet égard, nous et autres avons établi divers tests qui peuvent être utilisés avec les capillaires cérébraux isolés pour étudier l’expression des protéines et des niveaux d’activité. Ces essais incluent Éponger occidental, dosage Simple Western, immuno enzymatique (ELISA), chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR), PCR quantitative (qPCR), zymographie, tests d’activité de transport, et essais de fuite capillaire. Ces tests permettent aux chercheurs d’étudier des changements en fonction de la barrière dans des conditions pathologiques humaines, déterminer les voies qui régissent l’activité et l’expression de la protéine et identifier les cibles pharmacologiques pour le traitement de la barrière hémato - encéphalique associé maladies.
Prises ensemble, fraîchement capillaires cérébraux isolés peuvent servir de modèle robuste et reproductible de la barrière hémato - encéphalique. Surtout, ce modèle peut être associé à plusieurs différents dosages pour déterminer un large éventail de points de terminaison pour étudier la fonction de barrière.

<table><tbody>Gants en latex <tr><td>Équipement de protection individuelle (EPI)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td>EPI</td></tr><tr><td>Blouses de protection jetables</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>470146-214</td><td>EPI ; en raison de la nature du matériel d’origine humaine, l’utilisation d’une blouse de laboratoire jetable est recommandée</td></tr><tr><td>Écran facial, jetable</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis</td><td>19460102</td><td>EPI ; en raison de la nature du matériel d’origine humaine, l’utilisation d’un écran facial jetable est recommandée</td></tr><tr><td>Matériaux</td><td></td><td></td><td></td>de sécurité</tr><tr><td>Clavies Sacs autoclave haute température 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Papier d’établi sec 18 » x 20 »</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>14-206-32</td><td>pour couvrir les zones de travail</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75800-272</td><td>pour scalpels usagés</td></tr><tr><td>Bleach 8.2 % Clorox Germicide 64 oz.</td><td>Centre d’approvisionnement du Royaume-Uni, Lexington, KY, États-Unis</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg ; C Réfrigérateur</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-Unis</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 PH-mètre</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-Unis</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL,</td><td>États-Unis 501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall LEGEND XTR</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-Unis</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection Leica L2</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, États-Unis</td><td></td><td>utilisé pour enlever les méninges</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogénéisateur</td><td>Kinematica AG, Lucerne, Suisse</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Échelle P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, États-Unis</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Mini Stir standard</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-Unis</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>utilisé pour congeler le tissu ?</td></tr><tr><td>Balance analytique Voyager Pro</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, États-Unis</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, États-Unis</td><td></td><td>utilisé pour vérifier les capillaires isolés</td></tr><tr><td>Tools and Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377823T1</td><td>laver les capillaires filtre</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 100-1 000 & micro ; L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377821T1</td><td>réapprovisionner les granulés en BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, USA</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Scalpel Blades</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>S95938C</td><td>hacher le tissu cérébral</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>52858-000</td><td>pour couvrir le bécher et la fiole jaugée</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21-377-304</td><td>pour laver les capillaires du filtre</td></tr><tr><td>Seringue de 60 mL avec Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>BD309653</td><td>utilisé avec bague de connexion pour filtrer les capillaires</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10060-13</td><td>utilisé pour hacher</td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11251-10</td><td>utilisé pour enlever les méninges</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>3431E25</td><td>Volume de 50 ml, dégagement : 150-230 &mu ; m</td></tr><tr><td>Dounce Homogénéisateur</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>Volume de 15 mL, dégagement : 80-130 &mu ; m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 & micro ; m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td><td>146424</td><td>Utilisé pour filtrer la suspension capillaire afin d’éliminer les méninges qui peuvent être laissées</td></tr><tr><td>par les pluriStrainers (taille des pores : 30 & micro ; m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Allemagne</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Anneau de connexion</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Allemagne</td><td>41-50000-03</td><td>réutiliser plusieurs fois</td></tr><tr><td>1 L Fiole</td><td></td><td></td> jaugée <td>pour la préparation du tampon d’isolement</td></tr><tr><td>1 L Bécher</td><td></td><td></td><td>pour la préparation de la barre</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>d’agitation BSA à 1 %pour la préparation de 1 % de BSA et de Ficoll&reg ; </td></tr><tr><td>Schott Bouteille (60 mL)</td><td></td><td></td><td>pour la préparation de Ficoll&reg ; Seau de Pétri </td></tr><tr><td>Ice</td> pour <td>garder tout froid</td>Boîte de Pétri de 100 mm pour le hachage du tissu cérébral Racleur de cellules de culture tissulaire VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 pour éliminer le surnageant après centrifugationChemicalsBSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St.<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Louis, MO, États-Unis</td><td>A9647-500g</td><td>préparer en DPBS avec Ca2+ & Mg2+ la veille. Évitez les bulles pendant la préparation. Conserver au réfrigérateur. Remuez lentement pendant 10 min avant utilisation.</td></tr><tr><td>DPBS avec Ca2+ & Mg2+</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - fait partie du tampon d’isolement</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>Une mesure précise est importante ici. Peser en bouteille avec agitateur. Agitez vigoureusement après avoir ajouté DPBS. Conserver au réfrigérateur O/N. Le temps sera dégagé dans la matinée. Remuez doucement pendant 10-15 min avant utilisation. Garder sur la glace jusqu’à utilisation.</td></tr><tr><td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G7528</td><td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration : 5 mM</td></tr> de <tr><td>solution étalon d’hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>71474</td><td>pour ajuster le pH du DPBS</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2256</td><td>Concentration : 1 mM</td></tr></tbody></table>

isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Comprendre la fonction de barrière hémato - encéphalique dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est essentielle pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques qui tiennent la promesse d’améliorer la livraison de drogue cerveau, améliorer la protection du cerveau et traiter le cerveau les troubles. Cependant, il est difficile d’étudier la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ainsi, il y a un besoin crucial pour les modèles appropriés. À cet égard, capillaires de cerveau isolés à partir des tissus cérébraux humains représentent un outil unique pour étudier la fonction de barrière comme proche de la situation humaine in vivo que possible. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du tissu de cerveau humain à un rendement élevé et avec une pureté et une qualité constante. Capillaires sont isolés du tissu de cerveau humain frais utilisant la filtration, centrifugation de gradient de densité et homogénéisation mécanique. Après l’isolement, les capillaires du cerveau humain peuvent être utilisés pour diverses applications, notamment les tests de fuite, l’imagerie de cellules vivantes et analyses immunitaire pour étudier l’expression des protéines et la fonction, l’activité enzymatique ou signalisation intracellulaire. Cerveau humain isolé capillaires sont un modèle unique d’élucider la régulation de la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ce modèle peut donner un aperçu de la pathogenèse du système nerveux central (SNC), qui contribuera à l’élaboration de stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles du SNC.

L’isolement des tissus cérébraux humains produire une suspension enrichie dans des capillaires de cerveau humain (Figure 1 b) avec de petites quantités de gros navires, globules rouges, autres cellules individuelles et quelques débris cellulaires. Certains capillaires sont ramifiés, et, dans certains cas, les globules rouges sont pris au piège dans les lumières du capillaires. Le capillaire typique a un 3 – 7 µm de diamètre et est environ 100 à 200 µm long av...

Capillaires cérébraux isolés du tissu de cerveau humain peuvent servir comme un modèle préclinique pour étudier la fonction de barrière dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous présentons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain frais.

