Criblage à haut débit siARN préjudice de cellules épithéliales de chloropicrine et cornée induite par le fluorure d’hydrogène

Cette vidéo montre nos méthodes de criblage de siRNA à haut débit dans un modèle de cellule épithéliale cornéenne de lésions toxiques. Ce travail est important, car le criblage à haut débit des siRNA est une méthode rentable et rapide pour élucider les voies et les régulateurs de la réponse cellulaire aux toxiques. Ce travail pourrait nous aider à mieux comprendre comment la cornée réagit aux agressions toxiques.

Préparez une suspension de cellules épithéliales de la cornée dans un milieu préchauffé contenant 0,5 microgramme par millilitre d’hydrocortisone dans une bouteille de milieu jetable. Faites tourner la bouteille pour suspendre uniformément les cellules et versez-la dans un réservoir sur le nid de secoueur orbital d’un manipulateur de liquide automatisé. Maintenez la suspension cellulaire sur une plaque chauffante à 37 degrés pendant le processus de placage des cellules.

À l’aide d’un manipulateur de liquides automatisé, ajoutez des cellules aux plaques à une densité de mille cellules par puits dans 70 microlitres de milieu par puits sur une plaque de 96 puits. Ensemencer un minimum de 14 plaques de 96 puits avec des cellules pour chaque plaque de bibliothèque de siRNA à étudier. Faites fonctionner l’agitateur orbital à 100 cycles par minute en permanence pendant le processus d’ensemencement et utilisez une vitesse de pipetage de 50 microlitres par seconde pour toutes les étapes.

Mélangez la suspension cellulaire à l’aide du manipulateur de liquide automatisé avant de semer la première plaque. Aspirez 140 microlitres de suspension cellulaire et distribuez 70 microlitres dans chaque puits de deux plaques de culture cellulaire. Répétez le mélange et la distribution jusqu’à ce que toutes les plaques aient été ensemencées avec des cellules.

Remplissez le réservoir de suspension de la cellule au besoin. Une fois les plaques ensemencées, retirez-les du manipulateur de liquide et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez-les dans un incubateur de culture cellulaire.

Évaluez la densité cellulaire de toutes les plaques le lendemain matin à l’aide d’un système d’imagerie automatisé, qui est logé dans l’incubateur de culture cellulaire. Exclure de l’étude les plaques dont l’intérieur n’est pas confluent entre 15 et 22 %. Transfectez les cellules 24 heures après l’ensemencement avec quatre picomoles par puits de siRNA et 0,3 microlitre par puits de réactif de transfection, comme suit.

Acquérez des plaques de bibliothèque de siRNA auprès du fournisseur, configurées pour contenir 80 cibles de siRNA par plaque avec les colonnes un et douze laissées vides. Reconstituer la plaque de la banque de siRNA avec le tampon de siRNA selon les instructions du fabricant jusqu’à une concentration finale de deux picomoles par microlitre pour chaque puits de siRNA. Effectuez toutes les transfections à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé et d’une vitesse de pipetage de 25 microlitres par seconde pour toutes les étapes.

Utilisez des boîtes de pourboire préconfigurées pour ne traiter que les puits qui seront transfectés. Utilisez la moitié supérieure de la plaque de bibliothèque pour transfecter un ensemble de six plaques répétées, appelé ensemble de plaques supérieures"Utilisez la moitié inférieure de la plaque de bibliothèque pour transfecter un ensemble différent de six répliques de plaques, appelé ensemble de plaques inférieures"Ensemble, les douze plaques constituent un ensemble complet de plaques, Et chaque plaque cellulaire contient le même ensemble de commandes. Transfectez les puits B2 à B6 de toutes les plaques avec des siRNA de pool négatifs après que tous les ensembles de plaques supérieure et inférieure ont été transfectés avec des siRNA de bibliothèque.

Transfectez également les puits B2 à B6 de deux autres plaques qui ne reçoivent pas de siRNA de bibliothèque avec des siRNA de pool négatifs. Ceux-ci serviront de témoins non exposés. Incuber toutes les plaques cellulaires dans un incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures après l’ajout des mélanges de transfection, et mélanger en tapotant doucement toutes les heures.

À l’aide d’un manipulateur de liquides automatisé, les plaques sont lavées deux fois avec un milieu préchauffé, dilué de un à cinq dans du PBS et réalimenté avec 100 microlitres par milieu bien préchauffé. Utilisez une vitesse de pipetage de 50 microlitres par seconde pour toutes les étapes. Utiliser les puits C2 à C6 comme témoins non transfectés.

Garder les puits B7 à B11 et C7 à C11 non transfectés, afin de les utiliser comme produits de contrôle et de contrôle des véhicules en cas d’exposition à des substances toxiques. 24 heures après la transfection, utiliser un manipulateur de liquide automatisé pour réalimenter les plaques. Utilisez une vitesse de pipetage de 50 microlitres par seconde pour toutes les étapes.

