À long terme vivre-cellule d’imagerie afin d’évaluer le sort de la cellule en réponse au Paclitaxel

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser l’imagerie de cellules vivantes pour évaluer les décisions relatives au destin cellulaire après un traitement par le médicament anti-mitotique paclitaxel. Cette méthode nous permet de visualiser comment les cellules individuelles réagissent à différentes doses du médicament anti-mitotique paclitaxel. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une mine d’informations sur des cellules uniques ou des populations entières qui ne peuvent être obtenues à partir de l’imagerie à cellules fixes ou des tests basés sur la population.

La démonstration de cette méthode est assurée par Marc Vittoria, candidat en médecine/doctorat au Laboratoire Ganem. Pour commencer, nettoyez le fond en verre de la parabole d’imagerie avec un nettoyant optique pour éliminer les empreintes digitales ou la poussière qui pourraient interférer avec l’imagerie. Utilisez suffisamment de nettoyant optique pour mouiller toute la surface du verre.

Placez la parabole à fond de verre avec les cellules sur la platine du microscope dans l’adaptateur de parabole d’imagerie. Retirez le couvercle en plastique du plat et couvrez le plat avec une chambre en verre. Assurez-vous que la chambre est munie d’une soupape pour permettre un flux d’air constant composé de 5 % de dioxyde de carbone.

Pour humidifier le dioxyde de carbone à 5 %, le gaz est acheminé à travers un tube inséré dans un boîtier de bain-marie stérile. Cela permet au gaz de s’équilibrer à 95 % d’humidité. Lancez et calibrez la platine codée à l’aide du logiciel contrôlant le microscope.

Cela garantira des coordonnées XY précises et empêchera la dérive focale. Ensuite, effectuez l’éclairage Kohler en soulevant le condenseur et en fermant l’ouverture de manière à ce que le champ soit sombre. Abaissez le condenseur jusqu’à ce qu’une forme hexagonale nette de lumière soit visible.

Ensuite, utilisez les vis de centrage pour centrer l’hexagone de lumière dans le champ de vision. Une fois la forme hexagonale visible, ouvrez l’ouverture jusqu’à ce que tout le champ de vision soit éclairé. Engagez la mise au point automatique du microscope pour vous assurer que tous les points sont maintenus nets pendant toute la durée de l’expérience.

Utilisez le logiciel d’acquisition pour sélectionner plusieurs champs de vision non chevauchants à partir de chaque puits pour l’imagerie. Sélectionnez des régions d’imagerie où les cellules ont bien adhéré au fond du verre et sont confluentes entre 50 et 70 %. Évitez les zones de cellules agglomérées, car cela rendra difficile l’analyse ultérieure.

Pour évaluer le destin des cellules mitotiques, configurez le logiciel d’imagerie pour qu’il recueille des images de chaque champ de vision sélectionné toutes les 10 minutes pendant un maximum de 96 heures. La mitose non perturbée dure de 20 à 40 minutes, et donc des intervalles de 10 minutes fourniront un échantillonnage suffisant pour identifier quand les cellules se divisent. Pour identifier la rupture nucléaire, qui est un événement transitoire, acquérir des images toutes les cinq minutes.

Identifier les cellules qui entrent en mitose en observant l’arrondi cellulaire, en utilisant l’optique de contraste de phase et/ou la condensation des chromosomes, en utilisant l’histone humaine H2B fusionnée à la GFP. L’arrondi cellulaire et la condensation des chromosomes sont facilement visualisés à l’œil nu. Annotez l’heure à laquelle la cellule entre en mitose.

Continuez à suivre la cellule jusqu’à ce qu’elle atteigne son destin. Les cellules témoins devraient aligner efficacement leurs chromosomes et entrer en anaphase dans l’heure qui suit. Visualisez l’anaphase par optique de contraste de phase lorsque la cellule commence à se pincer en deux ou par visualisation de chromosomes se déplaçant vers les pôles marqués avec H2B-GFP.

Annotez l’heure à laquelle la cellule subit l’anaphase. En revanche, les cellules traitées au paclitaxel resteront arrondies avec des chromosomes condensés pendant plusieurs heures. Identifier les cellules arrêtées par mitotique qui subissent une mort cellulaire.

Les cellules qui meurent pendant la mitose sont visualisées par microscopie à contraste de phase, car les cellules vont exploser, rétrécir et/ou se rompre. Si vous imagez H2B-GFP, les chromosomes se fragmentent également pendant la mort cellulaire. Identifiez les cellules arrêtées par mitotique qui subissent un glissement cellulaire.

