Construction de Thiol-ene/yne hélicoïdale Peptides Via photoinduit thioéther/sulfure de vinyle-attaché Hydrothiolation

Ces méthodes simplifient la génération de peptides cycliques liés au thio-éther grâce à l’utilisation de la chimie clic thio-ène ou thio-yne qui possède une tolérance de groupe fonctionnel supérieure et un bon rendement. Le principal avantage de cette technique est qu’un lien de thioéther fournit un site de modification sans trace, ce qui élargit considérablement l’espace chimique des peptides stables suite à la modification de la synthèse peptidique. Pour commencer la procédure, fixez une colonne remplie de 50 milligrammes de résine Rink Amide MBHA à la fois à un collecteur sous vide de paillasse et à une conduite d’azote ou d’argon gazeux via un robinet d’arrêt à trois voies.

Ajoutez un à deux millilitres de dichlorométhane au lit de résine et gonflez la résine en agitant doucement le mélange avec un jet de bulles de gaz inerte pendant 10 minutes. Égouttez la résine avec une poire de pipette en caoutchouc lorsque vous avez terminé. Ensuite, ajoutez un à deux millilitres de solution de déprotection N-terminal Fmoc à la résine.

Agitez doucement le mélange en le faisant bouillonner avec un gaz inerte pendant 10 minutes, puis égouttez la résine avec une poire pipette en caoutchouc. Lavez la colonne avec un à deux millilitres de DMF de la même manière, puis un à deux millilitres de DCM. Répétez la séquence de déprotection une fois.

Ensuite, combinez 0,125 millimole d’un acide aminé protégé par le Fmoc et 50,5 milligrammes de HCTU avec 0,5 millilitre de DMF dans un récipient en polypropylène. Secouez le mélange pendant une minute pour dissoudre les solides. Ensuite, ajoutez 43,5 microlitres de DIPEA et agitez le récipient pendant une minute supplémentaire pour obtenir une solution d’acides aminés activés de 0,25 molaire.

Ajoutez cette solution à la résine lavée et faites bouillonner le gaz inerte à travers le mélange pendant une à deux heures. Après cela, déprotégez et lavez le résidu d’acide aminé lié. Continuez à coupler les acides aminés à la chaîne peptidique de cette manière pour former le peptide linéaire.

Utilisez la synthèse peptidique en phase solide pour préparer la résine supportant un peptide linéaire qui comprend un résidu cystéine protégé par le trityle séparé par trois unités d’un résidu mono-S-cinq. Ajoutez un à deux millilitres de solution de déprotection trityle à 50 milligrammes de résine contenant des peptides. Faites circuler l’azote gazeux dans le mélange pendant 10 minutes.

Égouttez la solution de déprotection et lavez la résine avec des portions d’un à deux millilitres de DCM trois fois. Répétez la procédure de déprotection six fois ou jusqu’à ce que la solution n’apparaisse plus jaune pour déprotéger complètement la cystéine. La déprotection complète du groupe Trt de la cystéine est très importante pour l’étape de photoréaction suivante.

Lavez la résine avec des portions d’un à deux millilitres de DMF et de DCM en séquence. Ensuite, faites tremper la résine dans un à deux millilitres de méthanol pendant deux minutes pour rétrécir la résine. Égouttez le méthanol et séchez la résine avec de l’azote gazeux pendant cinq minutes.

Transférez la résine sèche dans une fiole à fond rond de 10 millilitres à l’aide d’un papier de pesée. Mettez la résine en suspension dans deux millilitres de DMF éclaboussé d’azote. Ensuite, ajoutez 5,6 milligrammes de MMP et 38 milligrammes de MAP comme photo-initiateurs.

Placez un agitateur dans le ballon et bouchez le ballon avec un septum en caoutchouc. Purger l’atmosphère du ballon avec de l’azote gazeux trois fois, pour un temps de purge total d’environ cinq minutes. Fixez le ballon de réaction dans un photoréacteur équipé de lampes UVA, d’une entrée d’azote gazeux inerte et d’une plaque d’agitation.

Commencez à remuer le mélange et fermez le photoréacteur. Purgez le photoréacteur avec de l’argon pendant 10 minutes. Ensuite, réglez le débit d’argon à un litre par minute et irradiez le mélange avec une lumière UVA pendant une heure à température ambiante.

