Name: Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Découvrez la respirométrie haute résolution pour mesurer la consommation d'oxygène mitochondriale dans les thorax perméabilisés de Drosophila. Cette méthode utilise moins de tissu que l'isolation classique et fournit des résultats physiologiquement pertinents pour la recherche métabolique.

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Cette étude a été financée par des subventions de la National Sciences et l’Engineering Research Council (CRSNG, subvention à la découverte) et l’Université de Moncton au NP. LHB aimerait remercier le soutien financier de l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC), la Fondation Innovation du Nouveau-Brunswick (FINB) et l’Université de Moncton. Les travaux de l’EHC sont pris en charge par la société Alzheimer du Canada, Canada de cerveau, CRSNG, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick Health Research Foundation et l’Université de Moncton.

1. préparation de réactifs
<ol><li>Préparer les solutions suivantes pour la dissection et la perméabilisation du tissu.<ol>
<li>Préparer la solution de préservation : 2,77 CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, taurine, 20 mM 15 mM phosphocréatine de2Na, imidazole de 20 mM, 0,5 mM dithiothréitol et 50 mM K-MES, pH 7.1 (peut être conservée à-20 ° C).</li>
		<li>Préparer la solution de saponine : 5 mg de saponine dans 1 mL de solution de préservation (préparer les frais du jour).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les solutions suivantes pour la mesure de la respiration.<ol>
<li>Préparer le milieu de la respiration : 120 mM KCl 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, EGTA 1 mM, 1 mM MgCl2et BSA de 0,2 % (p/v), pH 7,2.</li>
		<li>Préparer des substrats, découpleur, inhibiteurs. Dissoudre tous les substrats en H2O et dissoudre le découpleur FCCP ainsi que les inhibiteurs dans l’éthanol absolu (sauf le malonate qui se dilue dans H2O). Neutraliser la plupart des substrats et le malonate (voir Table des matières). Toutes les concentrations indiquées dans le protocole sont les concentrations finales à l’intérieur de chambres de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation et étalonnage de la respiromètre haute résolution.
<ol><li>Laver la chambres, capuchons et bouchons du respiromètre trois fois avec l’éthanol à 70 % et trois fois avec de l’eau distillée.</li>
	<li>Étalonnage à zéro de concentration en oxygène : pipette 2,3 mL de milieu de respiration dans les chambres et ajouter 10 mg de dithionite de sodium. Bien que le volume maximal de la chambre est de 2 mL, 2,3 mL sont ajoutés pour veiller à ce qu’aucune bulle d’air ne reste sous le bouchon lors de la fermeture des chambres. Fermer les chambres avec les bouchons et mesurer la concentration en oxygène pour 10-20 min. étalonner les électrodes à zéro de concentration en oxygène avec le taux de consommation d’oxygène qui en résulte.</li>
	<li>Laver les chambres avec de l’eau distillée et incuber en éthanol absolu pendant 10 min puis rincez à l’eau distillée.</li>
	<li>Calibrez à saturation de l’air : pipette 2,3 mL de milieu de respiration dans les chambres, insérez les bouchons, aspirer l’excès du milieu sur le dessus les bouchons et puis retirez les bouchons avec l’entretoise. Milieu de respiration excessive est reversé dans les chambres (volume total de 2 ml) afin d’éviter la présence de bulles d’air après la fermeture des chambres.</li>
	<li>Surveiller la consommation d’oxygène pendant 45 min à une heure, jusqu'à ce que la concentration en oxygène (trace bleue) est stable autour de 250 nM à 24 ° C.</li>
</ol>3. dissection de mouches et de perméabilisation de tissu
<ol><li>Assurez-vous que toutes les mesures sont effectuées sur la glace.</li>
	<li>Anesthésier six mouches mâles de la même souche, même âge et a grandi sur le même régime alimentaire sur la glace pour faciliter la dissection des mouches (type sauvage w1118, 15 jours, nourris sur le milieu de la semoule de maïs).</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel et pinces à pointe fine, disséquer les mouches (enlever les têtes et l’abdomen) pour garder uniquement les thoraxes contenant les muscles du vol. Cette étape peut être faite à le œil nu. Gérer les thoraxes qui en résulte avec une pince à pointe fine.</li>
	<li>Le transfert de trois thoraxes découpées dans une boîte de Pétri contenant 2 mL de solution de préservation glacée à l’aide de la pince de 25 mm.</li>
	<li>Avec la pince à pointe fine, mécaniquement permeabilize les thoraxes en insérant l’extrémité de la pince dans les thoraxes et à plusieurs reprises déchirer le tissu pour obtenir un réseau vaguement lié.</li>
	<li>Dans un plat de 24 puits, remplir deux puits avec 12,5 µL de la solution de saponine et 1 mL de solution de conservation pour obtenir une concentration finale de 62,5 µg/mL de saponine. Remplir les deux puits adjacents avec 1 mL de milieu de respiration.</li>
	<li>Avec la pince à pointe fine, transférer trois perméabilisées thoraxes dans la solution diluée de saponine et incuber en agitant le mélange doux dans un agitateur orbital, sur la glace, pendant 20 min.</li>
