Une plate-forme microfluidique d’imagerie longitudinales chez Caenorhabditis elegans

L’objectif général de cette procédure est d’imager longitudinalement les processus dynamiques chez les nématodes adultes dans des conditions environnementales contrôlées pour le suivi des réponses comportementales des vers et de la cinétique de l’expression des gènes des vers. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les animaux s’adaptent aux changements de leur environnement, y compris les différences dans les comportements de base, l’expression des gènes, la mémoire et l’apprentissage. Cette technique permet l’observation longitudinale multiplexe d’individus dans des environnements contrôlés dynamiquement, ainsi que l’échantillonnage simultané de plusieurs aspects de l’adaptation à haute résolution.

L’implication de cette technique s’étend vers une compréhension quantitative de l’adaptation animale, car l’acquisition de données cinétiques de haute précision peut faciliter la modélisation mathématique et la formulation et le test d’hypothèses complexes. Pour configurer l’appareil pour la procédure, connectez d’abord l’embout de la seringue à un morceau de tube de seringue de 50 centimètres. Pour fabriquer une aiguille adaptatrice, utilisez une pince pour retirer la tige de l’aiguille du moyeu de l’aiguille d’une aiguille de calibre 20 par un demi-pouce et utilisez un bec Bunsen pour enlever les résidus de plastique restants.

En tenant les deux extrémités de l’aiguille à l’aide d’une pince, pliez l’aiguille adaptatrice selon la géométrie de la configuration expérimentale et branchez l’aiguille à mi-chemin dans l’autre extrémité du tube de sortie de la seringue. Ensuite, connectez un embout de seringue d’entrée de tampon directement à une vanne à trois voies et connectez une seringue d’entrée de tampon à un morceau de tube de seringue d’un mètre. En insérant l’aiguille de l’adaptateur à mi-chemin dans l’extrémité ouverte du tube, connectez la seringue d’échange de tampon à un morceau de tube de seringue de 50 centimètres via l’embout de la seringue.

Connectez le tube de la seringue à l’orifice restant de la vanne à trois voies et fermez la vanne. À l’aide d’une aiguille d’adaptation, connectez la seringue d’entrée de vis sans fin à un morceau de tube de seringue d’un mètre, comme cela vient d’être démontré. Ensuite, rincez tous les matériaux deux fois avec du S-medium et remplissez les seringues et les tubes rincés avec du S-medium frais, en prenant soin d’éliminer les bulles d’air.

Maintenant, connectez le tube de sortie de la seringue à la sortie de l’appareil et branchez l’aiguille de l’adaptateur à l’extrémité du tube de la seringue de sortie à l’orifice de sortie. Injectez un petit volume de S-medium par la sortie pour remplir l’appareil jusqu’à ce que le S-medium sorte à la fois du tampon et des entrées de ver. Connectez le tube de seringue d’entrée du tampon à l’orifice d’entrée du tampon de l’appareil et bouchez l’entrée de la vis sans fin avec une goupille en acier inoxydable d’un diamètre de trente-secondes de pouce.

Montez le dispositif microfluidique sur un microscope à fluorescence inversée avec une platine motorisée et fixez un pousse-seringue à un agitateur près du microscope afin que la pompe ne tremble pas pendant l’agitation. Ensuite, chargez la seringue d’entrée tampon sur la pompe à seringue et réglez la pompe pour fournir un débit continu de S-medium dans l’appareil à un débit de trois microlitres par minute. Pour charger les bactéries dans le dispositif microfluidique, chargez d’abord une nouvelle seringue avec une suspension haute densité d’E.coli OP50.

Tournez la seringue verticalement et tapotez le cylindre plusieurs fois pour recueillir toutes les bulles d’air en haut de la seringue. Éteignez l’agitateur orbital et fermez la vanne à trois voies des seringues d’entrée de tampon. Remplacez la seringue d’entrée du tampon par la seringue chargée de bactéries et expulsez tout l’air collecté en haut de la seringue jusqu’à ce qu’un peu de la suspension bactérienne pénètre dans le système d’échange de tampon et qu’il ne reste plus de bulles dans la seringue chargée d’OP50 ou la valve.

