Synthèse des Nanotubes de carbone Multi modifiés avec des nanoparticules d’argent et de l’évaluation de leurs activités antibactériennes et propriétés cytotoxiques

L’objectif global de cette procédure est de produire des nanocomplexes antibactériens constitués de nanotubes de carbone avec des nanoparticules d’argent synthétisées à la surface des nanotubes. Cette méthode peut être utilisée dans le développement de nouveaux nanomatériaux bactériens qui ont une faible toxicité pour les humains tout en ayant de fortes propriétés septiques pour divers types de bactéries et de biofilms. Le protocole décrit l’évaluation des nanocomplexes dans l’éradication des bactéries tout en maintenant leur biocomparabilité avec l’homme.

Pour commencer la procédure, placez 30 à 50 milligrammes de MWCNT dans un flacon de 50 millilitres. À l’aide d’une micropipette munie d’embouts de pipette d’un millilitre, ajoutez lentement huit millilitres d’une solution d’acide sulfurique et d’acide nitrique à trois pour un par volume aux MWCNT. Attendez 30 minutes que la réaction exothermique se termine, puis sonisez la solution à 60 à 80 degrés Celsius et 160 watts jusqu’à ce que les MWCNT se déposent au fond du flacon. ce qui prend généralement environ une heure.

Transférez le mélange dans un tube à centrifuger. À l’aide d’une micropipette, ajoutez délicatement 30 millilitres d’eau distillée goutte à goutte aux MWCNT fonctionnalisés à l’acide carboxylique, en faisant une pause pour permettre au mélange de refroidir au besoin. Ensuite, centrifugez le mélange à 12 000 G pendant 15 minutes.

Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette équipée d’une pointe de pipette d’un millilitre. Ajoutez cinq millilitres d’éthanol au solide et rincez les parois du flacon avec de l’éthanol supplémentaire. Centrifugez à nouveau le mélange avec les mêmes réglages et vérifiez le pH du surnageant avec du papier pH.

Continuez à laver les solides par centrifugation dans de l’éthanol jusqu’à ce que le pH du surnageant soit neutre, puis retirez le surnageant et ajoutez un millilitre d’eau distillée au précipité. Dispersez les MWCNT fonctionnalisés à l’acide carboxylique dans l’eau et lyophilisez-les à moins 60 degrés Celsius sous vide. Placez 10 milligrammes d’acide carboxylique lyophilisé fonctionnalisé dans un tube à centrifuger conique de 50 millilitres.

Ajoutez 30 millilitres d’eau distillée dans le tube. Combinez six millilitres de nitrate d’argent normal 0,1 et 18 millilitres d’eau distillée dans un autre tube conique de 50 millilitres. Sonicez les deux mélanges à 60 degrés Celsius et 160 watts pendant une heure.

Ensuite, tout en continuant à soniser la dispersion MWCNT à 60 degrés Celsius et 160 watts, ajoutez la solution de nitrate d’argent goutte à goutte à la dispersion MWCNT à l’aide d’une pipette équipée d’une pointe de pipette d’un millilitre. Une fois l’addition terminée, continuer à soniser le mélange pendant une heure, puis centrifuger le mélange pendant 15 minutes à 12 000 G à température ambiante et retirer le surnageant. Redispersez les MWCNT d’argent dans 30 millilitres d’eau distillée par sonication à 24 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Répétez la centrifugation dans 30 millilitres d’eau distillée et éliminez le surnageant deux fois. Ensuite, dispersez les MWCNT d’argent lavé dans un millilitre d’eau distillée par sonication pendant cinq minutes. Ajoutez cinq millilitres d’éthanol à la dispersion et remuez le mélange à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, centrifugez le mélange pendant 15 minutes à 12 000 G à température ambiante et vérifiez le pH du surnageant. Retirez le surnageant et redispersez le mélange dans cinq millilitres d’éthanol par vortex. Continuez à laver le précipité dans de l’éthanol par centrifugation jusqu’à ce que le pH surnageant soit neutre.

Enfin, dispersez les MWCNT d’argent lavé dans un millilitre d’eau distillée. Lyophilisez la dispersion à moins 70 degrés Celsius sous vide pendant 24 heures et conservez la dispersion dans un récipient scellé. Pour commencer à préparer le test, mélangez et autoclavez 18,12 grammes de gélose R2A et un litre d’eau distillée.

Laissez le gel refroidir à température ambiante. Lorsque le gel est prêt à être versé, placez 10 millilitres de gel dans des boîtes de Pétri de 90 millimètres et laissez la gélose durcir. Dans une hotte, utilisez une boucle et une aiguille stérilisées à la flamme d’alcool pour tracer 100 microlitres d’un mélange d’espèces de méthylobactéries à la surface du milieu de culture.

