Analyser le comportement larves de drosophile en réponse à une Stimulation des neurones olfactifs Optogenetic

L’objectif global de cette méthodologie est d’analyser le comportement de navigation de la larve de drosophile en réponse à une stimulation optogénétique simultanée de ses neurones olfactifs. Cette méthode permet la dissection complète de la fonction du circuit olfactif et complète les études sur la façon dont la fonction du circuit olfactif se traduit en réponse comportementale. Le principal avantage de cette technique est sa spécificité et son contrôle temporel en utilisant une lumière au lieu des gradients d’odeurs traditionnels pour activer les neurones olfactifs individuels.

Pour commencer l’expérience, construisez une arène de comportement privé de lumière. Construisez une boîte de 89 x 61 x 66 centimètres, faite de feuilles acryliques en plexiglas de couleur noire, de trois millimètres d’épaisseur. Placez la boîte sur une table dans la salle de comportement.

Ensuite, montez une caméra CCD USB 3.0 monochrome équipée d’un filtre IR Longpass 830 nanomètres et d’un objectif à monture F1.4 C de huit millimètres au centre du plafond de la boîte noire. Placez deux bandes LED infrarouges sur la table pour éclairer les larves dans l’arène sombre. Ensuite, procurez-vous une plaque d’aluminium de 22 centimètres sur 22 centimètres carrés pour construire la plate-forme LED.

Au centre de la plaque, utilisez un cutter métallique pour découper un trou suffisamment grand pour s’adapter à la caméra CCD. Couvrez la plaque métallique avec des bandes lumineuses LED rouges. Soudez les fils de la bande lumineuse LED en série et introduisez les fils de la bande dans un relais optocoupleur contrôlé par un microprocesseur Raspberry Pi 2B.

Ensuite, montez la plate-forme LED autour de la caméra CCD. Ensuite, installez et configurez un système d’exploitation basé sur Linux Ubuntu MATE Raspbian Jessie sur le processeur Raspberry Pi avant de connecter le relais optocoupleur aux bandes LED. Branchez une alimentation pour alimenter les bandes LED et l’optocoupleur.

Assurez-vous qu’il y a une irradiance homogène à différents points autour de la caméra CCD dans l’arène du comportement. Assurez-vous de l’irradiance absolue à la surface de l’arène à l’aide d’un spectromètre et déterminez qu’elle est d’environ 1,3 watt par mètre carré sur toute la surface de l’arène. Maintenez les mouches avec de la nourriture anti-mouches standard à 25 degrés Celsius, 50 à 60 % d’humidité relative dans un cycle lumière/obscurité de 12 heures, 12 heures.

Afin d’exprimer CsChrimson dans une seule paire d’ORN, croisez les femelles vierges d’une lignée UAS-IVS-CsChrimson avec des mâles d’une lignée ORX-GAL4. Une fois que les mouches mâles et femelles d’un croisement ont été autorisées à s’accoupler et à pondre des œufs pendant 48 heures, transférez les adultes dans un flacon frais. À la surface de la fiole alimentaire contenant des œufs, ajoutez 400 microlitres d’un mélange contenant 400 micromolaires tout-trans-rétiniens, ou ATR, dissous dans du diméthylsulfoxyde, ou DMSO, dans 89 millimolaires de saccharose dissous dans de l’eau distillée.

Une fois que l’ATR est ajouté aux flacons alimentaires contenant des œufs, incubez les flacons dans l’obscurité pendant 72 heures supplémentaires. Après l’incubation, extrayez les larves du troisième stade de la surface de la nourriture pour mouches en les faisant flotter à l’aide d’une solution à haute densité de 15 % de saccharose. À l’aide d’une micro-pipette P1000, séparez les larves flottant à la surface de la solution de saccharose dans un bécher en verre de 1 000 millilitres.

Lavez les larves quatre fois en échangeant 800 millilitres d’eau distillée fraîche dans le bécher en verre à chaque fois. Après le lavage final, laissez les larves se reposer pendant 10 minutes avant de les soumettre au test de comportement. Pour le test de comportement, maintenez une température et une humidité constantes dans la salle de comportement.

Préparez le milieu de production larvaire en versant 150 millilitres d’agarose fondu à 1,5 % dans une boîte de Pétri de 22 centimètres sur 22 centimètres carrés. Laissez l’agarose se solidifier et refroidir pendant une à deux heures dans les boîtes de Pétri avant de l’utiliser dans le test de comportement. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, ne transférez pas plus de 20 larves du troisième stade préparées au centre de la boîte de Pétri et couvrez la boîte de Pétri avec son couvercle.

Placez la boîte de Pétri dans l’arène de comportement sous la caméra CCD. Allumez la source de lumière LED infrarouge de 850 nanomètres pour visualiser les larves dans la vidéo. Démarrez la caméra CCD pour enregistrer le mouvement des larves.

Enfin, passez au traitement et à l’analyse des données. Lorsque l’ORN 7a exprimant CsChrimson a été stimulé par la lumière, il y a eu une diminution significative de la durée de la course par rapport aux animaux témoins. À l’inverse, lorsque l’ORN 42a exprimant CsChrimson a été stimulé par la lumière, il y a eu une augmentation significative de la durée de course par rapport aux animaux témoins.

Nous avons constaté que pour l’ORN 42a, différents modèles temporels de stimulation lumineuse suscitaient différentes réponses comportementales. Bien que nous ayons démontré cette méthode pour les neurones récepteurs olfactifs de premier ordre, notre méthode permet également une variété d’applications futures, telles que la mesure de l’impact des neurones en aval tels que les neurones de projection et les neurones locaux sur le comportement larvaire. Nous nous attendons à ce que cette technique ouvre la voie à une dissection complète de la fonction du circuit olfactif larvaire.