Avec la valve fermée, connectez la seringue chargée de bactéries à la pompe à seringue et allumez l’agitateur orbital. Réglez la vitesse d’agitation à environ 200 tr/min et le débit à 100 microlitres par minute. Une fois que le tampon OP50 s’est répandu dans tout l’appareil, réglez le débit à trois microlitres par minute.

Pour charger l’appareil de nématodes, remplissez d’abord un tube de micro-centrifugeuse à faible liaison de 650 microlitres avec 100 microlitres de suspension OP50 fraîche, et utilisez un pic à vis pour transférer individuellement 20 à 30 vers jeunes adultes synchronisés avec l’âge d’une plaque de gélose de milieu de croissance de nématode vers vers le tube. Remplissez la seringue d’entrée de vis sans fin et le tube de seringue avec une suspension OP50 fraîche et injectez environ 500 microlitres de suspension dans le tube de micro-centrifugeuse. Ensuite, aspirez la suspension de vis sans fin dans le tube de la seringue d’entrée de la vis sans fin et connectez la seringue d’entrée de la vis à l’entrée de la vis sans fin.

Injectez tous les vers à travers le tube de seringue d’entrée de vis sans fin dans le dispositif microfluidique et débranchez la seringue d’entrée de vis sans fin et le tube de seringue. Branchez l’entrée de la vis sans fin avec une goupille et débrayez la seringue d’entrée du tampon de la pompe mécanique. Utilisez la seringue d’entrée du tampon pour déplacer manuellement les vers dans les canaux, et la seringue de sortie pour inverser le mouvement de la vis sans fin si nécessaire.

Le chargement des animaux nécessite une certaine coordination. Utilisez des pressions douces sur les pistons de la seringue pour les aligner avec le canal et une poussée un peu plus forte pour enfoncer la vis sans fin jusqu’au bout. Ensuite, laissez les vers s’adapter à leur nouvel environnement pendant deux à trois heures avant de commencer une expérience.

Les vers sont confinés dans leurs canaux, mais ils ne sont pas immobilisés. La plupart des vers resteront dans leurs canaux pendant toute la durée de l’expérience, mais certains peuvent s’échapper ou s’emmêler dans les microfissures. Ici, des images en champ clair d’un seul ver représentatif sur une période de dix heures dans l’appareil peuvent être observées.

En utilisant des vers transgéniques qui expriment la GFP sous le gène de réponse immunitaire un promoteur, lors de l’infection par P. Aeruginosa, PA14, l’expression de la GFP est observée dans le milieu du corps et la queue du ver au cours des cinq premières heures d’exposition à l’agent pathogène, augmentant jusqu’à une expression robuste et complète du corps au cours des cinq heures suivantes. Le tracé de la fluorescence totale de chaque ver en fonction du temps post-infection illustre la dynamique de l’induction du gène un de la réponse immunitaire ainsi que la variabilité d’un ver à l’autre dans le moment et l’étendue de l’induction. L’imagerie en accéléré des œufs pondus par les vers dans chaque canal permet de tracer le nombre cumulé d’œufs pondus par chaque ver en fonction du temps post-infection et de saisir la variabilité d’un animal à l’autre ainsi que le déclin de la ponte induit par les agents pathogènes à mesure que l’infection progresse.

Une fois maîtrisé, le dispositif microfluidique peut être préparé et chargé en une heure. Une fois que le dispositif est chargé et que les vers sont acclimatés, d’autres réactifs tels que des médicaments spécifiques ou des signaux chimiques d’intérêt peuvent être livrés aux vers pour répondre à des questions supplémentaires sur le contrôle des systèmes neuronaux et génétiques des nématodes. Après son développement, nous et nos collaborateurs avons utilisé cette technique pour disséquer les comportements alimentaires des nématodes ainsi que les réponses génétiques des vers à l’infection par choc thermique et à la famine dans une variété d’environnements.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un appareil microfluidique pour réaliser des essais longitudinaux.