Name: L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Découvrez l'isolement et la culture de cellules épicardiques dérivées du cœur humain pour étudier leur comportement et la transition épithélio-mésenchymateuse. Cette méthode aide les chercheurs à comprendre le développement cardiaque.

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Cette recherche est financée par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (VENI 016.146.079) et une bourse de recherche de LUMC tant d’AMS et LUMC Bontius Stichting (MJG).

Toutes les expériences avec des échantillons de tissus humains ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Leiden University Medical Center et est conforme à la déclaration d’Helsinki. Toutes les mesures sont effectuées avec du matériel stérile dans un flux de culture cellulaire du cabinet.
1. les préparatifs
<ol><li>Préparer EPDC milieu en mélangeant de Dulbecco mis à jour le milieu Eagle (DMEM basse-glucose) et milieu 199 (M199) dans un rapport 1:1. Ajouter 10 % chaleur inactivé sérum fœtal (SVF, chaleur inactivé pendant 25 min à 56 ° C) et compléter à 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL. Réchauffez le milieu EPDC dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
	<li>Réchauffez la trypsine 0.25%/EDTA (1:1) dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
	<li>Recouvrir les puits avec de la gélatine. Ajouter 0,1 % de gélatine/PBS dans chaque puits et incuber les boîtes pendant au moins 15 min à 37 ° C. Lignes directrices pour la plaque de culture cellulaire requis sont résumées dans le tableau 1. Retirez soigneusement tous les fluides avant ensemencement des cellules.</li>
	<li>Préparer une solution de 10 mM SB431542 (SB), diluée dans le DMSO (CAUTION). Faire 50 µL d’extraits dans des tubes à centrifuger en polypropylène fond conique, comme des tubes Eppendorf et les stocker à-20 ° C. Notez que les parties aliquotes SB peuvent être décongelés qu’une seule fois.</li>
</ol>2. récupération et stockage des spécimens adultes et foetal coeur
<ol><li>Stocker des oreillettes adultes humains directement après le retrait au cours de la chirurgie dans un tube de 50 mL à 15 mL haute-glucose DMEM contenant 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL à 4 ° C. Les échantillons sont généralement 3-5 cm de taille et peut être conservés jusqu'à 48 h après dissection.</li>
	<li>Stocker les coeurs foetaux issus de matériel de l’avortement électif dans EPDC milieu à 4 ° C jusqu'à 24h après l’isolement. Pour ce protocole, utilisez des échantillons à un âge gestationnel entre 12-22 semaines. Notez que le coeur entier peut être utilisé pour l’isolement de l’épicarde.</li>
</ol>3. isolement de la couche épicardique
<ol><li>Dans le flux laminaire, préparer un plat de 100 mm-culture de cellules avec du PBS et placez une goutte de séparé (~ 200 µL) de PBS dans le couvercle. Remplir un tube de 15 mL avec support EPDC préchauffé 5 mL.</li>
	<li>Placer le tissu dans le plat de culture cellulaire rempli avec du PBS. Assurez-vous que le tissu est imbibé fréquemment au cours de la procédure.</li>
	<li>À l’aide d’un stéréomicroscope, enlevez autant de la couche épicardique de l’échantillon de tissu possible en elle décolle avec une pincette. Remarque : L’épicarde peut être reconnu comme une très mince couche transparente adhéré étroitement à l’extérieur du cœur (Figure 1 a). Essayez d’éviter une contamination par le tissu adipeux épicardique et les vaisseaux sanguins puisque cela entravera l’isolement.</li>
