Name: Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez la coloration au rouge du Nil et à l'huile rouge O pour quantifier les lipides et évaluer leur distribution chez Caenorhabditis elegans. Cette méthode simple permet d'étudier le métabolisme lipidique.

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Ce travail a été rendu possible par l’octroi de NIH : R01GM109028 (S.P.C.)

1. Nil rouge (NR) coloration des lipides
<ol><li>Préparation de la solution mère de 5 mg/mL, NR<ol>
<li>Dans une bouteille de 500 mL, ajouter 100 mg de poudre de NR à 200 mL d’acétone 100 %.</li>
		<li>Couvrir la bouteille avec du papier aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.</li>
		<li>Avant utilisation, agiter la solution pendant 2 h dans l’obscurité.</li>
		<li>Pour utilisation à long terme, conserver la solution mère NR dans un flacon hermétique sans toute exposition à la lumière. Solution mère NR selon les besoins de recherche à l’échelle. Veiller à ce que la même solution est utilisée à travers des expériences de coloration NR pour obtenir la coloration uniforme et les résultats d’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la solution de travail NR<ol>
<li>Pour chaque 1 mL d’isopropanol 40 % (v/v), ajouter 6 µL de la solution mère de NR.</li>
		<li>Préparez 600 µL de solution de travail NR pour chaque échantillon. Remarque : Assurez-vous de frais NR droit de solution de travail avant la coloration. Selon les besoins de solution mère de NR, utiliser un 15 mL ou tube à fond conique jaugée de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation vers pour la coloration des lipides NR<ol>
<li>Poussent au stade précoce de L4 à 20 ° C sur un milieu de croissance nématode (NGM) ensemencée avec fin-log OP50 e. coli.</li>
		<li>Laver les vers la plaque avec 1 mL de 1 x 0,01 % Triton X-100 (PBST) solution de tampon phosphate salin + et mettre la suspension ver dans un tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifuger que les vers à 560 x g pendant 1 min. Retirer le surnageant et répétez cette étape jusqu'à ce qu’e. coli est effacée de suspension.</li>
		<li>Ajouter 100 µL d’isopropanol 40 % dans le culot de ver et il incuber à température ambiante pendant 3 min.</li>
		<li>Centrifuger les vers à 560 x g pendant 1 min et retirer le surnageant sans déranger le culot de ver. NOTE : Utilisation des volumes importants de PBST pour laver les vers les plaques si à l’aide de plaques plus grandes ou plus de parasites par plaque de coloration. Ne pas laver les vers dans le PBST de plus de 15 min avant la fixation de l’échantillon. Effectuer de nouveaux lavages si le liquide surnageant ne s’efface pas de bactéries. Réaliser l’incubation dans l’isopropanol 40 % à l’aide d’un nutator ou bascule. Toujours surveiller les tubes pour s’assurer que l’agitation de l’échantillon complet se produit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipides de coloration avec NR<ol>
<li>Dans l’obscurité, ajoute 600 µL de solution de travail NR de chaque échantillon. Inverser les tubes trois fois et mélanger complètement les vers dans la solution NR.</li>
		<li>Faire tourner l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 h.</li>
		<li>Après l’incubation, centrifuger les vers à 560 x g pendant 1 min et retirer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 600 µL de PBST et incuber les échantillons dans l’obscurité pendant 30 min enlever excès NR tache.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 560 x g pendant 1 min et retirer tout sauf environ 50 µL de liquide surnageant. Remarque : L’incubation NR ne requiert pas d’agitation. Décantation de worms est fréquente au cours de cette étape.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des lames pour l’imagerie de microscope<ol>
<li>Resuspendre le culot de ver en restant surnageant.</li>
		<li>Déposer 5 µL de suspension de ver sur une lame de microscope et mettre une lamelle soigneusement à ne pas emprisonner de bulles d’air.</li>
		<li>Scellez la lamelle avec vernis à ongles avant vers l’imagerie.</li>
		<li>Préparez que quelques diapositives à la fois. Ceci assurera que l’imagerie NR reste constante dans les trois échantillons. La qualité des images colorés NR diminue après des gouttelettes de lipides discrète 6 h. sont difficiles à observer et augmente la fluorescence de fond, qui interfère avec la détection du signal NR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagerie vers colorés NR<ol>
