RNA liste déroulante procédure pour identifier les cibles ARN d’un ARN Long Non codantes

L’objectif global de cette procédure est d’identifier dans des cellules cultivées ou dans des tissus, les partenaires moléculaires de l’ARN d’un ARN long non codant d’intérêt. Cette méthode peut aider à déchiffrer les fonctions biologiques d’un ARN long non codant en fournissant de nouvelles connaissances significatives sur la régulation de l’ARN par les ARN longs non codants. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle est utilisable pour la plupart des applications puisque nous l’avons optimisée, d’abord pour plusieurs ARN longs non codants et ensuite pour les cellules cultivées et les extraits de tissus.

Notre méthode est basée sur le mélange de deux méthodes précédentes, le ChIRP, qui signifie Chromatin Isolation by RNA Purifications, et le CHART, qui est l’analyse de capture et d’hybridation des cibles d’ARN. La spécificité de notre méthode est que les sondes oligonucléotidiques ont été conçues à l’aide de la modélisation bioinformatique d’une structure secondaire d’un long ARN non codant et que son objectif était d’identifier les cibles de l’ARN. Deux techniciennes de mon équipe, Bénédicte Boyer et Séverine Guillen, feront la démonstration de la procédure.

Après avoir cultivé des cellules GH4C1 selon le protocole textuel, retirez le milieu d’une plaque de culture cellulaire et utilisez un volume de PBS pour rincer les cellules. Ajouter 10 millilitres de 1 % de PFA dans du PBS pour fixer les cellules. Ensuite, réticulez les cellules sous agitation à température ambiante pendant 10 minutes.

Éteignez l’action PFA en ajoutant 1 millilitre de glycine 1,25 molaire et agitez l’échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, jetez la solution par aspiration et utilisez 10 millilitres de PBS pour rincer la plaque deux fois pendant cinq minutes chacune. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS, utilisez un grattoir à cellules pour collecter les cellules et transférez-les dans un tube à centrifuger.

Faites tourner l’échantillon à 510 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, retirez autant de surnageant que possible et stockez les granulés indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Pour effectuer une réticulation tissulaire, immergez cinq milligrammes de tissu de glande pituitaire de souris fraîchement obtenu dans un volume 10X de 1 % de PFA dans du PBS et agitez l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes.

Trempez le PFA en ajoutant 0,05 millilitre de solution de glycine à 1,25 molaire et agitez le tissu à température ambiante pendant cinq minutes. Aspirez le milieu et utilisez 0,5 millilitre de PBS pour rincer le tissu deux fois. Après avoir retiré autant de surnageant que possible, stockez le tissu réticulé indéfiniment à moins 80 degrés Celsius.

Préparez le tampon de lyse puis lysez les échantillons sans décongélation préalable. Utilisez le tampon pour remettre les échantillons en suspension dans environ un millilitre par 100 milligrammes de pastille cellulaire ou de tissu. Placez les échantillons lysés dans un bain-marie à quatre degrés Celsius et commencez la série de sonications optimisée selon le protocole de texte.

Immédiatement après la sonication, centrifuger les échantillons à 12 000 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, transférez les surnageants dans de nouveaux tubes. La série de sonications doit être optimisée pour être suffisamment efficace pour réduire la viscosité de l’ADN sans obtenir d’autres ARN fragmentés.

Pour effectuer l’hybridation sur les échantillons soniqués, ajoutez deux volumes de tampon d’hybridation dans les tubes et le vortex. Transférez 20 microlitres de chaque échantillon dans des tubes à centrifuger et conservez-le à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez 100 picomoles de sondes oligonucléotidiques biotinylées à chaque échantillon.

Ensuite, incubez les échantillons sous une agitation modérée sur un rotateur de tube à température ambiante pendant quatre à six heures. Après l’incubation, ajoutez aux échantillons 50 microlitres de billes de streptavidine magnétiques complétées par 200 unités par millilitre d’une solution d’inhibiteur de la RNase et un cocktail d’inhibiteur de protéase de 5 microlitres par millilitre. Incuber les tubes à température ambiante sous une agitation modérée sur le rotateur de tubes pendant la nuit.

Le lendemain, effectuez l’isolement de l’ARN en plaçant les tubes sur un support magnétique et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 900 microlitres de tampon de lavage dans les billes et placez les tubes sur un rotateur à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, placez les échantillons sur l’aimant, jetez le tampon et répétez le lavage cinq fois.

Après avoir retiré le lavage final, ajoutez 95 microlitres de tampon Proteinase K et cinq microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase-K à l’échantillon. Ensuite, sur de la glace, décongelez les échantillons d’entrée et ajoutez 75 microlitres de tampon Proteinase K et cinq microlitres de protéinase-K. Incuber les échantillons à 50 degrés Celsius pendant 45 minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Réfrigérez les échantillons sur de la glace pendant trois minutes, puis placez-les sur l’aimant et récupérez le surnageant contenant les ARN et jetez les billes. Utilisez un kit de purification d’ARN pour purifier les ARN. Enfin, stockez les ARN à moins 80 degrés Celsius et effectuez des RT et qPCR et construisez des banques d’ADN selon le protocole texte.

Sur la base de la modélisation bioinformatique de la structure secondaire de lncRNA illustrée ici, les sondes ont été conçues contre deux lncRNA, des rats Neat1 ou Malat1 pour des cellules cultivées GH4C1 et des souris Neat1 pour des extraits de tissu hypophysaire. L’enrichissement relatif de Neat1 ou Malat1 a été calculé pour les sondes non spécifiques et spécifiques par rapport aux échantillons d’entrée. Cette figure montre l’efficacité des sondes spécifiques pour extraire Neat1 dans la lignée cellulaire hypophysaire GH4C1 du rat et dans des extraits de tissu hypophysaire de souris.

Lorsque le protocole pour des oligonucléotides spécifiques ou des sondes SO a été dirigé vers Malat1, une sonde efficace a été générée ainsi qu’une sonde inefficace qui a été éliminée. Après l’extraction de l’ARN et la RT qPCR, les ARN associés à Neat1 dans les extraits de cellules GH4C1 ont également été associés à Neat1 dans les extraits de tissu hypophysaire. En effet, après l’extraction de l’ARN de Neat1, il a été constaté que Malat1 était ciblé par Neat1 à la fois dans la lignée cellulaire GH4C1 et dans les extraits de tissu de souris hypophysaires.

De plus, Neat1 a été significativement enrichi après qu’une extraction de l’ARN Malat1 ait été effectuée avec la sonde dans des cellules GH4C1. La relation étroite identifiée entre les deux ARNlnc est cohérente avec le rôle co-régulateur potentiel de Neat1 et Malat1, suggéré par des souris knock-out de Malat1 qui présentent des variations dans l’expression de l’ARN de Neat1. Une fois maîtrisée, cette technique permet en deux ou trois jours de capturer les cibles ARN d’un ARN long non codant souhaité.

Avec l’approche bioinformatique, il est important de concevoir plusieurs sondes anti-sens, puis de comparer expérimentalement leur efficacité, car l’efficacité de la sonde peut être altérée par les préparations de lysat cellulaire. Suite à cette procédure, un séquençage d’ARN à haut débit peut être effectué afin de fournir l’intégralité de l’interactome d’ARN d’un ARN long non codant d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de capturer les partenaires d’ARN d’un ARN non codant long à l’aide de sondes spécifiques efficaces qui s’hybrident avec les régions disponibles de l’ARN non codant long, telles que déterminées par la modélisation bioinformatique de sa structure secondaire.