	<li>Rassembler les morceaux de tissu épicardique dans la goutte de PBS sur le couvercle.</li>
	<li>Couper le tissu épicardique en petits morceaux (0. 5 mm3) à l’aide d’un scalpel (Figure 1 b), ou le bout pointu des petites pinces. Notez que les pièces soient en mesure de passer une P1, 000 embout de la pipette (étape 3.6).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de la trypsine dans le tissu épicardique et collecter les pièces et la trypsine avec une P1, 000 embout de la pipette. Transvaser le tissu dans un tube à centrifuger conique de 1,5 mL (Figure 1).</li>
	<li>Incuber le tube dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min, en agitant à ~ 60 tr/min.</li>
	<li>Retirer le tube de l’eau du bain et nettoyer l’extérieur du tube avec l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Laisser le tissu à couler au fond du tube (Figure 1) et transvaser avec soin le surnageant contenant les cellules épicardiques dans le tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu de EPDC pour inactiver la trypsine.</li>
	<li>Reconstituer le tissu restant dans le tube à centrifuger conique avec la trypsine 1 mL et mélanger doucement pipetage de haut en bas.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.7 à 3.10 deux fois. À l’étape finale, après un total de 30 min d’incubation de la trypsine, transfert tant le surnageant et le tissu épicardique restant dans le tube contenant le milieu EPDC.</li>
	<li>Lorsque toutes les cellules sont collectées dans un milieu EPDC, doucement passer la suspension par une seringue de 10 mL avec une aiguille de calibre 19 dans un nouveau tube de 15 mL de dissocier mécaniquement les cellules (Figure 1E). Remarque : Assurez-vous d’homogénéiser la suspension par pipetage de haut en bas avant de passer la solution à travers l’aiguille afin d’empêcher l’aiguille s’obstruée.</li>
	<li>Pour davantage de dissocier les cellules, répétez l’étape 3.12 avec une aiguille de calibre 21.</li>
	<li>Placez une passoire de cellule de 100 µm au sommet d’un tube de 50 mL et transférer le support contenant les cellules épicardiques sur la crépine à l’aide d’une pipette de 10 mL pour enlever toutes les touffes restants (Figure 1F).</li>
	<li>Laver le filtre pour recueillir des cellules résiduelles en pipettant également, 5 mL de milieu de EPDC sur la crépine.</li>
	<li>Pipette de la suspension cellulaire du tube de 50 mL dans un tube de 15 mL. Étant donné que les cellules se déposent au fond du tube, secouez légèrement la solution avant de pipetage. Remarque : Cette étape n’est pas nécessaire, un tube plus petit sida visualisation du culot après centrifugation.</li>
	<li>Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (Figure 1).</li>
	<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire (Figure 1 H) dans le volume requis de EPDC support (tableau 1). Remarque : Pour EPDCs fœtales, utilisez directement moyen EPDC contenant 10 µM de l’inhibiteur de kinase de ALK5 (EPDC + SB). Les cellules adultes peuvent être plaqués sans SB lors du premier passage.</li>
	<li>Plaque de la suspension cellulaire sur les plaques de culture de gélatine enduit (Figure 1I). La taille du puits dépend de la taille de l’échantillon de tissu épicardique (tableau 1). Notez que confluence basse va entraîner l’apparition de l’EMT.</li>