<li>Les vers grossissement 5 X pour capturer plusieurs animaux par champ de vision de l’image.</li>
		<li>Passer à un grossissement de 10 X pour mieux quantifier les worms individuels.</li>
		<li>Canal FITC/GFP permet d’image vers colorés NR et essayer le temps d’exposition différents afin de déterminer les conditions optimales pour la quantification.</li>
		<li>Enregistrer les fichiers en format TIF pour éviter toute perte de données due à la compression. NOTE : Exposition typique fois varient de Mme 100-1000 ayant un temps de pose optimale, utilisez-le pour tous les échantillons pour maintenir la cohérence d’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantification d’image coloration NR<ol>
<li>Télécharger les micrographies sur ImageJ. Dans le menu déroulant Plugins, utilisez la fonction de Bio-Formats si le fichier image n’est pas reconnu.</li>
		<li>Dans le menu déroulant Image, la fonction Stacks, utilisez des Images-de-pile pour créer une pile d’image lorsqu’on compare les micrographies plusieurs.</li>
		<li>Dans le même menu déroulant, régler la luminosité/contraste de la pile de l’image et propager les modifications à toutes les images en cliquant sur Apply.</li>
		<li>Utiliser l’outil de sélection polygone pour délimiter chaque ver imagé et utiliser la fonction de mesure sous le menu déroulant de l’analyse pour quantifier l’intensité de la fluorescence émise par NR.</li>
		<li>Pour chaque image, mesurer cinq emplacements de fond et calculer l’intensité de fluorescence de fond moyenne.</li>
		<li>Soustraire l’intensité de fluorescence de fond de chaque ver imagé à l’aide de la formule N = G - (A x B), où N représente la fluorescence nette, G pour fluorescence brut, A pour superficie totale ver et B pour la fluorescence de fond moyenne.</li>
		<li>Pour normaliser l’intensité de la fluorescence de la taille de la vis sans fin, diviser la fluorescence nette de chaque ver par sa superficie. Les résultats sont signalés comme l’intensité de la fluorescence, en unités arbitraires (UA), par pixel. Remarque : Évitez d’exportation des images au format JPEG. Alors que la compression rend les fichiers plus facile à gérer pour stocker, l’intégrité des données est compromise par ce format. S’assurer que toutes les images sont modifiées et analysées de manière identique. N’oubliez pas d’inclure une échelle graphique pour évaluer correctement la taille à différents grossissements. Pour mieux visualiser les différences dans l’intensité de la fluorescence à l’aide de ImageJ, changer le type d’image RVB 8 bits et sélectionnez Fire dans le menu image lookup tables (LUT). Cela crée une image de carte thermique chez quelle couleur accrue luminosité est corrélée avec l’intensité de la fluorescence accrue.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. huile rouge O coloration (ORO) des lipides
<ol><li>Préparation de la solution mère de ORO<ol>
<li>Dans un flacon de 250 mL, ajouter 500 mg de poudre de ORO à 100 mL d’isopropanol 100 % et mélanger bien.</li>
		<li>Une fois préparée, conserver la solution hermétiquement fermée avec aucune exposition à la lumière.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la solution de travail ORO<ol>
<li>Diluer la solution mère de ORO dans l’eau (3:2) à 60 % isopropanol.</li>
		<li>Avant utilisation, filtrer la solution d’ORO à travers un filtre de seringue stérile d’acétate de cellulose 0,2 µm. Remarque : Pour une qualité de solution optimale, préparer ORO solution la veille et laissez-le mélanger du jour au lendemain. Toutefois, si la solution est nécessaire même jour, diluer et mélanger ORO solution sur un balancier pendant au moins 2 h avant utilisation. Avant bascule, enrouler le tube conique en ruban de paraffine pour éviter toute fuite de solution d’ORO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation vers pour la coloration des lipides ORO<ol>
<li>Cultiver les vers à 20 ° C sur un milieu de croissance nématode (NGM) ensemencé avec fin-log OP50 e. coli à l’étape de vie souhaité.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de solution PBST à la plaque et agiter jusqu'à ce que tous les vers sont la plaque. Inclinaison de la plaque et le laver avec 1 mL de PBST. Transférer la suspension ver dans un tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifuger que les vers à 560 x g pendant 1 min. Retirer le surnageant sans déranger le culot et répéter l’étape de la laver avec 1 mL de PBST trois fois. Supprimer tous les µL surnageant mais 100.</li>
