Name: Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Apprenez un protocole de cytométrie en flux simple pour évaluer l'amplification dépendante des anticorps du virus de la dengue par sérum de convalescents du virus Zika. Cette méthode haut débit facilite la recherche en virologie.

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Le projet décrit a été soutenu par des fonds de l’Uniformed Services University of the Health Sciences à JJM. Les opinions ou les affirmations contenues dans ce document sont celles des auteurs privés et ne sont pas pour être considéré comme officiels ou reflétant les vues du ministère de la défense, l’Uniformed Services University of the Health Sciences ou tout autre organisme des États-Unis Gouvernement.
WGV effectué toutes les expériences et analysé les données ; JJM conçu et supervisé l’étude ; WGW et JJM a écrit le livre.

Les échantillons de sérum utilisés pour démontrer le protocole décrit ici proviennent de macaques rhésus qui étaient logés et pris en charge conformément à l’état local et fédérales politiques dans une Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC)-accrédités par facilité. Toutes les expériences animales ont été examinées et approuvées par animalier institutionnel et Comité de l’emploi et des échantillons ont été acquis par un protocole de partage des tissus.
1. jour 1
Remarque : Effectuez toutes les étapes décrites ci-dessous dans une armoire de biosafety stérile à flux laminaire utilisé pour culture de tissus dans un laboratoire BSL-2.
<ol><li>Décongeler les échantillons de sérum à la température ambiante et transférer 100 µL de chaque échantillon de sérum dans un tube stérile. Chaleur inactive pendant 30 minutes à 56° C dans un bain d’eau ou une température réglable thermomixer. Faire 10 fois des dilutions de l’échantillon de sérum allant de 1:1 à 1 : 1 000 à l’aide de froid RPMI-10 (RPMI avec 10 % sérum de veau fœtal).</li>
	<li>Transférer 10 µL de l’échantillon de sérum dilué en série à chaque puits d’une plaque de fond en V 96 puits stérile. Comprend deux ensembles de puits de contrôle, RPMI-10 avec VPR seulement et sans échantillon de sérum et RPMI-10 seulement sans VPR et sans échantillon de sérum. Mettre en place chaque échantillon de sérum et RPMI-10 témoins en géométrie.</li>
	<li>Retirer la Dengue-1, 2, 3 et 4 VPR du congélateur-80 ° C et dégel dans un bain-marie à 37 ° C. Transférer la VPR dégelé immédiatement à la glace. Obtenir environ 170 µL VPR pour chaque échantillon de sérum (10 µL de VPR x 3 puits pour chaque dilution du sérum (1:1, 01:10, 1/100, 1 / 1 000) et 10 µL de VPR x 3 wells pour chacune des RPMI-10 avec RVP seulement contrôler les puits).</li>
	<li>Déposer 10µl de VPR dans chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits contenant l’échantillon de sérum et au RPMI-10 avec puits de contrôle VPR (pas de sérum). N’ajoutez pas de puits de VPR avec le RPMI-10 seulement (aucun échantillon de sérum et sans RVP). Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas 5 à 10 fois. Ajouter 10 µL de froid RPMI-10 au lieu de VPR à chaque froid RPMI-10 seulement (aucun échantillon de sérum et sans RVP) contrôle des puits.</li>
	<li>La plaque de fond en V 96 puits de transfert à un incubateur et incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C en présence de 5 % de CO2. Alors que la plaque de fond en V 96 puits est en incubation, nettoyer la surface de la biosécurité armoire avec 70 % d’éthanol et exécuter les ultraviolets pendant 15 min.</li>
	<li>Sortir une fiole T75 entièrement confluente de cellules K562 de l’incubateur, mixer les cellules bien à l’aide d’une pipette stérile 5 mL et transférer 5 mL de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL. Remarque : Les cellules K562 sont maintenus en milieu RPMI-10 et repiqués à 1 x 106/ml.</li>
	<li>Compter le nombre de cellules en enlevant les 10 cellules µL du tube conique stérile de 15 mL et mélanger avec le bleu de tryphan 10 µL. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules dans le tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuger les 15 mL conique avec cellules à ~ 1 200 x g pendant 10 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules chaudes RPMI-10 à une concentration de 80 000 cellules/30 µL de médias (2,66 x 106 cellules/ml).</li>
	<li>Retirez la plaque de fond en V 96 puits de l’incubateur (étape 1.6), de transférer 30 µL de cellules K562 dans chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits et mélanger soigneusement en pipettant également monter et descendre 5 à 10 fois. La plaque de fond en V 96 puits de transfert à un incubateur et incuber la plaque pendant 1 heure à 37 ° C en présence de 5 % de CO2.</li>
