Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Cette méthode peut permettre aux chercheurs d’acquérir un nombre suffisant de types de cellules pour répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie du développement. Le principal avantage de cette technique est qu’elle s’appuie sur quelques marqueurs sélectionnés pour isoler un grand nombre de cellules que l’on trouve traditionnellement en petit nombre ex vivo. L’implication de cette technique s’étend à la greffe de moelle osseuse thérapeutique, car elle permet d’isoler un grand nombre de progéniteurs.

Pour commencer le protocole, saturez les pattes arrière et le torse d’une souris préalablement préparée avec de l’éthanol à 75 % et faites des coupes peu profondes à travers la peau autour de l’articulation de la hanche avec des ciseaux à tissus incurvés. Ensuite, retirez et dénudez les pattes arrière. À l’aide d’une pince, tirez fermement la peau de la hanche vers la cheville, révélant le muscle, et utilisez des ciseaux pour retirer le lambeau de peau.

Coupez juste au-dessus de l’articulation du fémur et de la hanche, et retirez toute la patte arrière en coupant à travers l’os. En travaillant dans une enceinte de biosécurité stérile, transférez les cuisses dans l’une des boîtes de Pétri préalablement préparées. Utilisez des ciseaux pour couper juste en dessous de la cheville et retirez soigneusement autant de muscle et de tissu conjonctif élastique que possible.

Transférez l’os nettoyé dans la deuxième boîte de Pétri préparée. Ensuite, séparez le fémur, le genou et le tibia. À l’aide d’une pince, tenez la jambe au niveau du genou et localisez la moelle, une légère ligne rouge à l’intérieur de la cavité osseuse au sommet du fémur et vers l’extrémité du tibia.

Avec des ciseaux, coupez le tibia juste au-dessus de l’endroit où la moelle semble se terminer. Coupez juste en dessous de l’articulation du genou, coupez juste au-dessus de l’articulation du genou. Ensuite, rincez la moelle osseuse du fémur et du tibia.

Remplissez une seringue de 10 millilitres avec le support complet du tube conique de 50 millilitres et bouchez la seringue avec une aiguille de calibre 23. En tenant l’os avec une pince au-dessus de la troisième boîte de Pétri préparée, insérez l’aiguille dans le canal osseux et poussez le média à travers, rinçant les cellules. Répétez cette étape jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de couleur visible à travers l’os.

Poursuivez la procédure en écrasant l’épiphyse. Alors que vous êtes encore dans la deuxième boîte de Pétri, tenez fermement la rotule avec une pince et écrasez les genoux avec la pointe de la seringue. Continuez jusqu’à ce que les épiphyses ne soient plus rouges.

À l’aide de la seringue, transférez les cellules des deuxième et troisième boîtes de Pétri dans le tube de 50 millilitres. Brisez les amas en pipetant doucement de haut en bas et essayez d’éviter de former des bulles. Centrifugez les cellules.

Ensuite, retirez le surnageant à l’aide de la pipette sérologique, délogez la pastille en effleurant et lysez les globules rouges en les incubant dans un millilitre de chlorure d’ammonium potassium ou de tampon de lyse ACK, pendant une minute à température ambiante. À l’aide d’une pipette sérologique, ajoutez 40 millilitres de tampon HBSS. À l’aide d’une pipette sérologique, filtrez les cellules à travers une crépine de 70 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres, puis centrifugez les cellules.

À l’aide d’une pipette sérologique, prélever le surnageant et cultiver les cellules de la moelle osseuse dans un milieu complet avec 10 nanogrammes par millilitre de GM-CSF de souris recombinante à une densité de un fois 10 à la 6e cellule par millilitre. À l’aide d’une pipette sérologique, transférez les cellules dans des plaques de culture tissulaire et incuberez-les à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone, jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à procéder à la coloration. Doucement, mais soigneusement, pipetez les cellules de haut en bas pour déloger les cellules faiblement adhérentes.

À l’aide d’une pipette sérologique, transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et centrifugez les cellules. Versez doucement le surnageant et lavez les cellules granulées en ajoutant 30 millilitres de tampon de lavage FACS, ou SFWB, avec la pipette sérologique. Ensuite, centrifugez les cellules et répétez le lavage.

