Name: Optimisation de l’utilisation d’un Robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’Arabidopsis thaliana (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Découvrez un criblage génétique chimique à haut débit sur Arabidopsis thaliana utilisant un robot de manipulation liquide. Cette méthode permet d'identifier rapidement de nouvelles petites molécules affectant la physiologie végétale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue et Andrea Sanchez pour une discussion constructive et critique. Dr. Sharyn Perry pour les photographies phénotypiques. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous coopérative contrat no 1355438.

1. création d’une bibliothèque de Dilution
<ol><li>Étiquettes de marquage de Dilution bibliothèque 625 à la main, s’assurer qu’ils correspondent à leur plaque correspondante de la bibliothèque chimique. De plus, se connecter au flux et tuyaux d’écoulement pour le multicanal Astuce lavage automatisé Labware positionneur (ALP) en les passant à travers le disque de la Console pour le réservoir de 5 gallons (voir Table des matières).</li>
	<li>Accéder à l’ordinateur et allumez la pompe de lavage grâce à la connexion du contrôleur de périphérique à l’Alpe de lavage multicanale Astuce afin de faire circuler l’eau. Il s’éteindra automatiquement à la fin du protocole.</li>
	<li>Charge, à la main, le gerbeur électrique 10 fixée pour le Carrousel de Stacker, dans l’ordre suivant dans les hôtels A - D (Figure 4, Stacker) ; une boîte de pointes de Pipette AP96 P20 dans la salle 1, quatre 96 puits V-plaques de fond en chambres de 2 à 5 avec les deux plaques supérieures contenant des concentrations de stock de la bibliothèque ordonnée et les deux plaques inférieures vide (Figure 5, Stacker). En outre, charger une seule boîte de pointes de Pipette AP96 P20 dans la salle 6 et quatre V de 96 puits-plaques de fond dans les salles 7 à 9 avec les deux plaques supérieures contenant des concentrations de stock de la bibliothèque ordonnée et les deux plaques inférieures vide (Figure 5, Stacker).</li>
	<li>La valeur maximum, à la main, le pont avec un réservoir d’eau 300 mL sur P3, un bain d’EtOH 70 % 300 mL sur P7, astuce Loader ALP (TL1) et multicanal Astuce lavage ALP (TW1) (Figure 4, pont et Figure 5, pont).</li>
	<li>En utilisant le logiciel d’exploitation, présenter des pointes de Pipette AP96 P20 du Stacker 10 et déplacez-les vers l’Alpe de chargeur Tip. NOTE : 1.5 par 1.12 tous se font avec le liquide de traitement logiciel de fonctionnement du robot ; Voir Table des matières.</li>
	<li>Présenter 2 chambre d’Hotel A et séparer tous les quatre 96 puits V-fond plaques sur le pont, mettant le bas deux P4 et P8 et les deux premiers sur P5 et P9 (Figure 4).</li>
	<li>Charger les pointes de Pipette P20 AP96 avec le chargeur de pointe ALP sur la 96 voies 200 µL tête. Aspirer 90 µL dans le réservoir d’eau de 300 mL et diluer dans le V de 96 puits-plaque de Dilution de fond sur P4. Répétez cette étape pour la plaque sur P8.</li>
	<li>La composition de la plaque bibliothèque chimique sur P5 de répétitivement aspirant et 15 µL de distribution trois fois. En outre, aspirer 10 µL de la plaque de bibliothèque chimique au P5 et distribuer 10 µL dans la plaque de dilution sur P4.</li>
	<li>Mélanger les solutions de la plaque sur P4 par répétitivement aspirer et distribuer 50 µL trois fois au total. Une fois mélangé, nettoyer les pointes de Pipette AP96 P20 par aspiration et la distribution de 70 µL de 70 % EtOH de P7, puis les laver dans l’Alpe multicanale astuce de lavage par aspiration et distribution d’un volume de 110 % d’eau quatre fois.</li>
	<li>Répétez les étapes 1,8-1,9 pour la deuxième paire de plaques à P8 et P9. À la création du deuxième V 96 puits-plaque de fond Dilution, pile les plaques dans l’ordre suivant de bas en haut : P4, P5, P8 et P9. Ensuite, placez la pile sur un vide ALP statique ; soit P1, P2, P6, P10, P11, P12 et P13.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.6-1.10 jusqu'à 5 chambre à l’Hotel A est vide. Répétez l’étape 1.5 pour atteindre la salle 6, se déplaçant de nouvelles pointes de Pipette P20 AP96 vers l’Alpe de chargeur Tip et placer les pointes de Pipette AP96 P20 utilisé sur un alpage statique vide.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.6-1.10 jusqu'à 9 chambre d’Hotel A est vide. Toutefois, afin de procéder à l’hôtel B, les plaques et les conseils sur le pont doivent être rechargées en Hotel A.</li>
	<li>Re-remplir à la main, le réservoir d’eau de 300 mL. Cette étape est fondamentale, et le programme informatique peut intégrer une pause détaillant ce message, obligeant l’utilisateur à frapper « continuer », avant d’effectuer l’étape suivante.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.5-1.13 pour les autres hôtels, assurant un réservoir d’eau plein 300 mL chaque fois avant de procéder à l’hôtel suivant.</li>