		<li>Ajouter 600 µL d’isopropanol 40 % dans le culot de ver et bougez-le à température ambiante pendant 3 min.</li>
		<li>Centrifuger les vers à 560 x g pendant 30 s et supprimer tout surnageant mais 100 µL sans perturber le culot à vis sans fin. Remarque : Utiliser des volumes importants de PBST pour laver vers plaques si faire une coloration haut débit. Ne pas laver les vers dans le PBST de plus de 15 min avant la fixation de l’échantillon. Faire des nouveaux lavages si surnageant ne s’efface pas de bactéries. Effectuer d’incubation dans l’isopropanol 40 % à l’aide d’un nutator ou bascule. Toujours surveiller les tubes pour s’assurer que l’agitation de l’échantillon complet se produit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipides, coloration avec ORO<ol>
<li>Ajouter 600 µL de solution de travail ORO à chaque échantillon. Renverser le tube trois fois et mélanger les vers bien à ORO.</li>
		<li>Faire pivoter les échantillons à 30 tr/min pendant 2 h à température ambiante.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 560 x g pendant 1 min et éliminer tous les µL surnageant mais 100.</li>
		<li>Remettre en suspension les échantillons dans 600 µL de PBST et tourner les tubes à 30 tr/min pendant 30 min enlever tache ORO excédentaire.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 560 x g pendant 1 min et éliminer tout sauf 50 µL de liquide surnageant.</li>
		<li>Pour mieux distinguer l’emplacement des cellules germinales et les cellules intestinales de l’animal, détachant les noyaux en ajoutant 1 µL de (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indole-6-carboxamidine) (DAPI) pour chaque 1 mL de solution d’ORO. Effectuer de ORO coloration pendant 2 h avec l’ajout de DAPI avant le montage de diapositives pour l’imagerie. Noyaux intestinaux sont plus grands dans la taille et la gonade se distingue par les développement des cellules germinales. NOTE : Après ORO coloration, vers peuvent adhérer aux parois du tube à centrifuger et ne parviennent pas à former une boulette notable. Dans ce cas, centrifuger les vers à nouveau ou permettre à worms se contenter par gravité d’au moins 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des lames pour le ver d’imagerie<ol>
<li>Remettre en suspension les vers dans le surnageant restant et bien mélanger la solution.</li>
		<li>Mettre 5 µL de suspension de ver sur une lame de microscope et placez un lamelle couvre-objet avec précaution, s’assurer qu’aucun air bulles se forment.</li>
		<li>Sceller la lamelle avec vernis à ongles et les vers l’image. Remarque : Après fixation et coloration, les vers peuvent être très rigide et difficile à pipeter. Pour contourner cela, faire des pipettes d’échelle-alésage en coupant leurs conseils.</li>
		<li>Stocker les diapositives dans un rack de micro-centrifuger à 4 ° C pendant 24 h, si ne pas d’imagerie immédiatement après la coloration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagerie de worms colorés à l’ORO<ol>
<li>Utiliser une caméra couleur capacité à worms ORO teinté en image.</li>
		<li>Grossissement de X 5 permet d’image plusieurs vers un champ de vision.</li>
		<li>Passer à un grossissement de 10 X pour le meilleur examen de worms individuels.</li>
		<li>Exporter des images au format TIF pour éviter la perte de données due à la compression. Remarque : Si la coloration avec ORO + DAPI, basculez la caméra couleur compatible à celui qui peut capturer la fluorescence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse d’images de worms colorés à l’ORO<ol>
<li>Télécharger micrograph(s) sur ImageJ. Dans le menu déroulant Plugins, utilisez la fonction de Bio-Formats si le fichier image n’est pas reconnu.</li>
		<li>Dans le menu déroulant Image, la fonction Stacks, utilisez des Images-de-pile pour créer une pile d’image lorsqu’on compare les micrographies plusieurs.</li>
		<li>Régler la luminosité/contraste sous le même menu déroulant afin d’améliorer la visibilité des gouttelettes lipidiques.</li>
		<li>Classer les images selon l’accumulation de lipides dans le corps de l’animal ou dans des tissus spécifiques.</li>
		<li>Pour une meilleure évaluation de la localisation de lipide et d’identification des artefacts d’image non spécifique à l’aide de ImageJ, sélectionner la fonction de la couleur dans le menu déroulant de Image et cliquez sur la pile en RVB pour montrer les signaux de chacune des composantes RVB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