	<li>Après l’incubation de ce dernier, transférer les fibres dans les puits adjacents remplis d’agitation légère, sur la glace, pendant 5 min à rincer la saponine, au milieu de la respiration.</li>
</ol>4. détermination de la masse sèche
<ol><li>Sécher les perméabilisées thoraxes sur une surface absorbante et flip 3 - 4 fois à l’aide de la pince à pointe fine pour s’assurer que toute l’humidité est enlevée.</li>
	<li>Peser les trois thoraxes ensemble sur une microbalance. Notez le poids obtenu car il sera utilisé pour normaliser les taux de consommation d’oxygène mitochondriale.</li>
	<li>Transférer les tissus immédiatement dans une goutte de milieu de respiration sur la glace.</li>
</ol>5. détermination de taux consommation d’oxygène
<ol><li>Ouvrez les chambres du respiromètre (enlever les bouchons) et ajouter 10 mM du pyruvate et de 2 millimètres de malate dans chaque chambre.</li>
	<li>Ajouter les tissus perméabilisées directement dans les salles remplies avec le milieu de la respiration.</li>
	<li>Remplacer les bouchons à l’aide de l’entretoise.</li>
	<li>Avec une seringue de 60 mL, recueillir de l’oxygène directement depuis un réservoir d’oxygène et injecter 2 à 5 mL de l’oxygène à travers le capillaire bouchon de chaque chambre pour s’assurer que la diffusion de l’oxygène à travers le tissu ne limitera pas la consommation d’oxygène.</li>
	<li>Insérer une seringue de Hamilton dans le capillaire de chaque bouchon pour s’assurer que les thoraxes restent dans la salle.</li>
	<li>Fermer les chambres complètement lorsque la concentration en oxygène est environ de 400 nM, atteindre des niveaux d’oxygène au-dessus de saturation de l’air (environ 160 % saturation d’air) à l’intérieur des chambres.</li>
	<li>Arrêtez et redémarrez les agitateurs pour vérifier les bulles d’air dans les chambres.</li>
	<li>Indiquer la masse de tissu pesé auparavant pour normaliser les taux de respiration par la masse de tissu (mg), affichage de consommation d’oxygène spécifique à la masse (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 du tissu).</li>
	<li>Une fois que la consommation d’oxygène est stabilisée (trace rouge), ajouter 5 mM ADP avec une seringue de Hamilton.</li>
	<li>Après chaque injection, rincer la seringue avec de l’eau distillée, éthanol à 70 % et à nouveau de l’eau distillée.</li>
	<li>Une fois que la consommation d’oxygène est à nouveau stable, injecter 5 µL de 4 mM du cytochrome c.</li>
	<li>Aller de l’avant pour les injections séquentielles des substrats suivants pour évaluer la consommation d’oxygène mitochondriale à différentes étapes de l’ETS :<ol>
<li>Ajouter 5 µL d’une Proline 2 M.</li>
		<li>Ajouter 10 µL d’un succinate de 1 M.</li>
		<li>Ajouter 30 µL d’un 1 M glycérol-3-phosphate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecter le découpleur, FCCP, d’une manière de titrage par pas de 0,5 à 1 µM (2 µL d’une solution de 1 mM) jusqu'à ce que la concentration optimale est atteinte, c'est-à-dire la concentration pour atteindre la plus haut possible sans inhibition de consommation d’oxygène (attention : voir Table des matériaux).</li>
	<li>Injecter les inhibiteurs suivants dans l’ordre pour empêcher entièrement le flux d’électrons dans le SCEQE afin de mesurer la consommation d’oxygène résiduel (ROX) c'est-à-dire non respiratoires réactions comme réactions oxygénase entre autres :<ol>
<li>Ajouter 1 µL d’une roténone 1 mM (attention : voir Table des matières).</li>
		<li>Ajouter 5 µL d’un malonate de 2 M (attention : voir Table des matières).</li>
		<li>Ajouter 1 µL d’une 5 mM l’antimycine A (attention : voir Table des matières).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter ascorbate de 0,2 mM et 0,5 mM TMPD séquentiellement dans les chambres, à partir de l’ascorbate pour mesurer la consommation d’oxygène par le complexe IV.</li>
	<li>Ajouter 20 mM de l’azide de sodium inhibe le complexe IV (attention : voir Table des matières).</li>
	<li>Dès que le signal est stable, ouvrir des chambres avec l’entretoise, ré-oxygéner les chambres par l’injection de 2 mL de l’oxygène pur et fermer les chambres lorsque la concentration est autour de 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Mesurer le signal pendant 10-15 min et calculer le fond chimique, c'est-à-dire la consommation d’oxygène en raison de l’autoxydation TMPD.</li>
</ol>6. nettoyage de la respiromètre
<ol><li>Après les mesures, rincez les chambres avec de l’eau distillée une fois et rincer les chambres trois fois dans l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Incuber dans l’éthanol absolu pendant 10 min inactiver les inhibiteurs.</li>
	<li>Rincer trois fois avec de l’eau distillée, remplissez les compartiments 70 % d’éthanol et remplacer les bouchons et les bouchons jusqu'à la prochaine utilisation.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, on décrit une méthode pour la préparation de l’échantillon avant la mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale chez la drosophile. Cette méthode a été développée pour résoudre les différents problèmes liés aux protocoles utilisant des isolations mitochondriales, notamment en termes de durée et nombre de personnes requis. Au lieu de travailler avec des isolations mitochondriales habituellement nécessitant une grande quantité de tissus obtenus à partir de plusieurs individus, cette expérience est ...