	<li>Après incubation pendant 1 h, enlever la plaque de fond en V 96 puits de l’incubateur et centrifuger à ~ 1 200 x g pendant 5 minutes. Après centrifugation, décantation des médias provenant des puits en tournant la plaque à l’envers dans un récipient contenant 10 % eau de Javel.</li>
	<li>Laver les cellules dans chaque puits par eux resuspendant dans 125 µL de RPMI-10 chaud, bien mélanger avec une pipette et centrifuger la plaque à ~ 1 200 g pendant 5 min. décanter les médias en tournant la plaque à l’envers dans un récipient contenant 10 % eau de Javel. Répétez cette étape de lavage deux fois.</li>
	<li>Après le lavage, ajouter 100 µL de chaud RPMI-10 à chacun se mélangent bien, Monte et descend avec la pipette et incuber la plaque pendant 48 h à 37 ° C en présence de 5 % de CO2.</li>
</ol>2. jour 3
<ol><li>Retirez la plaque de fond en V 96 puits contenant 100 µL de cellules et médias/puits de l’incubateur et déplacez-le dans une armoire de sécurité biologique. À l’aide d’une pipette multicanaux, mélange le contenu de chaque bien et transférer les cellules et médias à 96 puits U fond sur plaque ou au préalable étiquetés tubes en polypropylène de 5 mL.</li>
	<li>Rincer chaque puits de la plaque de fond en V 96 puits avec 100 µL de 1 % paraformaldéhyde (PFA) dans 1 x Saline tamponnée au Phosphate (PBS) et transfert vers les puits respectifs dans le 96 bien U-plaque ou marqués 5 mL tubes en polypropylène à l’étape 2.1 de céder une finale concentration de 0,5 % PFA/puits ou tube. Mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux, couvrir la plaque avec du papier aluminium et laisser reposer dans l’incubateur pendant 30 minutes pour fixer les cellules.</li>
	<li>Préparer le cytomètre de flux (voir Table des matières par exemple) en exécutant les cellules K562 incolores pour étalonner le côté et vers l’avant dispersion ainsi que les paramètres de fluorescence. Le canal de fluorescence seul requis est FL1, comme GFP est la seule fluorescence émise par les cellules. Acquisition de ~ 30, 000-50 000 cellules de chaque échantillon. Remarque : Un cytomètre de flux capable de lire une fluorescence unique peut être utilisé pour l’acquisition des données, cellules infectées avec VPR seulement émet une fluorescence verte due à la présence de GFP, et aucun autre canal de fluorescence ne sont nécessaires.</li>
</ol>3. analyse des données
<ol><li>
Analyser les données acquises sur le cytomètre en flux à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse de cytométrie en flux (voir Table des matières).
	<ol>
<li>Ensemble le premier portail basé sur FSC-A (forward scatter – zone) vs FSC-H (forward scatter – hauteur) comprennent des cellules individuelles et exclure les doublets auto-fluorescent analyse12. Puis, la porte cellules bloquées singulet issus des SSC-A (diffusion latérale – zone) vs FSC-A exclure tout débris auto-fluorescente.</li>
		<li>Analyser les SSC-A vs FSC-A cellules fermées pour l’expression de la GFP basé sur SSC-A vs GFP-A. Déterminer le pourcentage de cellules GFP + pour chaque dilution des échantillons de sérum et de contrôle en définissant une barrière autour de GFP + cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminer le pourcentage moyen de GFP + cellules pour chaque dilution des échantillons sériques et les puits de contrôle en divisant le pourcentage total de GFP + cellules dans les puits en triple par 3.</li>
	<li>Calculer pli-amélioration de l’infection en divisant le pourcentage moyen de GFP + cellules dans les échantillons de sérum pour chaque dilution divisé par le pourcentage moyen des cellules GFP + dans le RPMI-10 avec puits de contrôle VPR (aucun échantillon de sérum).</li>
	<li>Graphique de pli-perfectionnement (axe y) contre la dilution (axe x) et effectuer une analyse statistique en utilisant ANOVA suivie de test post hoc de Tukey à comparaisons multiples.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Flavivirus comme DENV et ZIKV partagent des preuves significatives d’homologie dans les deux leurs protéines structurales et non structurales qui produisent des anticorps qui réagissent avec l’autre13,14. Ces réponses anticorps une réaction croisée ont été démontrés pour améliorer d’infection aussi bien in vivo et in vitro avec un sérotype hétérologue ou autres associés flavivirus1,2. Le...