L’augmentation de l’obésité et les taux de maladies métaboliques rend c. elegans , un modèle approprié pour étudier les mécanismes qui régulent l’accumulation de graisses dans les cellules et les tissus. Des preuves récentes suggèrent que les changements dans les taux de lipides sont corrélés avec des processus cellulaires, allant de l’insuline signalisation8, l’activation des récepteurs hormone2, à la capacité reproductrice5. Par rapport à ...

Les lipides sont essentiels à la vie. Ils font partie intégrante des membranes, agissent comme des messagers secondaires et transducteurs de signal et ont des fonctions cruciales dans le stockage de l’énergie. Lorsque le métabolisme des lipides est dysrégulation, elle conduit à des maladies comme l’obésité et le diabète de type II, qui sont en appuyant sur les préoccupations de santé publique9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme excellent modèle pour l’étude du métabolisme lipidique, parce qu’il a un cycle de vie relativement court, un corps transparent, une lignée de cellules connues et un génome entièrement séquencé. Principalement un hermaphrodite, c. elegans permet aux chercheurs de soulever un grand nombre d’animaux isogéniques bref une période à haut débit effectuer avancer écrans génétiques pour étudier un large éventail de gènes et les voies métaboliques4. Cette approche a révélé un haut degré de conservation en 273 gènes du métabolisme lipidique de c. elegans parmi les humains, les souris, les rats et les drosophiles. En outre, plus de 300 gènes de lipides chez c. elegans ont des orthologues humains qui sont associés à des maladies non liées au syndrome métabolique,11. Traditionnellement, examen de stockage lipidique chez c. elegans a principalement invoqué essais marqués au colorant, qui fournissent des renseignements solides sur l’accumulation de lipides. Moins fréquent est une description de localiser où les lipides et les différences mesurées en abondance de lipides dans les tissus. Cependant, des travaux récents ont révélé que distribution des lipides peut être aussi importante que l’accumulation de lipides6.
Dernièrement, des études ont commencé à intégrer des méthodes telles que haute performance liquid chromatography-spectrométrie de masse (HPLC-MS), chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), et cohérente anti-stokes la microscopie Raman diffusion (voitures) à l’adresse du lacunes des approches axées sur la tache en analysant directement le contenu des extraits lipidiques, fractions lipidiques spécifiques et les dépôts de lipides, respectivement10,11. En outre, la microscopie de voitures a révélé que rouge Nil seulement peut servir de proxy pour une accumulation de graisse lorsqu’il est utilisé comme teinture fixateur, pour son utilisation comme un colorant vital conduit à hors-cible la coloration des organites auto-fluorescent10. Toutefois, les compétences techniques requises et les coûts associés à ces chromatographie et méthodes de microscopie font leur utilisation intenable pour plusieurs questions de recherche. Dans cet article, nous discutons une méthode pratique et fiable pour fixer et tacher les dépôts de lipides neutres à l’aide du Nil rouge de c. elegans et huile rouge O pour distinguer l’abondance de lipides chez l’animal entier et dans des tissus spécifiques.
Rouge de Nil, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, est un colorant benzophenoxazone facilement, se dissout dans les solvants organiques divers, mais est le plus souvent insoluble dans l’eau. C’est un excellent lysochrome colorant utilisé pour colorer les lipides neutres tels les triglycérides ou des esters de cholestérol parce qu’il dispose d’une couleur forte, solubilise bien dans les lipides, a interaction négligeable avec les tissus environnants et est moins solubles dans le solvant que dans lipides. Il a un maximum d’excitation et d’émission de 450-500 et 520 nm, respectivement1. Nil colorées au rouge c. elegans est vu pour la fluorescence verte, corps lipidiques discrètes peuvent être observés tout au long de l’intestin et d’autres tissus soit en grappes ou réparties, selon le génotype de l’animal ou de traitement expérimental 7.
L’huile rouge O est un lysochrome, un colorant soluble dans la graisse utilisée pour colorer les triglycérides et lipoprotéines. On l’appelle un colorant azoïque parce que sa structure chimique contient deux groupes azoïques attachés à trois noyaux aromatiques. Il est difficile de s’ioniser, qui le rend très soluble dans les lipides. Sa tache de couleur est rouge et son absorption maximale de la lumière est 518 nm 3. C. elegans colorées avec de l’huile rouge O montrent des gouttelettes de lipides rouge qui se démarquent contre corps transparent de l’animal, ce qui facilite l’évaluation qualitative de la distribution des lipides chez les différents tissus6.

