Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

L’objectif global de l’administration intraspinale de virus adéno-associés recombinants est de permettre le marquage histologique et la manipulation fonctionnelle de neurones génétiquement définis dans la moelle épinière dorsale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la douleur, telles que les circuits neuronaux nécessaires à la perception des différentes modalités de douleur. Le principal avantage de cette technique est que les neurones génétiquement marqués peuvent être manipulés d’une manière spécialement restreinte et temporellement contrôlée.

Localisez la paire de côtes la plus caudale en palpant le long de la colonne vertébrale de la souris anesthésiée. Ensuite, faites une coupe longitudinale de 1,5 à 2,5 centimètres dans la peau, en commençant par la paire de côtes rostrales à la paire de côtes la plus caudale. Soulevez la peau à l’aide d’une pince et détachez-la du muscle sous-jacent à l’aide de ciseaux.

Tout au long de la chirurgie, gardez les tissus exposés humides avec du chlorure de sodium stérile à 0,9 %. À l’aide d’une pince fine et de petits ciseaux, faites une incision dans la couche membraneuse la plus mince, juste à côté de la ligne médiane, et coupez-la loin des apophyses épineuses. Plusieurs repères anatomiques peuvent aider à identifier les bonnes vertèbres à cibler.

Nous décrivons ici trois alternatives. Palper le long de la colonne vertébrale. La paire de côtes la plus caudale est située juste rostrale par rapport aux vertèbres T13 et l’os pelvien au niveau de la hanche est au niveau des vertèbres L6.

Vous pouvez également tirer la peau vers la queue pour exposer la crête iliaque. Au même niveau, la paire de ligaments intertransverses la plus visible rejoint le processus rachidien L6. Comptez à rebours dans le sens caudal à rostral pour identifier les vertèbres d’intérêt.

Sinon, localisez l’endroit où le tendon le long du côté de la colonne vertébrale est le plus blanc et le plus médial. Les vertèbres T13 sont situées juste rostrales. Le segment L4 de la moelle épinière lombaire est situé à l’intérieur de cette vertèbre.

Ensuite, placez l’animal sur un coussin de tissus enroulés pour l’élever jusqu’aux pinces vertébrales du cadre stéréotaxique. Alignez les pinces adjacentes aux vertèbres cibles. Fixez une pince en position, puis maintenez la colonne vertébrale avec une pince Adson tout en fixant la deuxième pince.

Confirmez le bon serrage en appuyant soigneusement sur les vertèbres ciblées. Ensuite, retirez le muscle paraépineux au-dessus des vertèbres d’intérêt. Tout d’abord, faites une incision juste médiale aux tendons parallèlement à la colonne vertébrale.

Ensuite, faites des incisions perpendiculaires rostrales et caudales aux vertèbres cibles. Ensuite, utilisez des rongeurs pour déchirer ou couper le muscle parasépineux au-dessus des vertèbres d’intérêt. Utilisez des pinces au besoin pour retirer le tissu restant sur les vertèbres ou au-dessus de la dure-mère dans l’espace intravertébral.

Le vaisseau sanguin dorsal devrait maintenant être visible, marquant la ligne médiane de la moelle épinière. Pour les injections unilatérales, effectuez une laminectomie partielle à l’aide d’une perceuse de dentiste fine équipée d’un cutter sphérique de 0,5 millimètre pour percer très soigneusement un trou au milieu du côté cible des vertèbres. Retirez tous les fragments d’os restants avec une aiguille biseautée de calibre 26 pour exposer la moelle épinière.

Utilisez l’aiguille pour perforer la dure-mère dans les espaces intravertébraux rostrals et caudaux jusqu’aux vertèbres cibles, à environ 300 microns latéralement du vaisseau sanguin dorsal. Ensuite, perforez la dure-mère sous le trou percé. À ce stade, le liquide céphalo-rachidien devrait s’échapper des trous et la moelle épinière devrait être légèrement bombée.