La drosophile, Drosophila melanogaster, a servi comme un organisme modèle pour la recherche génétique pour plus d’un siècle1. L’étude de cet organisme n’a pas seulement permis d’importantes connaissances fondamentales sur la cellule sort dosage4, le développement du système nerveux et mutation taux3, hérédité liée au sexe2, mais a aussi récemment émergé comme un outil précieux pour étudier les mécanismes inhérents à plusieurs maladies comme l’Alzheimer et Parkinson5,6. En outre, c’est un modèle populaire pour étudier le processus de vieillissement, car ils peuvent être déclenchés en grand nombre sur une courte période de temps et ont une durée de vie courte. Ils possèdent également des structures homologues d’organes humains, tels que les cellules (équivalents à des cellules β pancréatiques), productrices d’insuline, des corps gras (fonctionnement de même que le tissu adipeux blanc et foie), oenocytes (cellules hépatocytes), un cœur ainsi que la hémolymphe transportant des métabolites (analogue au sang des vertébrés)7. En outre, les voies centrales du métabolisme intermédiaire (y compris la voie de signalisation comme facteur de croissance analogue à l’insuline/insuline et les voies de la cible de la rapamycine-TOR) sont également hautement conservée7. Pour ces raisons, drosophile ont récemment été exploités pour décrire les mécanismes fondamentaux qui régissent le métabolisme, en particulier dans les pathologies inhérentes aux maladies métaboliques comme le diabète8. Une composante importante du métabolisme est la mitochondrie qui intègre de multiples voies et effectue l’une des plus importantes fonctions biologiques de la vie, la production d’ATP, par l’intermédiaire du processus de la phosphorylation oxydative (OXPHOS). Compte tenu de leur rôle central dans le métabolisme de l’organisme, il n’est pas surprenant que les dysfonctions mitochondriales sont impliquées dans de nombreuses maladies comme la maladie de Parkinson9 et Alzheimer maladies10, ainsi que dans la sclérose latérale amyotrophique 11 , 12. ils sont également déterminants fondamentaux du vieillissement. En effet, ils sont les principaux producteurs de reactive oxygen species (ROS) dans la cellule, qui peut être préjudiciable à la cellule à haute concentration à travers les dommages oxydatifs11. Vieillissement a été également associée à l’accumulation d’endommagés ou muté mitochondrial DNA13, mitophagy dysfonctionnements14,15 ainsi que de déficience de la biogenèse mitochondriale,16. Les mitochondries sont également des facteurs déterminants de l’homéostasie de la cellule qu’ils peuvent utiliser différents substrats pour ajuster plusieurs fonctions cellulaires selon l’abondance ou la rareté des macronutriments17,18.
En effet, les différents nutriments dans l’alimentation (glucides, lipides et protéines) sont digérés, absorbés et transportés dans les cellules. Ils sont ensuite transformés dans le cytosol, et les substrats dérivées sont transportés dans la matrice mitochondriale où elles produisent des équivalents réducteurs, comme le NADH et FADH219. Ces équivalents réducteurs sont ensuite oxydés par différents complexes enzymatiques du système de transport d’électrons (ETS). Ces complexes sont incorporées dans la membrane interne mitochondriale, tels que les complexes I et II complexe. En outre, autres complexes enzymatiques tels que le glycérol-3-phosphate déshydrogénase mitochondriale et la proline déshydrogénase représentent des voies alternatives pour l’entrée des électrons dans les ETS20,21. Ces complexes « alternatives » sont particulièrement importantes chez les insectes, comme selon les espèces, ils peuvent participer activement afin d’augmenter la respiration20,22,23,21. Électrons de ces ETS systèmes d’alimentation sont transférés à l’ubiquinone et par la suite au complexe III, puis à complexe IV, jusqu'à ce que l’accepteur final, l’oxygène moléculaire. Ce transfert d’électrons génère une force proton-motrice à travers la membrane mitochondriale interne conduite la phosphorylation de l’ADP en ATP au complexe V (Figure 1). Considérant le rôle central des mitochondries