Aspirez 100 microlitres de chaque puits et jetez-les dans un réservoir à déchets. Réalimentez chaque puits avec 100 microlitres par puits préchauffé H-Cort.medium. Videz le réservoir de déchets au besoin.

Remplissez le réservoir avec du fluide au besoin. Deux jours après la transfection et deux heures avant l’exposition, préparer une solution de 62,5 micromolaires de cardamonine dans H-Cort. moyen et ajouter à la rangée B du réservoir de dilution à 8 rangées.

Préparez une solution à 06,25 pour cent de DMSO dans H-Cort. meduim et ajoutez-la à la rangée C du même réservoir. Le DMSO est utilisé comme contrôle du véhicule.

À l’aide du manipulateur de liquides automatisé, il faut retirer 10 microlitres de fluide des puits B7 à B11 et C7 à C11 de chaque plaque cellulaire, et les jeter dans les rangées G et H du réservoir. Assurez-vous d’utiliser des boîtes d’embouts préconfigurées pour ne traiter que les puits qui recevront les commandes positives et de véhicule, et utilisez une vitesse de pipetage de 50 microlitres par seconde pour toutes les étapes. Transférez 10 microlitres de commandes positives et de véhicules dans ces puits et mélangez trois fois.

Remettez ces plaques cellulaires dans l’incubateur. Répétez ces étapes pour toutes les plaques cellulaires supplémentaires. Effectuer toutes les opérations d’exposition aux produits chimiques dans une hotte chimique, en portant des gants doubles en nitrile, une blouse de laboratoire, des protège-manchons jetables en polyéthylène et des lunettes de sécurité.

Décontaminer les pointes et les réservoirs des pipettes qui ont été en contact avec l’acide fluorhydrique et tout acide fluorhydrique liquide contenant du gluconate de calcium à 2,5 % avant de l’éliminer dans le flux de déchets dangereux. Pour chaque plaque de bibliothèque à l’étude, préparez une solution de milieu d’acide fluorhydrique à 0,0036 % en ajoutant 288 microlitres d’acide fluorhydrique à 1 % à 80 millilitres de H-Cort préchauffé. moyen dans une bouteille de 150 millilitres.

Faites tourner la bouteille et incubez l’acide fluorhydrique dilué dans un incubateur à 37 degrés dans la hotte chimique pendant dix minutes. Ajouter la solution de milieu d’acide fluorhydrique dans un réservoir de réactif sur un réchauffeur à plaques. Effectuez l’exposition avec deux techniciens travaillant en tandem.

Demandez au technicien de droite de retirer le milieu de culture cellulaire de la plaque cellulaire à l’aide d’un pipeteur à douze canaux, puis de passer la plaque au technicien de gauche. Demandez au technicien de gauche d’ajouter 100 microlitres par puits de la solution de milieu d’acide fluorhydrique. Répétez ce processus pour toutes les plaques cellulaires qui doivent être exposées à un toxique.

Répétez également ce processus pour les plaques de contrôle non exposées, en utilisant un milieu frais au lieu de la solution d’acide fluorhydrique. Placez les plaques dans un incubateur à hotte chimique pendant 20 minutes, puis remettez-les dans l’incubateur de culture cellulaire. Répétez l’étape d’ajout du témoin positif comme indiqué précédemment, une fois que toutes les plaques ont été exposées et renvoyées dans l’incubateur de culture cellulaire.

Prélever le surnageant de culture cellulaire et évaluer la viabilité cellulaire à l’aide d’un test MTT 24 heures après l’exposition. Préparez une solution de substrat MTT de 0,5 milligramme par millilitre dans du PBS contenant 10 grammes par litre de glucose, et chaude à 37 degrés. Ajoutez la solution de substrat MTT à un réservoir sur un manipulateur de liquide automatisé.

Utilisez une vitesse de pipetage de 50 microlitres par seconde pour toutes les étapes. Préconfigurez les boîtes de pointes pour ne traiter que les puits à analyser. Utilisez le manipulateur de liquide automatisé pour aspirer 95 microlitres de fluide à partir des 60 puits intérieurs de la plaque cellulaire et déposer 42,5 microlitres dans chacune des deux plaques de stockage à 384 puits.

Ajoutez immédiatement 100 microlitres par puits de la solution de substrat MTT dans les plaques cellulaires et incubez-les à 37 degrés dans un incubateur de culture cellulaire pendant une heure. Scellez les plaques de stockage de 384 puits et stockez-les à moins 80 pour une analyse ultérieure. Répétez ce processus pour tous les jeux de plaques supérieure et inférieure et les commandes non exposées associées.

Remplissez le réservoir de substrat MTT au besoin. Réutilisez les pointes entre les répétitions si vous le souhaitez, mais lavez-les lors de l’ajout de la solution de substrat MTT et lors du passage d’un jeu de plaques à l’autre. Après l’incubation d’une heure, utilisez le manipulateur de liquide automatisé pour retirer la solution de substrat MTT des 60 puits intérieurs de chaque plaque de culture cellulaire, et remplacez-la par 100 microlitres par puits de DMSO.