Surveillez la réaction avec HPLC. Lavez, fendez et purifiez le peptide cyclique une fois terminé. Préparez 50 milligrammes de résine portant un peptide linéaire qui comprend un résidu mono-S-cinq substitué aux rayons gamma.

Lavez la résine avec du DMF et du DCM en séquence. Rétrécissez la résine avec du méthanol et séchez-la avec de l’azote gazeux. Ensuite, dans une fiole à fond rond de 10 millilitres, suspendre la résine dans deux millilitres de DMF aspergé d’azote.

Ajoutez au mélange 5,6 milligrammes de MMP, 3,8 milligrammes de MAP et 25,7 milligrammes de cystéine protégée par Fmoc. Ajoutez une barre d’agitation dans le ballon, fermez-le avec un septum en caoutchouc et purgez l’atmosphère du ballon avec de l’azote gazeux. Ensuite, irradiez le mélange avec de la lumière UVA dans un photoréacteur inerte rempli d’azote gazeux tout en agitant à température ambiante pendant une à deux heures.

Surveillez la réaction avec LC-MS. Lorsque la photoréaction est terminée, lavez le peptide lié et effectuez la réaction de macrolactamisation. Ensuite, reprenez le couplage des acides aminés au peptide cyclique pour former la structure souhaitée.

Cliver et purifier le peptide une fois terminé. Préparez 50 milligrammes de résine portant un peptide linéaire qui comprend un résidu avec un alcyne terminal séparé de trois unités d’un résidu avec un thiol terminal. Crevez le peptide de la résine et précipitez-le avec un millilitre d’éther diéthylique froid.

Centrifugez le mélange peptidique à 12 000 fois g pendant deux minutes. Décantez doucement le surnageant et ajoutez un autre millilitre d’éther diéthylique froid. Répétez le lavage deux fois de plus, puis séchez les résidus de peptides sous vide.

Dissoudre le résidu dans 50 millilitres de DMF aspergé d’azote dans une fiole à fond rond. Ajoutez 3,2 milligrammes de DMPA à la solution peptidique et faites buller l’azote à travers le mélange réactionnel pendant 10 minutes. Une atmosphère inerte est strictement nécessaire pour une photoréaction efficace du thio-yne dans une phase de solution.

Sinon, nous avons observé une oxydation du soufre lors de l’irradiation UV. Ensuite, irradiez le mélange avec de la lumière UVA sans agiter dans un photoréacteur inerte rempli d’azote gazeux à température ambiante pendant 30 minutes à une heure. Isolez et purifiez le peptide cyclique lorsque vous avez terminé.

La cyclisation sur résine de ce peptide a produit un peptide cyclique à cinq avec un poids moléculaire identique à celui du peptide linéaire. Le temps de rétention HPLC du produit cyclique était plus court de deux minutes que celui du peptide linéaire. Une bonne conversion a également été observée pour la cyclisation sur résine de plusieurs autres peptides courts.

Les peptides linéaires ont été criblés pour leur capacité à subir un agrafage peptidique par hydrothiolation photo-induite du thiol-yne. Le faible rendement de deux c a été attribué à une préférence conformationnelle pour le piégeage du radical thiyle à l’extrémité N-terminale lors de la contraction d’un macrocycle à 20 chaînons. Les peptides un a et un b ont tous deux généré deux isomères avec une réticulation de sulfure de vinyle à huit membres.

Les peptides produits deux a-A et deux a-B avaient des temps de rétention distincts et étaient produits dans des proportions différentes à différents temps d’irradiation. La spectroscopie RMN des protons a indiqué que deux a-A était l’isomère E du sulfure de vinyle et deux a-B était l’isomère Z. L’isomère Z a été le principal produit lors de la formation des peptides deux d, deux e et deux f, ce qui a été attribué à la préférence conformationnelle lors de la formation de la réticulation du sulfure de vinyle à sept membres.

La spectroscopie de dichroïsme circulaire a montré une bobine aléatoire pour toutes les formes de peptides deux a et deux b et une conformation hélicoïdale pour le peptide deux d. Nous avons développé une série de protocoles chimiques pour la construction de peptides attachés au thioéther et au sulfure de vinyle en utilisant la chimie photo-induite du thio-ène et du thio-yne. Nous croyons que cela sera utile pour le milieu de la recherche.