Ensuite, suspendez et colorez les cellules selon les instructions du fabricant de l’anticorps. Remettez en suspension cinq fois 10 à 7 cellules dans un millilitre de FWB, et ajoutez deux microgrammes chacun d’anti-Ly-6C et d’anti-CD115, marqués avec des fluorophores. Pour distinguer davantage le CMP du MODC, ajoutez deux microgrammes d’anticorps anti-CD11C.

Incuber les échantillons pendant 30 minutes sur de la glace. Après l’incubation, utilisez une pipette sérologique pour ajouter 10 millilitres de FWB et centrifugez les cellules. Versez doucement le surnageant et lavez les cellules granulées en ajoutant 30 millilitres de FWB à l’aide d’une pipette sérologique.

Centrifugez les cellules et répétez le lavage. Avant de suspendre les cellules, agitez soigneusement le tube pour déloger la pastille. À l’aide d’une pipette sérologique, les cellules sont remises en suspension à une fois de 10 à 7 cellules par millilitre de FWB, et filtrez-les à travers un filtre à cellules de 35 micromètres.

À l’aide d’une pipette sérologique, transférez les cellules filtrées dans un tube en polypropylène et placez le tube sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être triées. Exécutez le contrôle non coloré dans le trieur de cellules et appliquez une porte pour exclure les petits débris et les particules très granulaires. Faites passer les échantillons de contrôle fluorescents uniques dans le trieur de cellules et ajustez la compensation si nécessaire.

Analysez un échantillon de l’échantillon multi-marqué et observez quatre populations distinctes. Appliquez une barrière pour isoler chacune des quatre grandes populations. Préparez les tubes de prélèvement en ajoutant suffisamment de sérum de veau fœtal, ou SCA, pour atteindre une concentration finale d’au moins 20 % lorsqu’ils sont pleins.

Par exemple, si vous utilisez des tubes de cinq millilitres, ajoutez un millilitre de FCS avant le tri et retirez le tube lorsqu’il atteint un volume total de cinq millilitres. Pour éviter le renouvellement de la membrane et l’absorption d’anticorps, conservez tous les échantillons à quatre degrés Celsius tout au long du tri. Une fois que le nombre souhaité de cellules a été collecté, utilisez une pipette sérologique pour transférer les cellules dans un nouveau tube conique et centrifugez les cellules.

Retirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de FWB, puis centrifugez à nouveau les cellules. Répétez la suspension FWB pour un total de deux lavages. Enfin, retirez le surnageant après le deuxième lavage et procédez en fonction de la conception de l’expérience.

Afin de garder le plus grand nombre possible de canaux disponibles pour l’analyse, des cellules viables ont été systématiquement sélectionnées, en fonction de la diffusion directe et latérale, en excluant les événements très petits et très granulaires. Pour déterminer si cette stratégie de contrôle excluait de manière fiable les cellules mortes, les échantillons ont été colorés avec de la 7-aminoactinomycine D. Les cellules analysées immédiatement après la récolte avaient environ 10 % de cellules 7-AAD positives, lorsqu’une porte FSC et SSC typique a été appliquée à des cellules fraîchement isolées de la moelle osseuse. Une proportion similaire de cellules mortes était également présente au séjour 1 et au séjour 3 de la culture.

Au cinquième jour, le nombre de cellules mortes à l’intérieur de la porte a été réduit à 5 %. La cytométrie en flux a révélé qu’au sein de la population Ly6C négative, CD115, les cellules CD3 et CD45R positives persistaient fortement du jour zéro au troisième jour. Le quatrième jour, il ne restait que quelques cellules CD3 CD45R positives, et les cinquième et sixième jours, il n’y avait pas de cellules exprimant CD3, CD45R présentes ; ainsi, dans les quatre jours suivant la culture dans le GM-CSF, les cellules positives à la lignée étaient essentiellement absentes et n’ont pas été détectées du tout aux cinquième et sixième jours de culture.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la composition cellulaire dépend de la durée de la culture. Le tri trois jours après la récolte permet d’obtenir un grand nombre de stades précoces et peu de stades avancés, et vice-versa pour les cultures triées après cinq jours.