	<li>Placer les cellules dans un incubateur pendant au moins 48 h à 37 ° C, 5 % de CO2 pour permettre les cellules fixer sur la plaque de culture.</li>
</ol>4. culture de EPDCs
<ol><li>Reconstituer le milieu EPDC + SB au moins tous les 3 jours.</li>
	<li>Inspecter les cellules au moins tous les 3 jours à l’aide du microscope. Lorsque les cellules atteignent la confluence, c'est-à-direlorsque la plaque de culture est entièrement recouverte de cellules, le passage des cellules dans un rapport de 1:2 de surface. Notez que pour atteindre confluence peut prendre environ 5 à 10 jours.<ol>
<li>Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette ou un système d’aspiration avec, par exemple, une pipette de verre.</li>
		<li>Laver soigneusement les cellules en ajoutant des PBS aux cellules. Doucement agiter la plaque et aspirer le PBS.</li>
		<li>Ajouter la trypsine à la plaque. Tourner délicatement la plaque pour couvrir toutes les cellules avec de la trypsine et incuber la plaque pendant 1 min à 37 ° C. NOTE : Utiliser comme trypsine peu possible (indication : 200 µL / puits d’une 6 bien sur plaque)</li>
		<li>Taper la plaque pour détacher mécaniquement les cellules de la partie inférieure de la plaque. Utiliser le microscope pour vérifier visuellement si les cellules ont détaché. Si ce n’est pas le cas, incuber la plaque de culture cellulaire pendant une minute supplémentaire.</li>
		<li>Ajouter le volume requis de EPDC + SB milieu aux cellules, resuspendre par pipetage de haut en bas et transférer la suspension cellulaire à une nouvelle plaque de culture enduit de gélatine. Remarque : en général, les cellules peuvent être conservés dans une morphologie pavées jusqu'à passage 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. l’induction de l’EMT dans EPDCs
<ol><li>Pour provoquer l’EMT, dissocier les cellules avec la trypsine et transfert les cellules à la gélatine de nouveaux enduits de puits dans un rapport de 1:2 surface dans un milieu EPDC + SB, comme décrit dans 4 et incuber pendant au moins 24 h à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Vérifiez si confluency est 50-70 %, et si EPDCs ont une morphologie de pavés. Remarque : Confluence affecte l’aptitude des EPDCs EMT.</li>
	<li>Aspirer le milieu des cellules et laver les cellules soigneusement avec du PBS (Voir l’étape 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>Stimuler les cellules avec 1 ng/mL TGFβ3 dans un milieu EPDC et placez-les dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 5 jours. Notez que pendant la stimulation, le milieu EPDC contenant du TGFβ3 n’a pas à être réapprovisionné.</li>
	<li>Contrôler les cellules au quotidien. Après 5 jours, les cellules qui ont subi les EMT sont reconnus par une morphologie fusiforme (Figure 2 a).</li>
	<li>La culture fusiformes EPDCs selon la méthode décrite dans 4 sans addition de SB ou TGFβ au milieu EPDC. Notez qu’en général, EPDCs fusiformes peuvent être cultivées jusqu'à passage 20.</li>
	<li>Valider la présence de l’EMT avec immunofluorescence à l’aide d’anticorps contre les marqueurs mésenchymateux αSMA ou la vimentine ou par la phalloïdine pour détecter la formation de fibres de stress d’actine F (Figure 2 b), ou qRT-PCR pour les gènes liés à l’EMT ( par exemple, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-cadhérine, MMP3, escargot, limace) (Figure 2 et tableau 2).</li>
</ol>