dans l’homéostasie de la cellule, étudier le métabolisme mitochondrial en utilisant le modèle pertinent d. melanogaster représente un outil puissant pour délimiter les mécanismes sous-jacents de divers physiopathologiques conditions ou soumis à des contraintes environnementales et cellulaires. Curieusement cependant, seulement une poignée d’études réellement mesurées la respiration mitochondriale dans drosophile24,25,26. En effet, les expériences visant à évaluer la consommation d’oxygène mitochondriale exigent l’isolement des mitochondries. Même si c’est avantageux pour la mesure des différentes fonctions mitochondriales (telles que la production de ROS ou ratio P/O comme marqueur mitochondrial efficacité27,28), ces cas requièrent généralement assez grandes quantités des tissus provenant de plusieurs individus24,29. Cette exigence de grandes quantités de tissus et d’individus est un facteur limitant important, surtout si l'on considère que tous les individus soient du même âge et de préférence du même sexe pour les expériences, faire de la mesure de la respiration à différents temps pointe laborieux au mieux. En outre, alors que des isolations mitochondriales peuvent fournir la perspicacité significative sur les mécanismes fondamentaux qui régissent le métabolisme mitochondrial, les méthodes utilisées pour isoler les mitochondries ont plusieurs inconvénients tels que la difficulté d’obtenir des résultats reproductibles , perturbation du réseau mitochondrial et altération mitochondriale structure et la fonction29,30,31.
Le but de cette étude est de présenter un protocole robuste pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale chez la drosophile en utilisant seulement une quantité minimale de tissu de très peu d’individus. Ce protocole consiste à mesurer l’oxygène mitochondriale consommation in situ utilisant des fibres musculaires perméabilisées29 de thoraxes de la drosophile en combinaison avec haute résolution respirométrie32,33, 34 , 35. cette méthode a également des avantages supplémentaires par rapport à la méthode d’isolement mitochondrial classique étant donné que les interactions avec les autres composants de la cellule aussi bien comme mitochondriale de structure et de fonction sont plus préservés dans perméabilisées fibres29,31,36, qui rend cette approche plus physiologiquement pertinents. Avec ce protocole, fonctions mitochondriales peuvent être précisément évaluées à l’aide de respirométrie haute résolution en seulement trois thoraxes de la drosophile, avec des substrats permettant la détermination de la consommation d’oxygène à plusieurs étapes différentes de l’ETS. Par conséquent, ce protocole pourrait aider à répondre à des questions clés sur les mécanismes fondamentaux qui contrôlent le métabolisme dans le cadre de nombreuses conditions environnementales ou pathophysiologiques en tirant parti du modèle drosophile.
Pour mesurer la consommation d’oxygène à plusieurs étapes différentes de l’ETS et évaluer comment différents substrats contribuent à la respiration, les différents substrats (Figure 1), les découpleur et inhibiteurs sont utilisés30 Après perméabilisation de la tissus. Plus précisément, ajouts séquentielles de différents substrats sont effectuées afin de stimuler l’entrée des électrons à travers différents complexes de l’ETS. Un découpleur, carbonyl cyanide 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), est alors ajouté à une concentration optimale pour mesurer la respiration non couplés, c'est-à-dire la respiration non-phosphorylation stimulée à consommation maximale d’oxygène. Inhibitions séquentielles des complexes qu'i, II et III sommes ensuite effectuée afin de surveiller la consommation d’oxygène résiduel qui est due à des réactions d’oxydation non-ETS. Enfin, capacité de respiration maximale complexe IV peut être évaluée par l’injection de N, N, N «, N, - tétraméthyl - p-phénylènediamine (TMPD), un fournisseur d’électrons artificiels et l’ascorbate. Il est important de noter que les expériences sont menées à 24 °C, puisque c’est la température à laquelle les mouches sont déclenchés.

