Optogenetic entraînement des Oscillations thêta hippocampique en comportement des souris

Nous décrivons l’utilisation des optogenetics et des enregistrements électrophysiologiques pour des manipulations sélectives des oscillations thêta hippocampique (5 à 10 Hz) chez les souris se comporter. L’efficacité de l’entraînement de rythme est contrôlée au moyen potentiel de champ local. Une combinaison d’opto - et pharmacogénétique inhibition adresses la lecture efférente de synchronisation hippocampe.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurophysiologie, telles que le rôle causal de l’oscillation thêta dans la navigation spéciale et les comportements associés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un contrôle en temps réel de la fréquence et de la régularité des oscillations thêta de l’hippocampe chez les souris au comportement précoce. La Dre Franziska Bender, une ancienne étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Commencez par la souris entièrement anesthésiée fixée dans le cadre stéréotaxique. Percez un trou au-dessus du septum médial. Immergez la pointe de l’aiguille d’injection dans une gouttelette de virus sur un morceau de film de paraffine et aspirez soigneusement le virus à environ 500 nanolitres par minute tout en observant le niveau du liquide.

Pour éviter que l’air ne pénètre dans l’aiguille d’injection, arrêtez le sevrage avant que le virus ne soit entièrement absorbé. Nettoyez l’aiguille avec un mouchoir en papier. Vérifiez que le virus et l’huile sont séparés par une bulle d’air et marquez le niveau du virus sur le tube.

Positionnez l’aiguille au-dessus de la craniotomie et insérez-la lentement dans le cerveau au premier point d’injection. Injecter 450 nanolitres du virus à raison de 100 à 150 nanolitres par minute. Après l’injection, attendez 10 minutes.

Après 10 minutes, déplacez soigneusement l’aiguille de 0,1 millimètre vers le haut et attendez encore cinq minutes. Utilisez une micro-décapeuse pour dénuder 125 micromètres de gaine d’une fibre optique multimode pendant que la fibre est toujours attachée à la bobine de fibre. Ensuite, utilisez un couteau diamanté pour couper la fibre à une longueur d’environ deux à trois centimètres.

Insérez la fibre optique dans une virole en céramique de zircone d’un diamètre interne de 126 microns. Environ 0,5 à un millimètre de la fibre doit dépasser du côté convexe de la virole. À l’aide d’une aiguille, appliquez une goutte de colle époxy aux deux extrémités de la virole, mais pas sur les côtés de la virole.

Après séchage, utilisez un film de polissage de fibre de rodage diamanté avec un grain de trois microns pour polir le côté convexe de la virole. Pour préparer le réseau de fils de tungstène, collez d’abord plusieurs guides de tube de silice de 100 microns sur le côté collant d’un morceau de ruban adhésif. Ensuite, à l’aide d’une pince, enfilez des fils de tungstène de 45 microns isolés dans les tubes de guidage.

Ensuite, utilisez un scalpel pour dénuder l’isolant des deux extrémités de six fils de liaison en cuivre fin isolés d’émail d’environ cinq millimètres de long. Dénudez ensuite l’isolant des deux extrémités d’un fil de mise à la terre d’environ deux à trois centimètres de long. Soudez chaque fil dénudé aux broches du nanoconnecteur.

Connectez chaque fil de liaison à un fil de tungstène à l’aide d’une goutte de peinture conductrice d’argent. Après séchage, appliquez une petite quantité de ciment pour couvrir les fils de cuivre. Évitez d’appliquer du ciment sur la partie supérieure du nanoconnecteur.

Après avoir laissé sécher le ciment pendant au moins 30 minutes, utilisez des ciseaux en acier inoxydable émoussés pour couper les fils de tungstène à un angle de cinq à 20 degrés. Commencez par percer quatre trous de 0,8 mm de diamètre dans le crâne propre de l’animal anesthésié. Percez deux trous rostrals jusqu’à la suture coronale et deux au-dessus du cervelet.

Ensuite, placez des vis à os en acier inoxydable pour la mise à la terre et la stabilisation de l’implant. Positionnez la vis de terre reliée à un fil de cuivre au-dessus du cervelet. Couvrez complètement la vis de terre avec du ciment pour éviter les artefacts musculaires pendant les enregistrements électrophysiologiques.

Construisez un anneau de ciment reliant toutes les vis. Effectuez une craniotomie au-dessus du site d’implantation, puis appliquez environ un microlitre de solution saline stérile à la surface du tissu cérébral. Utilisez la stéréotaxe pour abaisser lentement le réseau de fils dans la craniotomie.

Appliquez ensuite environ cinq microlitres de cire liquide chaude au-dessus du site d’implantation pour protéger le tissu cérébral. Appliquez du ciment autour du réseau de fils et recouvrez le crâne de ciment. Appliquez une goutte de flux sur le fil de terre pré-soudé ou le fil pré-soudé connecté à la vis de terre, et fusionnez les fils à l’aide d’une machine à souder.

Enfin, couvrez tout le fil de terre avec du ciment. Vérifiez le flux lumineux du cordon de raccordement. Si le taux de transmission de la fibre implantée était de 50 %, assurez-vous que le rendement lumineux à l’extrémité du cordon de raccordement est de 20 milliwatts.

Connectez le préamplificateur de l’étage de tête au connecteur implanté et connectez le cordon de raccordement à fibre optique à la fibre hippocampique implantée pour la stimulation optogénétique. Enregistrez le comportement de base pendant une durée appropriée aux paramètres mesurés. Ouvrez le logiciel pour contrôler le générateur de stimulus.

Cliquez sur fichier, ouvrez et sélectionnez le fichier de protocole de votre choix. Cliquez sur télécharger et lancez la stimulation lumineuse. Observez le contrôle du rythme thêta par les impulsions lumineuses.

Le potentiel de champ local de l’hippocampe lors des oscillations thêta spontanées est observé ici. Notez les enveloppes gamma, un indicateur du rythme thêta physiologique. Le potentiel de champ local de l’hippocampe à sept hertz pendant l’entraînement optogénétique est observé ici.

Les bandes bleues indiquent les fenêtres de temps d’application de la lumière. Notez la réinitialisation de phase par l’impulsion lumineuse indiquée ici par une flèche. Le potentiel de champ local de l’hippocampe à 10 hertz reflète l’entraînement optogénétique.

Notez que les enveloppes gamma à verrouillage de phase et l’inversion de phase entre les strathams oriens et le stratum radiatum sont également maintenues pendant l’entraînement. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures d’expérience, plus six semaines pour l’expression virale. Lors de la tentative de cette procédure, il est essentiel de se rappeler d’assurer une transduction virale efficace.

Connectez correctement l’implant de fibre optique au cordon de raccordement et obtenez une bonne qualité d’oscillations thêta spontanées de potentiel de champ local.