Amélioration dépendante des anticorps (ADE) de l’infection est un processus par lequel partiellement une réaction croisée d’anticorps induits par un sérotype de virus augmente l’absorption d’un autre sérotype du virus, conduisant à une virémie et une augmentation de la réplication virale. ADE a été largement documenté dans les infections de virus (DENV) la Dengue où quatre principaux sérotypes sont fréquentes. Dans un sous-groupe de patients, l’ADE est associée à une fièvre hémorragique (DHF). Nous avons récemment démontré que Zika infection par le virus (ZIKV) induit des réponses en anticorps croisée DENV origine ADE de DENV in vitro et probablement contribué à l’amélioration de la virémie DENV in vivo1 significativement élevés , 2. dosages d’anticorps dépendant d’amélioration constituent un outil précieux pour évaluer la capacité des anticorps à améliorer une infection secondaire avec des virus apparentés et donnent des indications précieuses sur la pathogenèse des infections par un flavivirus et informer le développement de vaccins.
Le test décrit ici utilise DENV VPR ainsi que les cellules K562 qui sont normalement inadmissibles à l’infection. VPR est structurellement intact réplication incompétent DENV particules virales qui codent un réplicon sub-génomique protéine fluorescente verte (GFP) qui s’exprime après un seul tour de réplication3. Ainsi, les cellules qui deviennent infectées par VPR réagissant en vert et peuvent être facilement détectés à l’aide de la cytométrie en flux ou la microscopie. La VPR utilisé dans cet essai ont été obtenues de sources commerciales. Ils peuvent, toutefois, être produites contre les autres virus et utilisés dans le test décrit dans ce manuscrit. Pendant ce temps, les cellules K562 sont une lignée de cellules leucémie FcγIII-exprimant le récepteur qui se lient à la région Fc des anticorps et s’infectent en présence de neutraliser des concentrations d’anticorps4,5.
ADE dosages ont été largement utilisés dans les études portant sur les facteurs de risque pour la dengue sévère et pour délimiter les mécanismes de in vitro ADE6,7,8. Le dosage de l’ADE décrit ici peut être utilisé rapidement et facilement pour déterminer la capacité du sérum pour améliorer l’infection in vitro à l’aide de VPR et cytométrie en flux, par rapport à d’autres tests utilisés actuellement, qui nécessitent soit la détermination de la formation de plaque unités (pfu) dans les cellules Vero ou souillure d’anticorps infecté les cellules6,7,8,9,10,11, qui sont tous deux beaucoup de temps et du travail intensif.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 cellules</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10 % FBS dans RPMI-10</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>MP biomedicals</td><td>1670049</td><td>100 UI Pen/mL, 100 ug Strep/mL dans RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-CL</td><td>0.025M dans une solution d’acides aminés non essentiels RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM (100&times ;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x dans RPMI-10</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM dans RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher</td><td>Scientific MT25005CI&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plaques stériles à fond en V</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polypropylène 5 ml Tubes FACS</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond en U non stériles</td><td>Falcon Ref</td><td>353910</td><td>Une alternative à haut débit aux tubes FACS</td></tr><tr><td>5mL, stérile, pipette sérologique</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL pointes</td> <td>de pipette stérilesDenville</td><td>P3020 CPS</td> 20uL pointes de pipette stériles <td></td></tr><tr><td></td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL pipette multicanaux</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL pipette multicanaux</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20 % formadehyde</td><td>Tousimis</td> <td>#1008B</td><td></td></tr><tr><td>bain-marie</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>thermomélangeur</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>Une alternative au bain-marie pour l’inactivation thermique</td></tr><tr><td>Incubateur CO2</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>liquide Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Logiciel d’analyse de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II cytomètre</td><td>en flux Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bleach</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

un simple écoulement cytometry based assay pour déterminer in vitro anticorps dépendant amélioration du virus de la dengue à l’aide de sérum de convalescent virus zika