<table><tbody><tr><td>Respiromètre haute résolution Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche</td><td>10022-02</td><td>Kit de respiromètre Startup O2K &nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de titrage O2K&nbsp ;</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche</td><td>20820-03</td><td>Seringues Hamilton de différents volumes </td></tr><tr><td>Logiciel Datlab</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Autriche</td><td>20700</td><td>Logiciel pour l’acquisition et l’analyse de données </td></tr><tr><td>Pince antimagnétique à pointe fine</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td> </td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Göttingen, Allemagne</td><td></td><td>Balance semi-micro (distribuée par plusieurs sociétés)&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster type sauvage w1118</td><td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA<br</td><td></td><td>/> Condition de stockage : 24 &deg ; C</td></tr><tr><td>Éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther )-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA Conditions de stockage : RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>ATTENTION : corrosif pour les métaux, toxicité aiguë, corrosion cutanée, lésions oculaires graves, toxicité aquatique aiguë. Condition de stockage : RT</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td> Conditions de stockage : RT</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383<</td><td>br/> Conditions de stockage : -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td> Conditions de stockage : RT</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td> Conditions de stockage : RT</td></tr><tr><td>Na2Phosphocréatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td> Conditions de stockage : -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td> Condition de stockage : RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td> Condition de stockage : 2-8 &deg ; C</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td> Conditions de conservation : RT</td></tr><tr><td>Saponine d’écorce de quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponine Conditions de conservation : RT Préparation de la solution : 5 mg dans 1 mL de solution de conservation. Préparez des produits frais tous les jours.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td> État de stockage : RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td> État de stockage : RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td> État de stockage : RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470<</td><td>br/> État de stockage : 2-8 &deg ; C</td></tr><tr><td>Na2S2O4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Dithionite de sodium. ATTENTION : substances et mélanges auto-échauffants, toxicité aiguë, toxine aquatique aiguë toxicité aquatique chronique. Conditions de stockage : RT</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Pyruvate Conditions de stockage : 2-8 &deg ; C Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Préparez des produits frais tous les jours.</td></tr><tr><td>Acide L-(-)-malique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malate Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec du KOH et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Adénosine 5'-diphosphate monopotassique hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP Conditions de stockage : -20 &deg ; C Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec du KOH et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Cytochrome c du cœur équin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>Cytochrome c Condition de stockage : -20 &deg ; C Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Proline Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Succinate de sodium dibasique hexahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Succinate Conditions de conservation : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec HCl et stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>sn-Glycérol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) sel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Glycérol-3-phosphate Condition de stockage : -20 &deg ; C Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec du HCl et stocker à -80 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP. ATTENTION : toxicité aiguë, sensibilisation cutanée, toxicité aquatique chronique. Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’éthanol absolu. Conserver dans des flacons en verre à -20 °C.</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>ATTENTION : toxicité aiguë, irritation cutanée, irritation oculaire, toxicité pour certains organes cibles (système respiratoire), toxicité aquatique aiguë, toxicité aquatique chronique. Solution Préparation : Dans l’éthanol absolu. Conserver dans des flacons à l’abri de la lumière à -20 °C.</td></tr><tr><td>Acide malonique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonate. ATTENTION : toxicité aiguë, lésions oculaires graves. Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Neutraliser avec du KOH. Préparez des produits frais tous les jours.</td></tr><tr><td>Antimycine A de Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycine A. ATTENTION : toxicité aiguë, toxicité aquatique aiguë, toxicité aquatique chronique. Conditions de stockage : -20 &deg ; C Préparation de la solution : Dans de l’éthanol absolu. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyl-p-phénylènediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver dans des flacons sombres à&nbsp ; -20 &°C.</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Ascorbate Conditions de stockage : RT Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver dans des flacons sombres à&nbsp ; -20 &°C.</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Azoture de sodium. ATTENTION : toxicité aiguë (orale et cutanée), toxicité pour certains organes cibles (cerveau), toxicité aquatique, toxicité aquatique chronique. Préparation de la solution : Dans de l’eau MilliQ. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr></tbody></table>

mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

La drosophile, Drosophila melanogaster, représente un nouveau modèle pour l’étude du métabolisme. En effet, drosophile possèdent des structures homologues aux organes humains, de posséder des voies métaboliques hautement conservées et ont une durée de vie relativement courte qui permet l’étude des mécanismes fondamentaux différents dans un court laps de temps. Toutefois, il est surprenant que l’un des mécanismes essentiels pour le métabolisme cellulaire, la respiration mitochondriale, n’a pas été soigneusement étudié dans ce modèle. C’est probablement parce que la mesure de la respiration mitochondriale chez la drosophile nécessite généralement un très grand nombre de personnes et les résultats obtenus ne sont pas très reproductibles. Nous décrivons ici, une méthode qui permet la mesure précise de la consommation d’oxygène mitochondriale en utilisant des quantités minimales de tissus de drosophile. Dans cette méthode, les thoraxes sont disséqués et perméabilisées mécaniquement avec une pince forte tant chimiquement avec saponine, permettant à différents composés de traverser la membrane cellulaire et moduler la respiration mitochondriale. Après perméabilisation, un protocole est effectué afin d’évaluer la capacité des différents complexes du système de transport d’électrons (ETS) pour oxyder les différents substrats, ainsi que leur réponse à un découpleur et à plusieurs inhibiteurs. Cette méthode présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes utilisant des isolations mitochondriales, car il est plus physiologiquement pertinente parce que les mitochondries sont toujours en interaction avec les autres composants cellulaires et la morphologie mitochondriale est conservée. En outre, préparation de l’échantillon est plus rapides, et les résultats obtenus sont très reproductibles. En combinant les avantages de la drosophile comme modèle pour l’étude du métabolisme avec l’évaluation de la respiration mitochondriale, important de nouvelles connaissances peuvent être dévoilés, surtout quand les mouches connaissent différents environnement ou physiopathologiques conditions.