Incuber les plats à 30 degrés Celsius pendant 48 heures, puis mélanger 3,12 grammes de bouillon R2A avec un litre d’eau distillée et autoclaver le milieu à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. À l’aide d’une anse et d’une aiguille stérilisées, transférez les colonies dans le milieu de croissance R2A. Incuber l’échantillon dans un incubateur à agitation à 30 degrés Celsius et 180 tr/min.

Mesurez la densité optique à 600 nanomètres par heure jusqu’à ce que la densité optique soit supérieure à 0,7. Ensuite, préparez une autre boîte de Pétri contenant 10 millilitres d’agar-agar. Mélangez ensuite 3,12 grammes de bouillon R2A et huit grammes d’agar avec un litre d’eau distillée.

Autoclavez le mélange à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Mélangez 100 microlitres de la culture de méthylobactéries dans le mélange de gélose. Versez 10 millilitres de gel contenant de la méthylobactérie sur la couche inférieure de gélose R2A dans la boîte de Pétri, puis préparez une dispersion de la concentration souhaitée de MWCNT d’argent lyophilisé dans de l’eau distillée.

À l’aide d’une micropipette, chargez 50 microlitres de cette dispersion sur un disque de papier stérile de six millimètres sur un. Appliquez de l’eau distillée sur un autre disque de papier stérile comme contrôle. Séchez et stérilisez les deux disques dans une chambre à vide sous lumière UV pendant 30 minutes.

Placez ensuite l’échantillon d’argent MWCNT et le témoin sur la gélose et incubez la plaque de gélose à 30 degrés Celsius pendant 48 heures. Mesurez la zone d’inhibition autour de l’échantillon d’argent MWCNT lorsque vous avez terminé. Avant le test, l’autoclave a distillé trois fois de l’eau à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Préparez une dispersion de 1000 microgrammes par millilitre de MWCNT fonctionnalisés à l’acide carboxylique et des dispersions de 50 microgrammes par millilitre, 40 microgrammes par millilitre et 30 microgrammes par millilitre de MWCNT d’argent dans cette eau stérile. Pour commencer la procédure d’essai antibactérien, préparez une culture de méthylobactéries comme décrit précédemment et surveillez sa densité optique à 600 nanomètres. Lorsque la densité optique est au maximum, inoculez 100 microlitres de la culture de méthylobactérie dans trois millilitres de milieu de culture R2A frais.

Placez 500 microlitres de cette solution dans chacun des cinq tubes coniques de 15 millilitres. Ajoutez 100 microlitres de méthanol dans l’un des tubes pour préparer l’échantillon de référence de méthanol. Préparez un échantillon pour chacune des quatre dispersions de la même manière.

Incuber les échantillons et la culture témoin de méthylobactérie restante à 180 tr/min et 30 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique du témoin indique une activité maximale. À l’aide d’un épandeur stérilisé, étalez chaque échantillon sur du gel gélosé solide R2A dans des boîtes de Pétri. Incuber les plats à 30 degrés Celsius pendant 48 heures.

Comptez les colonies bactériennes résultantes et déterminez la concentration bactéricide minimale. Les MWCNT Silver ont été synthétisés avec succès à l’aide de la procédure décrite. La taille moyenne des particules d’argent déposées était d’environ 3,83 nanomètres.

Aucune croissance de Methylobacterium n’a été observée lorsqu’elle a été cultivée avec des dispersions de 50 microgrammes par millilitre ou de 40 microgrammes par millilitre de MWCNT d’argent. La population bactérienne a été réduite de 100 000 fois par rapport à l’échantillon témoin lorsqu’elle a été cultivée avec une dispersion de 30 microgrammes par millilitre de MWCNT d’argent. Une zone d’inhibition a été observée autour d’un échantillon préparé à partir d’une dispersion de 10 microgrammes par millilitre de MWCNT d’argent.

Aucune zone d’inhibition n’a été observée pour un échantillon préparé à partir d’une dispersion d’un microgramme par millilitre. Une certaine cytotoxicité a été observée lorsqu’une dispersion de 40 microgrammes par millilitre de MWCNT d’argent a été ajoutée. Aucune cytotoxicité significative n’a été observée lorsqu’une dispersion de 30 microgrammes par millilitre a été ajoutée.

Un test au bleu de trypan a confirmé qu’il y avait une cytotoxicité minimale lorsqu’une dispersion de 30 microgrammes par millilitre de MWCNT d’argent a été ajoutée. Ce protocole aiderait les chercheurs à préparer des nanocomplexes contenant des nanoparticules métalliques qui agissent directement sur les nanomatériaux de carbone. En suivant ce protocole, les chercheurs seraient également en mesure d’évaluer les propriétés antibactériennes des nanocomplexes préparés.