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Amélioration dépendante anticorps d’infection a été démontrée à jouer un rôle majeur dans la pathogénie virale de la Dengue. Traditionnels tests qui mesurent la capacité d’anticorps ou de sérum d’augmenter l’infection dans les lignées cellulaires inadmissible ont compté sur l’utilisation de production virale dans les médias, suivies par des essais de plaque pour quantifier l’infection. Plus récemment, ces tests ont examiné infection par le virus (DENV) la Dengue dans les lignées cellulaires à l’aide d’anticorps fluorescent étiquetés. Ces deux approches ont des limites qui restreignent l’utilisation généralisée de ces techniques. Nous décrivons ici un essai simple in vitro à l’aide de Dengue virus journaliste particules virales (VPR) qui expriment la protéine fluorescente verte et les cellules K562 à examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’infection DENV sérum obtenu à partir de rhésus macaques 16 semaines après l’infection par le virus Zika (ZIKV). Cette technique est fiable, implique la manipulation des cellules, ne nécessite pas l’utilisation de virus compétente de réplication direct et peut être effectuée dans un format haut débit pour obtenir une lecture quantitative à l’aide de cytométrie en flux. En outre, ce test peut être facilement adapté pour examiner l’amélioration dépendante des anticorps (ADE) d’autres infections flavivirus tels que les virus de la fièvre jaune (SVA), virus de l’encéphalite équine japonais (tarek), virus du Nil occidental (VNO) etc. où les VPR est disponibles. La facilité de mise en place du test, analyse des données et interprétation des résultats rendent très favorable à la plupart des paramètres de laboratoire.

Des sérums provenant de 4 rhésus macaques ont été recueillies à 16 semaines après l’infection avec ZIKV et testés pour leur potentiel d’amélioration DENV-1, 2, 3 et 4 infection dans les cellules K562. Les animaux avaient une virémie pic de ~ 1 x 105 copies de ZIKV RNA/mL de plasma par jour 3 après l’infection qui a diminué à des niveaux inférieurs à la limite de détection de 7 jours après l’infection. Aucun virémie a été détectée dans le plasma à l’infection après 16 semaines. ...

Les auteurs décrivent un protocole simple et facile pour mesurer enhancement dépendante anticorps d’infection par virus de Zika sérum convalescent à l’aide de particules virales journaliste virus de la Dengue.

Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la capacité des sérums prélevés sur des macaques rhésus infectés par le virus Zika à induire l’augmentation dépendante des anticorps de l’infection par le virus de la dengue in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à l’augmentation dépendante des anticorps de l’infection par la dengue causée par les anticorps à réaction croisée induits par le virus Zika. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est à haut troper, simple et facile à réaliser.William Valiant, un étudiant diplômé en maladies infectieuses émergentes, fera la démonstration de cette procédure dans mon laboratoire. Commencez par décongeler les échantillons de sérum à température ambiante. Une fois décongelé, transférez 100 microlitres de chaque échantillon de sérum dans un tube stérile et chauffez et activez pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius.Ensuite, effectuez des dilutions en série de 10 fois de l’échantillon de sérum allant de un à un à un mille dans un RPMI 10 froid. Transférez ensuite 10 microlitres de chaque échantillon de sérum dilué dans les puits d’une plaque stérile à fond en V de 96 puits. Ensuite, décongelez

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Source : Contreras, D., et al.. Système de culture cellulaire infectieuse pour le virus Zika et effet prophylactique in vitro des interférons. J. Vis. Exp. (2016)La vidéo montre la détection des intermédiaires d'ARNsd viraux du Zika dans des cellules épithéliales infectées par immunocytochimie. Les cellules infectées sont fixées, puis bloquées avec une solution de blocage. Les anticorps primaire et secondaire sont ajoutés. Les noyaux sont colorés avec un colorant fluorescent. L'ARNsd viral...