Une trace représentative de la consommation d’oxygène mitochondriale en utilisant le protocole décrit ci-dessus est fournie à la Figure 2. Le pyruvate et le malate injecté dans les chambres ainsi que les fibres musculaires perméabilisées sont désignés à la respiration CI-fuite, c'est-à-direlorsque le complexe I de l’ETS est stimulée par le NADH produit par oxydation du pyruvate et le malate via le cycle des acides tricarboxyliques (CI). Au cours de c...

Dans cet article, on décrit une méthode pour mesurer la consommation d’oxygène à l’aide de respirométrie haute résolution en thoraxes perméabilisées de drosophile. Cette technique nécessite une quantité minimale de tissu par rapport à la technique d’isolement mitochondrial classique et les résultats obtenus sont plus physiologiquement pertinents.

Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer la respiration mitochondriale chez la mouche commune des fruits, Drosophila Melanogaster, à l’aide de la respirométrie à haute résolution. Ceci est réalisé en disséquant d’abord la drosophile, pour recueillir le thorax. Les thoraces contenant les muscles de vol sont ensuite soigneusement perméabilisées mécaniquement, à l’aide de pinces tranchantes, et incubées avec de la saponine, pour une perméabilisation supplémentaire. Les thoraces sont ensuite transférées dans les chambres d’un respiromètre, et la consommation d’oxygène mitochondriale est mesurée à l’aide d’une combinaison de différents substrats, découpleurs et inhibiteurs. Bonjour, je m’appelle Chlo

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Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l'ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries...

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

Les méthodes présentées fournissent des instructions étape par étape pour la réalisation d’une collection de tests respiratoires basés sur des microplaques utilisant des mitochondries isolées à partir de quantités minimales de muscle squelettique de souris. Ces tests sont capables de mesurer les changements/adaptations mécanistes de la consommation d’oxygène mitochondrial dans un modèle animal couramment utilisé.

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Haute résolution de respirométrie est utilisé pour déterminer la consommation d'oxygène des mitochondries. Cette technique est simple de déterminer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) de la fréquence respiratoire, la capacité maximale du système de transport d'électrons mitochondriale, et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

L’analyse de la relation structure-fonction mitochondriale est nécessaire pour une compréhension approfondie des mécanismes de régulation de la fonctionnalité mitochondriale. Des méthodes spécifiques pour étudier la structure et la fonction mitochondriales dans les ovaires de drosophile vivants et fixes sont décrites et démontrées dans cet article.

Étudier mitochondrial Structure et fonction Drosophila ovaires

Nous présentons un protocole permettant de mesurer la consommation d’oxygène et l’acidification extracellulaire dans le cerveau larvaire et adulte de Drosophila melanogaster . Un analyseur métabolique est utilisé avec un protocole adapté et optimisé. Micro-tissu restrictions sont un élément essentiel du présent protocole et ont été conçues et créées spécialement pour leur utilisation dans cette analyse.

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La respiration mitochondriale est critique pour la survie de l’organisme ; par conséquent, le taux de consommation d’oxygène est un excellent indicateur de la santé mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un respiromètre commercialement disponible pour mesurer basale et taux de consommation maximale d’oxygène en vivent, intact et librement mobiles Caenorhabditis elegans.

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La respirométrie à haute résolution couplée à des capteurs de fluorescence détermine la consommation mitochondriale d’oxygène et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Le présent protocole décrit une technique pour évaluer la fréquence respiratoire mitochondriale et la production de ROS dans le nerf sciatique perméabilisé.

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Cet article décrit une méthode d’évaluation des interactions et des assemblages de protéines membranaires intégrales in vitro avec divers facteurs partenaires dans un environnement lipido-proximal.

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Découvrez la respirométrie haute résolution pour mesurer la consommation d'oxygène mitochondriale dans les thorax perméabilisés de Drosophila. Cette méthode utilise moins de tissu que l'isolation classique et fournit des résultats physiologiquement pertinents pour la recherche métabolique.

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Mesure de la consommation d’oxygène mitochondriale dans les fibres perméabilisées de la drosophile à l’aide de petites quantités de tissu

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