Utilisez une vitesse de pipetage de 50 microlitres par seconde pour toutes les étapes et préconfigurez les boîtes d’embouts pour ne traiter que les puits à analyser. Videz le réservoir de déchets et remplissez le réservoir DMSO au besoin. Secouez les assiettes sur un agitateur d’assiettes pendant trois minutes.

Mesurez l’absorbance à 570 et 690 nanomètres, à l’aide d’un spectrophotomètre à plaques. Soustrayez l’absorbance de fond à 690 nanomètres de l’absorbance à 570 nanomètres, et faites la moyenne des valeurs de chaque groupe témoin sur la plaque non exposée. Calculez le pourcentage de viabilité en divisant les valeurs d’absorbance de chaque cible par la valeur d’absorbance moyenne des témoins non exposés.

Utilisez le pool négatif non exposé moyen pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire pour toutes les cibles. Mesurer la concentration d’IL-8 dans les surnageants de culture cellulaire à l’aide d’un test sans billes de lavage, conformément aux instructions du fabricant. Créez une disposition de plaque d’essai pour accueillir les échantillons et les étalons.

Retirez les plaques de stockage à 384 puits du congélateur à moins 80 et décongelez-les à température ambiante. Centrifugez brièvement les plaques pour recueillir l’échantillon au fond des puits. Ajoutez les billes accepteurs anti-IL-8 et l’anticorps biotinylé dans une plaque de stockage noire de 384 puits.

Ajouter le mélange billes et anticorps dans les puits prévus pour les échantillons et la courbe standard, conformément à la disposition de la plaque de test. Reconstituer l’étalon en milieu contenant 354 micromolaires de chlorure de sodium. Faites des dilutions en série doubles de la courbe standard et ajoutez-les en trois exemplaires à une autre plaque de stockage noire de 384 puits.

Utilisez un manipulateur de liquide automatisé pour effectuer le test. Utilisez des boîtes d’embouts préconfigurées pour traiter les puits en fonction de la disposition de la plaque d’essai. Utilisez une vitesse de pipetage de 50 microlitres par seconde pour toutes les étapes.

Transférez 8 microlitres du mélange bille accepteur-anticorps dans des plaques de dosage blanches à 384 puits peu profonds. Ajouter le mélange billes et anticorps dans les puits prévus pour les échantillons et la courbe standard selon la disposition de la plaque de dosage. Ensuite, transférez la courbe standard vers les puits appropriés sur les plaques d’analyse des puits peu profonds.

Ensuite, préparez une solution de chlorure de sodium de 3,54 molaires dans un réservoir peu profond. Ajustez la concentration en sel des échantillons pour qu’elle corresponde à celle de la courbe standard en transférant 4,5 microlitres de la solution de chlorure de sodium dans les échantillons dans les plaques noires de stockage à 384 puits. Mélangez les échantillons trois fois à l’aide d’un volume de mélange de 30 microlitres, puis transférez deux microlitres des échantillons sur les plaques d’analyse blanches peu profondes selon la disposition des plaques d’analyse.

Incuber pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante. Ajoutez des perles secondaires à une plaque de stockage noire de 384 puits. Ajouter les billes dans les puits destinés à être utilisés pour les échantillons et la courbe standard selon la disposition des plaques d’essai.

Transférez 10 microlitres de billes secondaires dans les puits de la plaque d’analyse blanche de puits peu profonds de 384 puits qui recevront une courbe standard ou des échantillons selon la disposition de la plaque d’essai. Lavez les pointes entre chaque assiette. Incuber encore une heure dans l’obscurité à température ambiante.

Scellez les plaques de test avec des scellés de plaque transparents et numérisez à l’aide d’un lecteur de plaque compatible avec le test à base de billes. Utilisez une distance de 0,2 millimètre entre la plaque et le détecteur, un temps d’excitation de 180 millisecondes pour le balayage et un temps de mesure de 550 millisecondes. Importez les données brutes des tests IL-8 dans une feuille de calcul.

Utilisez l’ajustement automatique de la courbe pour la courbe standard des dosages IL-8, puis convertissez les données brutes en picogrammes par millilitre pour chaque échantillon. Calculez la moyenne des six répétitions pour chaque cible. Ensuite, calculez les valeurs SSMD et la variation de pli par rapport aux témoins négatifs exposés.

Affichez les données dans un graphique à double lampe de poche, qui montre le changement de pli le long de l’axe x et le SSMD le long de l’axe y, pour chaque cible. En conclusion, nous avons développé des méthodes et des conditions de culture adaptées à l’étude de dépistage à haut débit des lésions oculaires par des substances toxiques. Nous avons prouvé l’utilité de ces méthodes en complétant le criblage primaire d’une banque de siRNA dans un modèle de lésion par l’acide fluorhydrique.

Les ensembles de données génomiques à haut débit peuvent grandement contribuer à la compréhension du rôle que jouent des gènes spécifiques dans les lésions ou les maladies, ce qui peut aider à cibler plus efficacement les études de suivi in vitro ou in vivo.