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la barrière hémato-encéphalique, telles que le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique, les fuites de barrière et les voies de signalisation spécifiques à la barrière hémato-encéphalique humaine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’étudier des capillaires cérébraux humains intacts et physiologiquement actifs qui ont été isolés de tissu cérébral humain frais. Pour commencer cette procédure, documentez le poids du tissu cérébral humain, qui doit être d’environ 10 grammes.Au microscope, retirez soigneusement toutes les méninges à l’aide d’une pince et coupez la substance blanche à l’aide d’un scalpel. Ensuite, coupez soigneusement le tissu cérébral et hachez-le avec un scalpel pendant environ cinq minutes. Transférez le tissu cérébral dans le broyeur de tissus et ajoutez 30 millilitres de tampon d’isolement.Par la suite, homogénéisez chaque échantillon avec 100 coups à 50 tr/min. Ne remuez pas l’air pour éviter les bulles. Documentez le temps tous les 25 coups et le temps total nécessaire pour 100 coups.Ensuite, transférez l’homogénat dans un homogénéisateur Dounce sur glace. Homogénéiser la suspension pendant environ 20 coups et éviter les bulles. Ensuite, répartissez uniformément l’homogénat du cerveau dans quatre tubes de centrifugation de 50 millilitres.Et documenter le volume total de l’homogénat. Assurez-vous d’ajouter le bon volume de Ficoll. Trop peu ou trop de Ficoll entraînera une densité incorrecte pour séparer les capillaires des débris cellulaires et réduira ainsi la palette capillaire et limitera le rendement.Utilisez 10 millilitres de tampon d’isolement pour rincer le pilon et l’homogénéisateur et répartissez-le dans les quatre tubes de centrifugation. Ensuite, distribuez 50 millilitres de tampon de gradient de densité dans les tubes de centrifugation. Fermez hermétiquement les tubes de centrifugation avec des bouchons.Ensuite, mélangez l’homogénat, le milieu à gradient de densité et le tampon en secouant vigoureusement les tubes. Centrifugeuse à 5, 800 fois la gravité pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Par la suite, jetez le surnageant et remettez en suspension chaque pastille dans deux millilitres de BSA à 1 %.Après avoir remis le granulé en suspension, filtrez la suspension à travers la maille de 300 micromètres. Les capillaires sont filtrés à travers le maillage, tandis que les vaisseaux plus gros et les débris cérébraux plus gros restent sur le treillis. Lavez soigneusement la maille avec jusqu’à 50 millilitres de 1 % BSA.Jetez ensuite le grillage. Pour séparer les capillaires des globules rouges et autres débris cérébraux, répartissez le filtrat capillaire sur cinq filtres de déformation cellulaire de 30 micromètres. Les capillaires sont retenus par ce filtre, tandis que les globules rouges, les autres cellules uniques et les petits débris cérébraux passent à travers le filtre et sont collectés dans le filtrat.Lavez ensuite chaque filtre avec 25 millilitres de BSA à 1 %. Versez tous les filtrats sur le sixième filtre pour augmenter le rendement. Lavez chaque filtre avec 50 millilitres de BSA à 1 %.Conservez les filtres de déformation cellulaire contenant les capillaires et jetez le filtrat. Ensuite, retournez les filtres et lavez les capillaires avec 50 millilitres de 1 % BSA dans des tubes de 50 millilitres. Appliquez doucement une pression avec la pointe de la pipette et déplacez-la sur le filtre pour éliminer les capillaires cérébraux.Assurez-vous de laver tous les capillaires cérébraux, en particulier du bord du filtre. Évitez les bulles, car cela rend le processus de filtration plus difficile et augmente le risque de perte capillaire. Après avoir collecté les capillaires, centrifugez tous les échantillons à 1 500 fois la gravité pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans environ trois millilitres de tampon d’isolement. Ensuite, combinez toutes les pastilles remises en suspension d’un échantillon dans un tube conique de 15 millilitres et remplissez-le d’un tampon d’isolement. Centrifugez à nouveau à 1 500 fois la gravité pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et lavez deux fois de plus.Documentez la pureté capillaire avec un microscope à un grossissement de 100 fois et une caméra. Les capillaires cérébraux isolés peuvent maintenant être utilisés pour des expériences, traités ou être congelés et stockés à moins 80 degrés Celsius dans des cryotubes pendant au moins six à 12 mois. Cette figure montre une image représentative en lumière transmise d’un capillaire cérébral humain avec un péricyte attaché et un globule rouge dans la lumière.Le capillaire cérébral humain isolé a été immunocoloré pour le PGP en utilisant le C219 comme anticorps primaire et les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’éviter la perte de capillaires lors des étapes de pipetage et de filtration pour assurer un bon rendement capillaire. À la suite de cette procédure, des capillaires cérébraux humains isolés peuvent être utilisés pour un large éventail d’études telles que des études pharmacologiques et physiologiques, ainsi que des études génomiques, protéomiques et cellomiques.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la barrière hémato-encéphalique pour étudier la fonction de barrière dans les capillaires cérébraux humains aussi près que possible de la situation humaine in vivo. N’oubliez pas que travailler avec du tissu cérébral humain présente un risque d’infection par des agents pathogènes transmissibles par le sang. Des précautions de sécurité doivent être prises, telles que le port d’une blouse de laboratoire, d’un écran facial et de gants, ainsi que la manipulation d’échantillons de tissus dans un cadre BSL-2 pendant l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Cette vidéo présente l’isolement des microvaisseaux d’un cerveau de rat à l’aide d’une combinaison de centrifugation à gradient de densité et de méthodes de digestion enzymatique. Les microvaisseaux isolés peuvent être cultivés dans un flacon de culture pré-enrobé de matrice de collagène et de fibronectine pour obtenir des colonies de cellules endothéliales.