Détection des intermédiaires de réplication de l'ARN double brin du virus Zika par immunocytochimie

Cette vidéo présente un test permettant de mesurer l’augmentation dépendante des anticorps (ADE) de l’infection par le virus de la dengue à l’aide du sérum de convalescence du virus Zika. Le test utilise des particules virales rapporteures de la dengue (RVP) codant pour une protéine fluorescente verte. Les anticorps sériques contre le virus Zika réagissent de manière croisée avec les RVP pour former un complexe. Les anticorps liés améliorent l’absorption de la RVP par les cellules exprimant le...

Un test in vitro pour examiner l’augmentation de l’infection virale dépendante des anticorps

La vidéo présente un test in vitro pour le dépistage d’interférons ayant une activité antivirale contre le virus Zika, un agent pathogène humain. Au sein de la cellule hôte, le virus Zika se multiplie lors de l’internalisation, infectant les cellules voisines et créant des zones distinctes ou des plaques virales. L’interféron de type I, agissant comme un agent antiviral, entrave la multiplication du virus, empêchant ainsi la formation de plaques virales dans la monocouche de la cellule hôte.

Un test in vitro pour le dépistage d’interférons en tant que puissants inhibiteurs de la croissance du virus Zika

virus Zika (ZIKV), un pathogène émergent, est lié à des anomalies du développement fœtal et à la microcéphalie. La mise en place d’un système efficace de culture cellulaire infectieuse est cruciale pour les études sur la réplication du virus Zika ainsi que pour la mise au point de vaccins et de médicaments. Dans cette étude, divers tests virologiques relatifs au virus Zika sont illustrés et discutés.

Zika Virus système infectieuse Culture cellulaire et la<em&gt; In vitro</em&gt; Effet prophylactique des interférons

Courant multiplexés diagnostic pour détecter Zika, virus de la dengue et chikungunya nécessitent la préparation des échantillons complexes et instrumentation coûteuse et sont difficiles à utiliser dans des environnements peu de ressource. Nous montrons un diagnostic qui utilise l’amplification isotherme avec sondes déplaçable volet spécifique à la cible à détecter et différencier ces virus avec une spécificité et une sensibilité élevée.

L’Amplification isotherme multiplexée selon plate-forme diagnostique pour détecter Zika, Chikungunya et Dengue 1

Un protocole pour évaluer les réponses de cellules T spécifiques de l’antigène dans les organes d’immunoprivileged du Ifnar1- / - modèle murin pour l’infection de virus (ZIKV) de Zika est décrite. Cette méthode est essentielle pour étudier les mécanismes cellulaires de la protection et immunopathogenèse des vaccins ZIKV et est également précieuse pour leur évaluation de l’efficacité.

Évaluation des réponses de cellules T spécifiques du Virus Zika dans les organes Immunoprivileged des Ifnar1 infecté les souris- / -

Les auteurs décrivent une méthode pour évaluer l’effet d’immunité préexistante contre le virus de la dengue sur l’infection par le virus Zika à l’aide de sérum humain, des cellules humaines primaires et quantification de l’infection par PCR en temps réel quantitative.

Quantification de l’amélioration dépendante des anticorps du Virus dans les cellules humaines primaires Zika

Le présent protocole décrit la propagation du virus Zika (ZIKV) dans les cellules rénales de singes verts d’Afrique et la quantification du virus Zika à l’aide de méthodes d’immunodétection colorimétrique cellulaires dans des formats à 24 puits et 96 puits (haut débit).

Propagation des virus et quantification colorimétrique cellulaire

Ici, nous démontrons l’utilisation de l’impédance électrique cellulaire (CEI) comme méthode très simple et directe pour étudier l’infection par le virus Zika et sa réplication dans les cellules humaines en temps réel. En outre, le test CEI est utile pour l’évaluation des composés antiviraux.

Plateforme d’impédance électrique cellulaire pour évaluer les inhibiteurs du virus Zika en temps réel

Apprenez un protocole de cytométrie en flux simple pour évaluer l'amplification dépendante des anticorps du virus de la dengue par sérum de convalescents du virus Zika. Cette méthode haut débit facilite la recherche en virologie.

Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika (Vidéo) | JoVE Journal

Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

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