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Microscope à fluorescence</td></tr><tr><td>Caméra ERC5s</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td> Caméra MRm <td>compatible avec les couleurs</td></tr><tr><td></td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Capable de fluorescence</td></tr><tr><td>Rouge du Nil</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>Coloration</td></tr><tr><td>lipidique Rouge huile O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>Coloration lipidique</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>Coloration à l’ADN</td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>Solution fixatrice</td></tr><tr><td>0.2 &micro ; Filtre à seringue séteriel</td><td>m VWR</td><td>28145-477</td><td>Filtre en acétate de cellulose</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Agitateur Rôtissoire</td><td>de laboratoire Quake</td><td>400110Q</td><td>Agitateur</td></tr><tr><td>Tube Rotateur</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>Rotateur</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NGM Cholestérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>NGM Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Agar Teknova</td><td></td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>Croissance bactérienne</td></tr></tbody></table>

quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la distribution des lipides du nil rouge et huile rouge o coloration de caenorhabditis elegans

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle exceptionnel permettant d’étudier le métabolisme des lipides et l’homéostasie énergétique. Beaucoup de ses gènes de lipides sont conservés chez les humains et sont associées à un syndrome métabolique ou d’autres maladies. Examen de l’accumulation de lipides dans cet organisme peut être effectué par colorants fixateur ou méthodes exempte d’étiquette. Taches de fixateur comme Nil rouge et huile O rouge sont des moyens peu coûteux et fiables de mesurer quantitativement le taux de lipides et de qualitativement observer distribution des lipides dans les tissus, respectivement. De plus, ces taches permettent de criblage à haut débit des diverses voies et les gènes du métabolisme lipidique. En outre, leur caractère hydrophobe facilite la liposolubilité, réduit l’interaction avec les tissus environnants et empêche la dissociation dans le solvant. Bien que ces méthodes sont efficaces pour examiner le contenu en lipides générales, ils ne fournissent pas d’informations détaillées sur la composition chimique et la diversité des dépôts lipidiques. Pour ces fins, exempte d’étiquette des méthodes telles que la microscopie GC-MS et les voitures sont mieux adapté, leurs coûts par dérogation.

SKN-1 est un bZip, facteur de transcription cytoprotecteurs qui partage une homologie avec NRF2 mammifères et a été montré à la médiation d’oxydation des acides gras. Selon la concentration de glucose dans leur alimentation, worms avec un allèle constitutivement activées skn-1 montrent des niveaux de lipides différents lorsqu’elle est colorée avec Nil rouge7. Figure 1 a -C indique activé skn-1 animaux...

Nil rouge coloration fixe Caenorhabditis elegans est une méthode pour la mesure quantitative des dépôts de lipides neutres, alors que l’huile rouge O coloration facilite l’évaluation qualitative de la répartition des lipides entre les tissus.

Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

L’objectif global de ces méthodes de coloration est de quantifier l’abondance des lipides intracellulaires et d’évaluer la distribution des lipides entre différents tissus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le métabolisme des lipides, telles que la façon dont les lipides sont régulés génétiquement et biochimiquement et les états pathologiques qui régulent l’homéostasie des lipides. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et peu coûteuse à réaliser.Pour effectuer la coloration lipidique du rouge du Nil, placez les vers sur un milieu de croissance de nématodes ou NGM ensemencé avec du log tardif OP50 E.coli et faites pousser les vers à 20 degrés Celsius jusqu’au stade L4 précoce. Lavez les vers avec un millimètre de solution PBST et transférez la suspension de vis sans fin dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre. Centrifugez les vers à 560 fois la gravité pendant une minute.Retirez ensuite le surnageant et répétez le lavage PBST jusqu’à ce que E.coli soit éliminé de la suspension. Ensuite, à la pastille de ver, ajoutez 100 microlitres d’isopropanol à 40 % ou de 60 % pour la coloration ORO et incubez l’échantillon à température ambiante pendant trois minutes. L’ajout d’isopropanol est crucial pour une bonne perméabilisation des vers avant la coloration.Centrifugez les vers à 560 fois la gravité pendant une minute et retirez le surnageant sans perturber la pastille de ver. Il est important de minimiser l’exposition à la lumière pendant les étapes de centrifugation. Maintenant, dans l’obscurité, ajoutez 600 microlitres de solution de travail NR préalablement préparée à chaque échantillon.Retournez les tubes trois fois et mélangez complètement les vers et la solution. Ensuite, incubez l’échantillon dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures. Après l’incubation, centrifugez les vers et retirez le surnageant.Ajoutez ensuite 600 microlitres de PBST et incubez les échantillons dans l’obscurité pendant 30 minutes pour éliminer l’excès de coloration NR. Après avoir retourné les échantillons comme précédemment, retirez tous les microlitres de surnageant, à l’exception d’environ 50 microlitres, et remettez la pastille de ver en suspension dans la solution restante. Pour préparer les lames pour l’imagerie, pipetez cinq microlitres de suspension de vers sur une lame de microscope et appliquez soigneusement une lamelle pour éviter de piéger les bulles d’air.En utilisant le canal GFP FITC pour imager les vers colorés NR et en essayant différents temps d’exposition, imagez les vers à un grossissement quintuple pour capturer plusieurs animaux par champ de vision. Passez ensuite à un grossissement de 10 fois pour une meilleure quantification des vers individuels. Pour quantifier les images, téléchargez les micrographies sur ImageJ.Dans le menu déroulant de l’image, ajustez la luminosité, le contraste de la palette d’images et propagez les modifications à toutes les images en cliquant sur Appliquer. Utilisez l’outil de sélection de polygones pour délimiter chaque ver imagé et, dans le menu déroulant d’analyse, utilisez la fonction de mesure pour qualifier l’intensité de fluorescence émise par NR. Pour chaque image, mesurez cinq emplacements d’arrière-plan et calculez l’intensité moyenne de la fluorescence d’arrière-plan. Ajoutez 600 microlitres de solution de travail Oil Red O ou ORO à chaque échantillon et retournez le tube trois fois pour bien mélanger les vers et l’ORO.Faites tourner les échantillons à 30 tr/min et RT pendant deux heures. Centrifuger les échantillons à 560 fois la gravité pendant une minute et aspirer tout le surnageant à l’exception de 100 microlitres. Utilisez ensuite 600 microlitres de PBST pour remettre les échantillons en suspension et faites pivoter les tubes à 30 tr/min pendant 30 minutes pour éliminer l’excès de coloration ORO.Pour mieux distinguer l’emplacement de la lignée germinale de l’animal dans les cellules intestinales, colorez les noyaux en ajoutant un microlitre de DAPI pour chaque millilitre de solution de travail ORO. Ensuite, pour préparer les lames pour l’imagerie, remettez en suspension les vers et le surnageant restant et mélangez bien la solution. Mettez cinq microlitres de suspension de vers sur une lame de microscope et appliquez soigneusement une lamelle en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne se forme.Pour imager les vers colorés à l’ORO, utilisez une caméra couleur à un grossissement cinq fois pour imager plusieurs vers dans un seul champ de vision. Passez ensuite à un grossissement de 10 fois pour un meilleur examen des vers individuels. Enfin, après avoir téléchargé les images sur ImageJ et créé un jeu d’images selon le protocole texte, classez les images en fonction de l’accumulation de lipides dans tout le corps de l’animal ou dans des tissus spécifiques.SKN-1 partage une homologie avec Nrf2 chez les mammifères et il a été démontré qu’il médie l’oxydation des acides gras. Cette figure montre des animaux SKN-1 activés exposés à des conditions qui entraînent une augmentation des taux de lipides. Comme on le voit sur ces images, la fluorescence NR capturée à l’aide du canal FITC GFP est proéminente le long de l’intestin, mais est plus faible dans la tête, la queue et la lumière intestinale.Bien qu’il soit facile de catégoriser les vers en fonction de la présence ou de l’absence de déplétion somatique des graisses en fonction de l’âge, il peut être difficile d’identifier les animaux présentant une perte de graisse intermédiaire. Comparés aux animaux non ASDF, qui présentent des taches rouge vif dans tout le corps avec peu de zones translucides, les vers ASDF présentent une appauvrissement notable des graisses dans les cellules intestinales. Les animaux en cours de développement de l’ASDF présentent souvent des points translucides où la majeure partie de la perte de graisse finit par se produire.De plus, les vers ASDF peuvent encore présenter des taches rouge vif dans les régions de la tête et de la queue, car le phénotype n’est pas défini par une perte complète de graisse somatique, mais par un épuisement important des graisses par rapport aux animaux non âgés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures plus le temps d’imagerie si elle est correctement réalisée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de laver et de perméabiliser les vers pas plus de 30 minutes avant la coloration.Après cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie CARS peuvent être effectuées pour comparer le type d’espèces lipidiques identifiées par chaque technologie et pour déterminer quelle méthode est la mieux adaptée à des types de questions spécifiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier les lipides et d’évaluer la distribution des lipides chez les vers à l’aide de la coloration au rouge du Nil et au rouge huile O, suivie d’une analyse par micrographie ImageJ.

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Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

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Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal

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