Culture de cellules endothéliales à partir de microvaisseaux cérébraux de rat : une procédure pour isoler et cultiver des cellules endothéliales à partir de microvaisseaux de cerveau de rat

Dans cette vidéo, nous montrons la procédure d’isolement et de culture des péricytes à partir de capillaires cérébraux bovins sans contamination des cellules endothéliales.

Isolement et culture de péricytes cérébraux primaires : procédure d’isolement et de culture de péricytes à partir de capillaires cérébraux bovins sans contamination des cellules endothéliales

Cette vidéo présente l’isolement de capillaires cérébraux à partir d’un tissu cérébral humain frais. Les capillaires isolés peuvent ensuite être utilisés pour générer un modèle ex vivo de barrière hémato-encéphalique.

Isolement des capillaires cérébraux du cerveau humain : une méthode optimisée pour extraire les capillaires cérébraux du tissu cérébral humain

Cette vidéo démontre l'isolement des vaisseaux intacts du cerveau d'une souris qui constituent la barrière hémato-encéphalique (BHE) avec les neurones et les cellules gliales. Les vaisseaux isolés peuvent être utilisés comme modèle in vitro pour étudier leur rôle dans le maintien de l’homéostasie cérébrale.

Isolement des vaisseaux cérébraux de souris : un protocole pour isoler les vaisseaux intacts d’un échantillon de cerveau murin

Cette vidéo montre l’isolement des capillaires à partir de cerveaux porcins frais. Le processus consiste à éliminer les méninges, à isoler la matière grise du tissu cérébral, à homogénéiser et à filtrer la matière grise pour isoler les capillaires, et enfin à utiliser la digestion enzymatique pour purifier davantage les capillaires.

Purifier les capillaires d’un cerveau porcin

Cette vidéo montre le processus d’isolement des microvaisseaux cérébraux des rats euthanasiés. Il comprend la dissection du cerveau, le nettoyage des tissus et la digestion mécanique, suivie d’une centrifugation répétée pour isoler la fraction pure des microvaisseaux.

Procédé d’isolement d’unités neurovasculaires à partir du cerveau de rat

Nous décrivons un protocole permettant la purification du compartiment vasculaire du cerveau de la souris. Les vaisseaux cérébraux isolés comprennent des cellules endothéliales reliées par des jonctions serrées et entourées d’une lame basale continue, des péricytes, des cellules musculaires lisses vasculaires, ainsi que des membranes astrogliales périvasculaires.

Purification de souris vaisseaux cérébraux

Ce manuscrit décrit un protocole simple et reproductible pour l’isolement des artérioles intracérébrales (un groupe de vaisseaux sanguins englobant les artérioles parenchymateuses, les artérioles pénétrantes et les artérioles précapillaires) chez la souris, à utiliser dans la myographie de pression, l’immunofluorescence, la biochimie et les études moléculaires.

Isolement et Cannulation de parenchyme cérébral artérioles

Nous présentons un protocole pour l'extraction des péritéytes cérébraux murines. Basé sur une extraction de périyte orientée vers l'enrichissement sans antibiotiques, ce protocole est un outil précieux pour les études in vitro offrant une pureté élevée et un rendement élevé, diminuant ainsi le nombre d'animaux expérimentaux utilisés.

Une méthode de sortie élevée pour isoler les péricartétes cérébraux de la souris

Le présent manuscrit détaille comment isoler les artérioles et les capillaires hippocampiques du cerveau de la souris et comment les pressuriser pour la myographie sous pression, l'immunofluorescence, la biochimie et les études moléculaires.

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Préparation pour l'étude fonctionnelle

Les péricytes capillaires cérébraux sont des acteurs essentiels dans la régulation des propriétés de la barrière céphalo-cérébrale et du flux sanguin. Ce protocole décrit comment les péricytes capillaires cérébraux peuvent être isolés, cultivés, caractérisés en ce qui concerne le type de cellule et appliqués pour des investigations de signalisation intracellulaire de calcium avec des sondes fluorescentes.

Culture des péricytes capillaires cérébraux pour les mesures cytosoliques du calcium et les études d’imagerie calcique

Découvrez l'isolation de capillaires cérébraux humains à partir de tissu frais pour étudier la barrière hémato-encéphalique. Cette méthode permet d'analyser les voies de signalisation et la fonction barrière in vitro.

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

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