Analyse le rôle des plasmides multi-copies dans l’évolution de la résistance aux antibiotique

L’objectif global de cette méthode expérimentale est de tester le rôle des plasmides multicopies dans l’évolution de la résistance aux antibiotiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que le rôle des plasmides multicopies dans l’évolution des innovations bactériennes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite que des méthodes de biologie moléculaire de base et un plan d’expérience simple.

C’est vraiment cool. Tout d’abord, construisez la souche e coli MG1655 qui portera le gène de résistance aux anticorps dans le chromosome du phage lambda dans l’équation côté ATTB. Pour ce faire, la PCR amplifie les 500 régions paralongues de base de part et d’autre du site ATTB.

Ensuite, la PCR amplifie le gène de résistance aux antibiotiques. Utilisez ensuite un assemblage isotherme à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes pour fusionner les régions d’homologie avec le produit PCR. Après l’assemblage isotherme, transvaser un microlitre du produit à 40 microlitres de cellules MG1655 électrocompétentes dans une cuvette de deux millimètres.

Ensuite, électroporez les cellules à 4 degrés Celsius et 2,5 kilovolts. Après électroporation, transférez les cellules dans un millilitre de bouillon LB avec 0,2 % d’arabinose. Ensuite, pipetez le bouillon LB contenant des cellules dans un tube à microfuge.

Secouez intensément le tube pendant deux heures à 30 degrés Celsius. Après deux heures, mettez en boîte 100 microlitres de la culture sur la plaque de gélose LB, complétée par des antibiotiques. Ensuite, faites tourner les cellules restantes.

Et remettez le granulé en suspension dans 100 microlitres de bouillon LB frais. Replaquez ces cellules sur une autre plaque de gélose LB. Ensuite, incubez les plaques à 42 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, la PCR amplifie les clones pour vérifier la construction à l’aide d’amorces externes ybhC extern et ybhB extern. Confirmez ensuite la taille de l’amplicon grâce à l’électrophorèse de la coquille d’agarose. En parallèle, effectuez le séquençage de l’ADN pour vérifier la séquence du gène inséré.

Pour construire la souche porteuse du gène de résistance aux anticorps dans le plasmide multicopie, la PCR a d’abord amplifié le gène de résistance aux antibiotiques blaTEM-1. Une fois la PCR terminée, phosphoryler le produit amplifié à l’aide de la polynucléotide kinase T4. Ensuite, utilisez la polymérase haute fidélité et les oligonucléotides PBAD FINV et PBAD RINV, pour amplifier par PCR le squelette plasmidique PBAD.

Ligaturez ensuite les deux fragments de PCR à l’aide de la ligase T4. Ensuite, électroporez 40 microlitres de cellules DH5 alpha avec 1 microlitre de produit de ligature. Sélectionnez ensuite l’antibiotique approprié pour le gène de résistance aux antibiotiques et le squelette plasmidique sur des plaques de gélose.

Effectuez ensuite l’extraction du plasmide à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN, en suivant les instructions du fabricant. Effectuez ensuite un séquençage par sanger du gène de résistance d’intérêt pour confirmer l’absence de mutations possibles avant les expériences d’évolution. Après vérification de la séquence, électroporat le plasmide de la souche MG1655 d’E coli pour finalement obtenir le plasmide porteur de la souche MG1655.

Les étapes les plus critiques de ce protocole sont la construction des souches des systèmes modèles et la reconstruction des mutations observées au cours de l’évolution expérimentale. Tout d’abord, striez les souches MG1655 d’intérêt sur les plaques de gélose LB. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu LB dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.

Ensuite, inoculez 48 colonies isolées de chaque souche dans des puits individuels de la plaque. Après l’inoculation, incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius sur un agitateur à 200 tours par minute. Encore une fois, inoculez deux microlitres de la culture de chaque puits avec la population fondatrice à une nouvelle plaque de 96 puits avec 198 microlitres de milieu LB dans des puits individuels.

Cela lancera l’expérience de sauvetage évolutionnaire. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sur un agitateur à 200 tours par minute pendant 20 heures. Chaque jour, doublez la concentration de l’antibiotique par rapport à celle de la veille.

Le lendemain, transférez 2 microlitres de la culture respective dans une plaque fraîche à 96 puits et continuez cela tous les jours. Enregistrez la lecture de la densité optique à 600 nanomètres à partir des puits individuels sur un lecteur de plaques. Une étape critique du protocole est l’évolution expérimentale et leurs concentrations croissantes d’antibiotiques.

Le taux de variation des concentrations d’antibiotiques est l’un des paramètres qui peuvent être modifiés pour favoriser l’évolution de la résistance aux antibiotiques. Encore une fois, incubez la plaque à 37 degrés Celsius sur un agitateur à 200 tours par minute pendant 20 heures. Mesurez ensuite la lecture de la densité optique à 600 nanomètres pour chaque population survivante quotidiennement sur le lecteur de plaques.

Congelez les populations périodiquement, tous les trois à cinq jours. Extraire l’ADN total des populations évoluées et les clones de différentes souches et traitements. Ensuite, mesurez les rapports d’absorbance à 260:280 et 260:230 nanomètres sur le spectrophotomètre pour déterminer la qualité de l’ADN.

Utilisez ensuite un colorant fluorescent de liaison à l’ADN et confirmez la concentration de l’ADN en mesurant la fluorescence sur le lecteur de plaques. De plus, soumettez l’ADN à une électrophorèse sur gel d’agarose pour confirmer qu’il n’y a pas de dégradation de l’ADN ou de contamination par l’ARN. Ensuite, effectuez un séquençage profond de l’ADN avec des échantillons obtenus de populations entières et de clones individuels pour étudier la base génétique de la résistance aux antibiotiques.

Cette étude est un exemple des résultats possibles du système expérimental utilisant trois souches d’E. coli. Il s’agit d’e coli MG1655, MG1655 portant le gène de résistance dans le chromosome MG1655 resA et MG1655 portant le gène de résistance dans le plasmide multicopie, MG1655 pRESA. Les antibiotiques utilisés sont la ceftazidime et le méropénème.

Le panneau de gauche montre les courbes de survie sous des concentrations croissantes de ceftazidime. D’après le graphique, il est clair que le sous-ensemble de la population de la souche MG1655 pRESA est capable de croître au-delà de 14 jours, même après avoir doublé la concentration de ceftazidime chaque jour. Au contraire, les autres souches ne survivent pas au-delà de 8 jours lorsqu’elles sont exposées à des concentrations similaires de ceftazidime.

Cependant, les mêmes souches ne montrent pas de différences significatives dans la période de survie lorsqu’elles sont exposées à une concentration similaire d’un autre antibiotique, le méropénème. Les trois souches ne survivent qu’entre 6 et 8 jours lorsqu’elles sont exposées au méropénème. Cela indique que la présence du gène resA dans le plasmide multicopie potentialise l’évolution de la résistance contre la ceftazidime mais pas le méropénème.

Une fois maîtrisé, le protocole expérimental complet peut être réalisé en quelques semaines s’il est fait correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier le rôle des plasmides multicopies dans l’évolution des innovations chez les bactéries.