Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la capacité des sérums prélevés sur des macaques rhésus infectés par le virus Zika à induire l’augmentation dépendante des anticorps de l’infection par le virus de la dengue in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés liées à l’augmentation dépendante des anticorps de l’infection par la dengue causée par les anticorps à réaction croisée induits par le virus Zika. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est à haut troper, simple et facile à réaliser.

William Valiant, un étudiant diplômé en maladies infectieuses émergentes, fera la démonstration de cette procédure dans mon laboratoire. Commencez par décongeler les échantillons de sérum à température ambiante. Une fois décongelé, transférez 100 microlitres de chaque échantillon de sérum dans un tube stérile et chauffez et activez pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius.

Ensuite, effectuez des dilutions en série de 10 fois de l’échantillon de sérum allant de un à un à un mille dans un RPMI 10 froid. Transférez ensuite 10 microlitres de chaque échantillon de sérum dilué dans les puits d’une plaque stérile à fond en V de 96 puits. Ensuite, décongelez une, deux, trois et quatre particules virales proporteurs de la dengue dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius, en assurant un volume d’environ 170 microlitres de chaque VPR par échantillon de sérum.

Une fois décongelés, transférez immédiatement les tubes de VPR sur de la glace. Ensuite, pipetez 10 microlitres de VPR dans les puits contenant les dilutions d’échantillons de sérum dans les puits sans contrôle de sérum. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas cinq à dix fois.

Transférez la plaque à fond en V à 96 puits dans un incubateur et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius, en présence de 5 % de dioxyde de carbone. Pendant que la plaque à fond en V de 96 puits est en incubation, nettoyez la surface de l’enceinte de biosécurité avec 70 % d’éthanol et faites fonctionner la lumière UV pendant 15 minutes. Retirez ensuite de l’incubateur une fiole T-75 entièrement confluente de cellules K562.

Mélangez bien les cellules à l’aide d’une pipette stérile de cinq millimètres et transférez cinq millilitres dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Ensuite, retirez 10 microlitres de cellules du tube, mélangez avec 10 microlitres de bleu de trypan et chargez-les dans un hémocytomètre. Comptez les cellules et calculez le nombre total de cellules.

Après avoir centrifugé les cellules à 12 cents fois G pendant 10 minutes, décantez le surnageant et remettez en suspension les cellules dans du RPMI 10 chaud à une concentration de 80 mille cellules par 30 microlitres de milieu. Après avoir retiré la plaque à fond en V à 96 puits de l’incubateur, transférez 30 microlitres de cellules K562 sur chaque paroi de la plaque à fond en V à 96 puits. Et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas cinq à dix fois.

Remettez ensuite l’assiette dans l’incubateur pendant une heure. Après l’incubation, centrifugez la plaque à 12 cents fois G pendant cinq minutes. Après la centrifugation, décantez le média des puits en retournant la plaque dans un récipient contenant 10 % d’eau de Javel.

Ensuite, lavez les cellules de chaque paroi en les remettant en suspension dans 125 microlitres de RPMI 10 chaud et en centrifugeant comme précédemment. Après avoir décanté le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres de RPMI 10 chaud dans chaque puits. Mélangez de haut en bas avec la pipette et incubez la plaque pendant 48 heures à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone.

Deux jours plus tard, retirez la plaque de l’incubateur et transférez-la dans une enceinte de biosécurité. À l’aide d’une pipette multicanaux, mélangez le contenu de chaque puits et transférez-le sur une plaque à fond en U à 96 puits. Rincez chaque puits de la plaque à fond en V à 96 puits avec 100 microlitres de paraformaldéhyde à 1 % et de PBS et transférez les cellules restantes et le PBS dans les puits respectifs de la plaque à fond en U à 96 puits.

Mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette multicanaux. Couvrez la plaque de papier d’aluminium et laissez-la reposer dans l’incubateur pendant 30 minutes pour fixer les cellules. Préparez le cytomètre en flux en faisant fonctionner des cellules K562 non colorées pour calibrer les paramètres de diffusion latérale et directe à l’aide du canal éthyl-un pour la fluorescence de la GFP.

Ensuite, acquérez 30 à 50 000 cellules de chaque échantillon. À l’aide d’un logiciel d’analyse par cytométrie en flux, définissez la première porte en fonction de la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant pour inclure les cellules uniques et exclure les doublets autofluorescents de l’analyse. Calculez le pourcentage moyen de cellules GFP positives pour chaque condition, puis calculez l’augmentation du pli de l’infection pour chaque dilution sérique.

Amélioration du pliage graphique sur l’axe des y par rapport à la dilution sur l’axe des x et effectuez une analyse statistique à l’aide de l’ANOVA suivie du test post-hoc de Tukey pour les comparaisons multiples. Les données d’un animal représentatif utilisant le virus de la dengue et les particules virales rapporteures sont présentées ici. Le pourcentage de cellules GFP positives pour l’échantillon témoin sans sérum était de 0,253 %L’échantillon de sérum non dilué était de 2,58 % GFP positif.

La proportion de cellules positives à la GFP a atteint un sommet de 12,8 % à la dilution sérique de un à dix, puis à 0,735 % à une dilution de un à cent et à 0,022 % à une dilution de un à mille. L’augmentation dépendante des anticorps de l’infection par la dengue a été examinée pour les quatre types de sérums du virus de la dengue. Les données montrent que le sérum prélevé 16 semaines après l’infection a considérablement amélioré l’infection des cellules K562 par tous les types de sérums du virus de la dengue, à une dilution de un à dix.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 48 heures si elle est bien exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’acquérir les données dans les une à deux heures suivant la fin de l’étape finale de fixation de 30 minutes. N’oubliez pas que travailler avec du sérum infecté peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que les EPI et les pratiques de niveau BSL2 doivent toujours être prises lors de la mise en œuvre de cette procédure.