Les cellules qui subissent un glissement mitotique sont observées par microscopie à contraste de phase, car elles s’aplatissent en interphase et décondensent les chromosomes sans subir d’anaphase. Ces cellules donnent naissance à de grandes cellules tétraploïdes qui sont souvent multinucléées. Continuez à suivre les cellules à partir du champ de vision d’origine.

Une fois qu’un champ de vision entier est suivi, passez à un champ de vision distinct acquis à partir du même puits et continuez à suivre les cellules. Évaluer le destin cellulaire après le glissement mitotique à l’aide de la lignée cellulaire épithéliale pigmentée rétinienne non transformée et chromosomiquement stable exprimant le système FUCCI. Pour confirmer que le système FUCCI fonctionne correctement, vérifiez que les cellules témoins alternent l’expression des protéines fluorescentes rouges et vertes de manière appropriée à partir de l’analyse des données d’imagerie des cellules vivantes.

Les cellules témoins doivent passer d’une fluorescence rouge entièrement nucléaire à une fluorescence verte entièrement nucléaire pendant l’interphase à mesure que les cellules passent de la phase G1 à la phase S. Les cellules doivent continuer à présenter une fluorescence verte tout au long de la mitose. Immédiatement après la mitose, les cellules doivent à nouveau présenter une fluorescence entièrement rouge pendant l’interphase.

Identifiez les cellules arrêtées en mitose à l’aide de la microscopie à contraste de phase et suivez-les jusqu’à ce qu’elles subissent un glissement mitotique. Les cellules qui glissent hors de la mitose et retournent en interphase passeront d’une fluorescence verte pendant la mitose à une fluorescence rouge pendant la phase G1. Suivez ces cellules glissées à l’aide d’un contraste de phase et d’une imagerie épifluorescente à l’œil nu pour évaluer leur destin cellulaire.

Identifiez les cellules qui réintègrent le cycle cellulaire. Ces cellules sont identifiées par le changement d’expression de la fluorescence du rouge au vert à l’aide du système FUCCI qui indique la transition G1/S. Identifiez les cellules qui subissent l’arrêt du cycle cellulaire G1.

Ces cellules sont identifiées par l’expression d’une fluorescence rouge qui persiste pendant plus de 24 heures. Identifiez également les cellules qui meurent en interphase. Ces cellules sont identifiées par rupture cellulaire, bulle et rétrécissement à l’aide de l’imagerie à contraste de phase.

Imagez les cellules comme auparavant. Le signal de fluorescence de la répétition du dimère en tandem de RFP fusionné à un signal de localisation nucléaire, ou TDRFP-NLS, et H2B-GFP doit co-localiser pendant l’interphase. La mitose est visualisée par arrondi cellulaire à l’aide de l’optique de phase et/ou de la condensation chromosomique par H2B-GFP.

Lors de la mitose, l’enveloppe nucléaire se décompose et le signal TDRFP-NLS devient cytoplasmique. Après la mitose, l’enveloppe nucléaire se reformera dans les cellules filles et le signal TDRFP-NLS deviendra nucléaire. Suivez les cellules filles tout au long de l’interphase suivante grâce à l’imagerie de cellules vivantes.

Identifiez les événements de rupture nucléaire en observant une explosion transitoire de TDRFP-NLS localisée dans le cytoplasme environnant. En quelques minutes, l’enveloppe nucléaire sera réparée et le TDRFP-NLS sera relocalisé dans le noyau. Voici des images représentatives d’une cellule glissée devenant verte et entrant dans la phase S après avoir glissé du traitement au paclitaxel.

La majorité des cellules qui ont échappé au traitement au paclitaxel ont subi un arrêt G1/G0 et sont restées rouges pendant plus de 48 heures sans subir d’apoptose. Les cellules qui sont rouges après le glissement subiront également une apoptose, comme le représente cette image. La rupture de l’enveloppe nucléaire augmente dans les cellules traitées au paclitaxel.

Les cellules TDRFP-NLS et H2B-GFP traitées avec du paclitaxel 10-nanomolaire ont une rupture nucléaire accrue dans laquelle la RFP sera délocalisée du noyau vers le cytoplasme dans les cellules interphases. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une solide compréhension de la façon d’effectuer l’imagerie à long terme des cellules vivantes pour évaluer le destin cellulaire en réponse à divers traitements médicamenteux.