<ol><li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells%3A+Their+origin%2C+role+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research%22%5BJournal%5D)">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li>
<li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li>
<li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li>
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<li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li>
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<li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells%3A+a+novel+model+to+study+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li>
<li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici un protocole détaillé d’isoler et de la culture des cellules primaires épicardiques dérivés de coeurs adultes et du foetus humains. Une caractérisation de ces cellules a été précédemment publié17. Nous avons montré que les deux types de cellules peuvent être maintenues tant que les cellules épithéliales de pavées comme lorsqu’il est cultivé avec l’inhibiteur de kinase de ALK5 SB431542. EMT est partie intégrante du épicardique activation in vivo au cours de développement...

L’épicarde, une couche épithéliale monocellulaires qu’enveloppes le coeur, est d’une importance vitale pour le développement cardiaque et réparation (examinées par Smits et al. 1). développemental, l’épicarde découle de l’orgue de proepicardial, une petite structure située à la base du cœur en voie de développement. Autour du jour du développement E9.5 à la souris et après la conception 4 semaines chez les humains, les cellules commencent à migrer à partir de cette structure de chou-fleur et de couvrir les pays en développement de myocarde2. Une fois qu’une couche unique de cellules épithéliales est formée, une partie des cellules épicardiques subit épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT). Au cours de l’EMT, les cellules perdent leurs caractéristiques épithéliales, comme les adhérences cellule-cellule et obtenir un phénotype mésenchymateux qui leur donne la capacité de migrer dans le myocarde en voie de développement. Les cellules formées de dérivée épicardiques (EPDCs) peuvent se différencier en plusieurs types de cellules cardiaques, y compris les fibroblastes, cellules musculaires lisses et potentiellement cardiomyocytes et cellules endothéliales3, bien que la différenciation de ces derniers, deux cellules les populations reste sujette à débat (examinée par Smits et al. 4). en outre, l’épicarde fournit des signaux paracrines instructif sur le myocarde pour réguler sa croissance et la vascularisation5,6,7,8. Plusieurs études ont démontré qu’avec facultés affaiblies formation épicardique conduit à des anomalies du développement dans le muscle cardiaque9,10, système vasculaire11et conduction system12, mettant l’accent sur l’essentiel contribution de l’épicarde à la formation du cœur.
Bien qu’en plein adulte l’épicarde est présent sous une couche dormante, il devient réactivé après ischémie13. Après lésion de réactivation épicardique reprend plusieurs des processus décrits pour le développement cardiaque, y compris la prolifération et EMT14, quoique moins efficacement. Fait intéressant, bien que le mécanisme exact n’est pas entièrement compris, la contribution épicardique de réparer peut être améliorée par un traitement avec, par exemple, thymosine β415 ou modification ARNm de VEGF-A16, résultant en flexibilit cardiaque fonction après infarctus du myocarde. L’épicarde constitue donc une source intéressante de cellulaire pour améliorer la réparation endogène du cœur blessé.
Mécanismes du développement cardiaque sont souvent récapitulés lors de blessures, quoique de manière moins efficace. En quête d’activateurs épicardiques, il est primordial que nous pouvons déterminer et comparer la capacité totale de l’épicarde foetale et adulte. En outre, d’un point de vue thérapeutique, il est important que, en plus de l’expérimentation animale, nous étendons connaissance relativement à la réponse de l’épicarde humaine. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et adultes et foetales épicardiques dérivées des cellules humaines (EPDCs) dans une morphologie épithéliale-cellule-comme la culture et d’induire des EMT. Avec ce modèle, notre objectif est d’explorer et de comparer le comportement cellulaire épicardique adultes et du foetus.
Le principal avantage de ce protocole est l’utilisation de matériel épicardique humain, qui n’a pas été soigneusement étudiée. Ce qui est important, le protocole de culture décrit isolement et cellule fournit une seule méthode uniforme pour calculer les deux galets foetale et adultes EPDCs, permettant une comparaison directe entre les sources de ces deux cellules. En outre, étant donné que l’épicarde est isolée en fonction de son emplacement, il est assuré que les cellules sont en fait que dérivée17.
Tandis que des méthodes d’isolement EPDC humaines ont été établis précédemment, ces dépendent principalement de protocoles excroissance où des morceaux de tissu cardiaque ou épicardique sont plaqués sur une cellule culture plat18,19. Cette approche sélectionne ainsi spécifiquement pour les cellules qui perdent partiellement leur phénotype épithélial afin de migrer, et qui sont plus susceptibles de subir une EMT spontanée. Dans le protocole actuel, l’épicarde est d’abord transformé en une solution de cellule unique qui permet à l’EPDCs isolés maintenir leur état épithélial. Cette méthode fournit donc un modèle solide en vitro afin d’étudier les EMT épicardique.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 0,25 %</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G sel sodique</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 1:250 du pancréas bovin</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de la peau de porc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture 6 puits</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture 12 puits</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture 24 puits</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000et micro ; L Pointes de pipette filtrées</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de 10 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de 5 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Ou tubes Eppendorf faits maison et stérilisés</td></tr><tr><td>1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>0030120086</tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 50 ml</td><td>Seringue Becton bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de calibre 19</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Calibre 21</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Tamis à cellules EASYstrainer, 100 & micro ; m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta ; 3&nbsp ;</td><td>R& D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-actine monoclonale, &alpha ;-Muscle</td><td>lisse Sigma</td><td>A2547&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments </td></tr><tr><td>Pipette P1 000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de pipette</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à lumière inversée</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

