Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans

L’objectif global de ces méthodes de coloration est de quantifier l’abondance des lipides intracellulaires et d’évaluer la distribution des lipides entre différents tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le métabolisme des lipides, telles que la façon dont les lipides sont régulés génétiquement et biochimiquement et les états pathologiques qui régulent l’homéostasie des lipides. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et peu coûteuse à réaliser.

Pour effectuer la coloration lipidique du rouge du Nil, placez les vers sur un milieu de croissance de nématodes ou NGM ensemencé avec du log tardif OP50 E.coli et faites pousser les vers à 20 degrés Celsius jusqu’au stade L4 précoce. Lavez les vers avec un millimètre de solution PBST et transférez la suspension de vis sans fin dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre. Centrifugez les vers à 560 fois la gravité pendant une minute.

Retirez ensuite le surnageant et répétez le lavage PBST jusqu’à ce que E.coli soit éliminé de la suspension. Ensuite, à la pastille de ver, ajoutez 100 microlitres d’isopropanol à 40 % ou de 60 % pour la coloration ORO et incubez l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes. L’ajout d’isopropanol est crucial pour une bonne perméabilisation des vers avant la coloration.

Centrifugez les vers à 560 fois la gravité pendant une minute et retirez le surnageant sans perturber la pastille de ver. Il est important de minimiser l’exposition à la lumière pendant les étapes de centrifugation. Maintenant, dans l’obscurité, ajoutez 600 microlitres de solution de travail NR préalablement préparée à chaque échantillon.

Retournez les tubes trois fois et mélangez complètement les vers et la solution. Ensuite, incubez l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures. Après l’incubation, centrifugez les vers et retirez le surnageant.

Ajoutez ensuite 600 microlitres de PBST et incubez les échantillons dans l’obscurité pendant 30 minutes pour éliminer l’excès de coloration NR. Après avoir retourné les échantillons comme précédemment, retirez tous les microlitres de surnageant, à l’exception d’environ 50 microlitres, et remettez la pastille de ver en suspension dans la solution restante. Pour préparer les lames pour l’imagerie, pipetez cinq microlitres de suspension de vers sur une lame de microscope et appliquez soigneusement une lamelle pour éviter de piéger les bulles d’air.

En utilisant le canal GFP FITC pour imager les vers colorés NR et en essayant différents temps d’exposition, imagez les vers à un grossissement quintuple pour capturer plusieurs animaux par champ de vision. Passez ensuite à un grossissement de 10 fois pour une meilleure quantification des vers individuels. Pour quantifier les images, téléchargez les micrographies sur ImageJ.

Dans le menu déroulant de l’image, ajustez la luminosité, le contraste de la palette d’images et propagez les modifications à toutes les images en cliquant sur Appliquer. Utilisez l’outil de sélection de polygones pour délimiter chaque ver imagé et, dans le menu déroulant d’analyse, utilisez la fonction de mesure pour qualifier l’intensité de fluorescence émise par NR. Pour chaque image, mesurez cinq emplacements d’arrière-plan et calculez l’intensité moyenne de la fluorescence d’arrière-plan. Ajoutez 600 microlitres de solution de travail Oil Red O ou ORO à chaque échantillon et retournez le tube trois fois pour bien mélanger les vers et l’ORO.

Faites tourner les échantillons à 30 tr/min et RT pendant deux heures. Centrifuger les échantillons à 560 fois la gravité pendant une minute et aspirer tout le surnageant à l’exception de 100 microlitres. Utilisez ensuite 600 microlitres de PBST pour remettre les échantillons en suspension et faites pivoter les tubes à 30 tr/min pendant 30 minutes pour éliminer l’excès de coloration ORO.

Pour mieux distinguer l’emplacement de la lignée germinale de l’animal dans les cellules intestinales, colorez les noyaux en ajoutant un microlitre de DAPI pour chaque millilitre de solution de travail ORO. Ensuite, pour préparer les lames pour l’imagerie, remettez en suspension les vers et le surnageant restant et mélangez bien la solution. Mettez cinq microlitres de suspension de vers sur une lame de microscope et appliquez soigneusement une lamelle en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne se forme.

Pour imager les vers colorés à l’ORO, utilisez une caméra couleur à un grossissement cinq fois pour imager plusieurs vers dans un seul champ de vision. Passez ensuite à un grossissement de 10 fois pour un meilleur examen des vers individuels. Enfin, après avoir téléchargé les images sur ImageJ et créé un jeu d’images selon le protocole texte, classez les images en fonction de l’accumulation de lipides dans tout le corps de l’animal ou dans des tissus spécifiques.

SKN-1 partage une homologie avec Nrf2 chez les mammifères et il a été démontré qu’il médie l’oxydation des acides gras. Cette figure montre des animaux SKN-1 activés exposés à des conditions qui entraînent une augmentation des taux de lipides. Comme on le voit sur ces images, la fluorescence NR capturée à l’aide du canal FITC GFP est proéminente le long de l’intestin, mais est plus faible dans la tête, la queue et la lumière intestinale.

Bien qu’il soit facile de catégoriser les vers en fonction de la présence ou de l’absence de déplétion somatique des graisses en fonction de l’âge, il peut être difficile d’identifier les animaux présentant une perte de graisse intermédiaire. Comparés aux animaux non ASDF, qui présentent des taches rouge vif dans tout le corps avec peu de zones translucides, les vers ASDF présentent une appauvrissement notable des graisses dans les cellules intestinales. Les animaux en cours de développement de l’ASDF présentent souvent des points translucides où la majeure partie de la perte de graisse finit par se produire.

De plus, les vers ASDF peuvent encore présenter des taches rouge vif dans les régions de la tête et de la queue, car le phénotype n’est pas défini par une perte complète de graisse somatique, mais par un épuisement important des graisses par rapport aux animaux non âgés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures plus le temps d’imagerie si elle est correctement réalisée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de laver et de perméabiliser les vers pas plus de 30 minutes avant la coloration.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie CARS peuvent être effectuées pour comparer le type d’espèces lipidiques identifiées par chaque technologie et pour déterminer quelle méthode est la mieux adaptée à des types de questions spécifiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier les lipides et d’évaluer la distribution des lipides chez les vers à l’aide de la coloration au rouge du Nil et au rouge huile O, suivie d’une analyse par micrographie ImageJ.