Préparez la seringue d’injection en montant d’abord le capillaire en verre sur une seringue d’un microlitre. Serrez fermement l’écrou pour assurer un ajustement serré et sûr. Remplissez la seringue d’un microlitre avec de l’eau distillée stérile, puis appuyez sur le piston.

Si l’eau n’est pas facilement expulsée de la pointe, la micropipette est probablement bloquée et doit être remplacée. Montez la seringue sur un micromanipulateur connecté à un micro-injecteur à commande électronique. Ensuite, utilisez le micro-injecteur pour aspirer environ un microlitre d’air pour séparer l’eau et le virus.

Ensuite, pipetez une gouttelette de 2,5 microlitres de solution virale diluée sur un morceau de film de paraffine. Déplacez avec précaution l’extrémité de la micropipette dans la gouttelette à l’aide du cadre stérotaxique et aspirez-la vers le haut dans la micropipette. Ensuite, appuyez sur dispense jusqu’à ce qu’une goutte de solution virale émerge à l’extrémité.

Rétractez la seringue et utilisez un stylo pour marquer la micropipette avec une échelle permettant de surveiller le volume distribué. À l’aide du bras stéréotaxique, déplacez la pointe de la micropipette sur l’un des trous de la dure-mère, puis vers le bas jusqu’à ce qu’une légère dépression apparaisse à la surface de la moelle épinière exposée. Pour cibler l’injection dans la corne dorsale de la colonne vertébrale, déplacez la pointe vers le bas à une profondeur de 500 microns par incréments de 100 microns, puis vers le haut de 200 microns pour permettre la stabilisation mécanique du tissu.

La profondeur finale de la pointe est de 300 microns. Après avoir programmé la pompe pour injecter 300 nanolitres à une vitesse d’injection de 50 nanolitres par minute, appuyez sur le bouton de démarrage pour commencer l’infusion. Une fois l’injection terminée, vérifiez l’échelle sur la micropipette pour voir si le niveau de virus a chuté.

Laissez la micropipette en place pendant trois minutes supplémentaires pour permettre à la pression de s’équilibrer. Après trois minutes, rétractez lentement la micropipette, puis répétez la procédure pour les deux autres sites d’injection. Après l’injection finale, retirez les pinces vertébrales et le coussin sous la souris.

Fermez les couches d’incision avec des points de suture interrompus, suturez les couches de tissu superficielles avec des sutures résorbables et la peau avec des sutures non résorbables. Appliquez un désinfectant à l’iode sur la plaie suturée. Mettez fin à l’anesthésie et laissez l’animal sur le tapis chauffant jusqu’à ce qu’il récupère avant de le ramener dans sa cage d’origine.

Le tissu rachidien au site d’injection doit être examiné à la fin de l’expérience. Ceci est nécessaire pour vérifier l’efficacité de l’injection et de la transduction et pour exclure des lésions tissulaires excessives à la suite de la chirurgie. Pour illustrer les niveaux d’expression qui peuvent être obtenus par l’injection intraspinale d’AAV recombinant, un virus codant pour la protéine fluorescente eGFP a été injecté dans la moelle épinière lombaire de souris de type sauvage.

Trois injections espacées d’environ un millimètre ont produit une infection presque continue des segments lombaires de la colonne vertébrale L3 à L5. L’injection du virus à une profondeur de 300 microns de la surface de la colonne vertébrale entraîne une infection prédominante des cellules de la corne dorsale de la moelle épinière. Cependant, des cellules infectées peuvent également être trouvées dans la corne ventrale. Un vecteur flex dépendant de cre exprimant eGFP a été injecté dans la moelle épinière de souris transgéniques GlyT2 :Cre.

Cela a entraîné une expression plus restreinte de l’eGFP reflétant la distribution des neurones positifs à GLYT2. Le respect de ce protocole permettra de cibler trois segments de colonne vertébrale consécutifs. Nous avons constaté que cela est suffisant pour obtenir des résultats de comportement robustes.

Cette technique permettra d’étudier la fonction de populations neuronales et cellulaires spécifiques et de voies sensorielles.