l’isolement et la culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

L’épicarde, une couche de cellules épithéliales couvrant le myocarde, a un rôle essentiel au cours du développement cardiaque, ainsi que dans la réponse de réparation du coeur après une lésion ischémique. Lorsqu’il est activé, les cellules épicardiques subissent un processus appelé épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT) pour assurer les cellules vers le myocarde en régénération. En outre, l’épicarde contribue par l’intermédiaire de la sécrétion de facteurs paracrines essentiel. Pour apprécier pleinement le potentiel de régénération de l’épicarde, un modèle de cellule humaine est nécessaire. Ici, nous présentons un modèle de culture cellulaire roman pour dériver des cellules dérivées épicardiques primaires (EPDCs) de tissu cardiaque adult et du foetus humain. Pour isoler le EPDCs, l’épicarde est disséqué de l’extérieur de l’échantillon de cœur et transformée en une suspension monocellulaire. Ensuite, les EPDCs sont plaqués et cultivées dans un milieu contenant l’inhibiteur de kinase-5 ALK SB431542 pour maintenir leur phénotype épithélial EPDC. EMT est induite par la stimulation avec TGFβ. Cette méthode permet, pour la première fois, l’étude du processus de l’humain EMT épicardique dans un milieu contrôlé et permet de gagner plus de perspicacité dans la sécrétome de EPDCs qui peut aider la régénération cardiaque. Par ailleurs, cette approche uniforme permet une comparaison directe des comportements humains adultes et foetale épicardique.

Ici, nous exposons un protocole simple pour isoler EPDCs des adult et du foetus humain tissu cardiaque (Figure 1). Ce protocole tire parti de l’emplacement facilement accessible de l’épicarde à l’extérieur du cœur (Figure 1 a). Coloration de l’oreillette cardiaque après que dissection montre que l’épicarde WT1 + est supprimé tandis que le sous-épicardique sous-jacente de la matrice extracellulaire et le tissu myocardique restent ...

L’épicarde joue un rôle crucial dans le développement et la réparation du coeur en fournissant des cellules et facteurs de croissance à la paroi myocardique. Nous décrivons ici une méthode aux cellules humaines d’épicardique principale culture qui permet l’étude et la comparaison de leurs caractéristiques développementales et adultes.

L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver des cellules humaines dérivées d’épicardes afin d’étudier le comportement des cellules épicardiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche cardiaque, telles que la façon dont l’épicarde est activé au cours du développement et de la maladie cardiaques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée à des échantillons de tissu cardiaque humain, ce qui peut aider à traduire les résultats dans un cadre clinique.Notre protocole décrit l’étude de la transition épithéliale à mésenchymateuse des cellules dérivées d’épicardiens. Cependant, il peut également être utilisé pour étudier la prolifération ou la sécrétion de facteurs. Pour commencer, remplissez une boîte de culture cellulaire de 100 millimètres avec du PBS à l’intérieur de l’armoire à flux laminaire.Placez environ 200 microlitres de PBS dans le couvercle, puis ajoutez 5 millilitres de milieu EPDC préchauffé dans un tube de 15 millilitres. Placez le tissu cardiaque, isolé d’un cœur humain adulte, dans la boîte. Sous un stéréomicroscope, utilisez une pince pour retirer soigneusement la couche

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans ce protocole, w e identifié une nouvelle population de cellules mélanocytes comme (également connu sous le nom mélanocytes cardiaques) dans le cœur des souris et des humains qui contribuent à une arythmie auriculaire déclenche chez la souris.

Isoler des cellules mélanocytes comme primaires du Cœur de souris

La culture de la cellule primaire est une technique utile pour l'analyse de populations spécifiques de cellules, en particulier à partir d'embryons de souris transgéniques à des stades spécifiques du développement. Ici, ventricules embryonnaires sont disséqués et dissociées, et des perles anticorps conjugués à reconnaître et séparer les cellules endothéliales pour une analyse ultérieure.

Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

Les connaissances actuelles sur la base cellulaire de maladies cardiaques repose principalement sur des études sur des modèles animaux. Nous décrivons ici et valider une nouvelle méthode pour obtenir des cardiomyocytes viables simples de petits échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire humaine. Myocytes ventriculaires humains peuvent être utilisés pour des études électrophysiologiques et le dépistage des drogues.

L&#39;isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

Ici, nous décrivons des méthodes pour isoler des cellules épicardiques primaires de souris par un test de culture d’excroissance et évaluer la migration fonctionnelle des cellules dérivées d’épicardiens (EPDC) à l’aide d’un système de culture cardiaque ex vivo. Ces protocoles sont adaptés à l’identification des modulateurs génétiques et chimiques de la transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) épicardique et de la motilité.

Épicardique Excroissance Culture Assay et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Évaluation des épicardique dérivés Migration cellulaire

L’épicarde est une source essentielle de cellules progénitrices cardiovasculaires multipotentes et de facteurs paracrines nécessaires au développement et à la régénération cardiovasculaires. Nous décrivons ici une méthode de culture de cellules épicardiques embryonnaires de souris.

Culture in vitro de cellules épicardiques De Coeur souris embryonnaires

du tissu cardiaque humain héberge des populations de cellules précurseurs pluripotentes périvasculaires qui peuvent être appropriés pour la régénération du myocarde. La technique décrite ici permet l'isolement et la purification simultanée de deux populations de cellules stromales pluripotentes associées aux vaisseaux sanguins d' origine, c. -à- CD146 + CD34 - péricytes et les cellules CD34 + CD146 - cellules de l' adventice, du myocarde humain.

Isolement de périvasculaire Multipotentes Précurseurs cellulaires Populations de Cardiac Human Tissue

Plusieurs protocoles ont été développés et décrits pour l'isolement de différents types de cellules cardiaques d'un cœur de rat. Ici, un protocole optimisé est décrit qui permet d'isoler des types de cellules cardiaques majeurs de haute qualité (cardiomyocytes, cellules endothéliales et fibroblastes) à partir d'une seule préparation, réduisant ainsi les coûts expérimentaux.

Isolation simultanée de cardiomyocytes de haute qualité, de cellules endothéliales et de fibroblastes d&#39;un coeur de rat adulte

Le but de ce travail est de développer une méthode pour isoler de façon reproductiblement les cardiomyocytes du cœur adulte et mesurer la teneur en ADN et la nucléation.

Isolement des cardiomyocytes des coeurs fixes pour l’immunocytochimie et l’analyse de ploy

Nous présentons un protocole pour l’isolement des cellules endocardiques et coronaires endothéliales endothéliales des coeurs de rat par la digestion séquentielle de tissu dans un tampon de digestion, la collection de cellules des cycles récurrents de centrifugeuses, et la purification de cellules utilisant des microbilles de CD31 anti-rat.

Isolement des cellules endocardiques et coronaires endothéliales du mur libre ventriculaire du cœur de rat

Présenté est un protocole pour l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains et animaux des tranches myocardales vibratoires. Des rendements élevés de cellules tolérantes au calcium (jusqu’à 200 cellules/mg) peuvent être obtenus à partir de petites quantités de tissus (&lt;50 mg). Le protocole s’applique au myocarde exposé à l’ischémie froide jusqu’à 36 h.

Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut

Une méthode est décrite pour l’isolement simultané des myocytes et des non-myocytes des atria et des ventricules d’un coeur adulte simple de souris. Ce protocole a comme résultat des rendements cohérents des myocytes cardiaques et des non-myocytes fortement viables et détaille les conditions optimales de culture cellule-spécifique pour le phénotypage et l’analyse in vitro.

Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

Découvrez l'isolement et la culture de cellules épicardiques dérivées du cœur humain pour étudier leur comportement et la transition épithélio-mésenchymateuse. Cette méthode aide les chercheurs à comprendre le développement cardiaque.

L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain

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