</ol>2. mélange de médias-graines en ajoutant aux plaques de contrôle
<ol><li>Faire ½ milieu de Murashige et Skoog (MS) médias avec 0,1 % Agar par l’ajout de 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar à 1 L DI H2O. ajuster le pH à 5,7, bien que l’ajout d’hydroxyde de potassium 5 M tout en surveillant avec une sonde de pH.</li>
	<li>Stériliser les graines en les secouant dans 1 % eau de Javel et SDS entre 15 et 30 min et puis rincez 4 fois avec un volume égal d’eau par centrifugation. Une fois que les graines sont stériles, les placer à 4 ° C de 24 heures à 7 jours pour vernilization. Le centre de ressources biologiques Arabidopsis décrit les autres méthodes de stérilisation, vernilization et22de la croissance.</li>
	<li>Ajoutez les graines aux médias à la main à une densité de 0,1 g/100 mL. Cette densité se traduit par une moyenne de 3-10 graines / puits d’une plaque de 96 puits.</li>
	<li>Place, à la main, quatre plat de 96 puits-plaques de fond dans les salles 1 et 2 de l’hôtel A (Figure 6, Hotel A). Placez une boîte de pointes de Pipette AP96 P250 sur l’Alpe de chargeur Tip, un réservoir de 300 mL remplie avec le mélange de graines de médias créé aux étapes 2.1 à 2.3 sur P3 et un réservoir de 300 mL rempli avec 70 % EtOH sur P7 (Figure 4, pont et Figure 6 Pont). NOTE : 2.5 à 2.8 sont effectués avec le logiciel d’exploitation.</li>
	<li>Présenter les pièces 1 et 2 à l’hôtel A et séparer les piles de quatre assiettes. Placer une assiette sur chacun des Alpes vide statique (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 et P12). Charger les pointes de Pipette AP96 P250 sur la 96 voies 200 µL tête.</li>
	<li>Aspirer 90 µL dans le réservoir de médias-graine de 300 mL sur P3 et verser dans le premier plat de 96 puits-plaque de fond. Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les huit plaques contiennent le mélange de graines de médias.</li>
	<li>Nettoyer les pointes de Pipette P250 AP96 par aspiration et la distribution de 70 µL dans le réservoir de 300 mL rempli à 70 % EtOH sur P7. Lavez les pointes dans le multicanal Tip laver ALP par aspiration et un volume de 110 % de l’eau de distribution quatre fois, décharger les conseils à TL1 et rassembler les plaques à la main.</li>
</ol>3. ajouter des petites molécules à plaques de dépistage
<ol><li>Charge, à la main, une boîte de pointes de Pipette AP96 P250 en salle 1 de l’hôtel A, deux V 96 puits-plaques de bibliothèque de Dilution de fond en chambres 2, 4, 6 et 8 et deux 96 bien à fond plat de dépistage plaques en chambres de 3, 5, 7 et 9 (Figure 4 Empileur et Figure 7, hôtel A). En outre, raccorder des tuyaux vers et depuis l’Alpe de lavage Tip multicanal pour le réservoir de 5 gallons. NOTE : 3.2 à 3.10 sont effectués avec le logiciel d’exploitation.</li>
	<li>Configurer le pont pour contenir un réservoir 300 mL 70 % EtOH lavage P7 ; le réservoir de médias-graine peut rester sur le pont à P3 (Figure 4, pont et Figure 7, pont). En outre, allumez le lecteur de la Console via connexion du contrôleur de périphérique à faire circuler l’eau à travers l’Alpe de lavage Tip multicanale. Il s’éteindra automatiquement à la fin du protocole.</li>
	<li>Présente la AP96 P250 Pipette Tip boîte de Hôtel A et déplacez-le vers l’Alpe de chargeur Tip.</li>
	<li>Présenter le V de 96 puits-plaques de bibliothèque de Dilution de fond de 2 chambre d’Hotel A sur le deck et placer un P4 ALP statique et P8. Présenter le plat de 96 puits-plaques de projection du fond de la salle 3 de l’hôtel A sur le pont et placez une sur ALP statique P5 et sur P9.</li>
	<li>Charger les pointes de Pipette P250 AP96 avec le chargeur de pointe ALP sur la 96 voies 200 µL tête.</li>
	<li>Mélanger le V de 96 puits-plaque de Dilution de fond sur P4 par aspiration et 50 µL de distribution trois fois. Par la suite, aspirer 10 µL de cette plaque et verser dans le plat de 96 puits-plaque de fond préalable sur P5.</li>
	<li>Mélanger les solutions dans la plaque à P5 en aspirant et 50 µL de distribution trois fois. Nettoyer les pointes de Pipette P250 AP96 avec de l’éthanol par aspiration et la distribution de 70 µL de 70 % EtOH provenant du réservoir à P7 et puis lavez les pointes à l’ALP multicanale Astuce lavage par aspiration et distribution d’un volume de 110 % de l’eau quatre fois.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.5 et 3.6 pour le second V 96 puits-plaque de bibliothèque de Dilution inférieure (P8) et plat de 96 puits-plaque de fond préalable (P9).</li>
	<li>Empiler les deux 96 puits V-plaques de Dilution bibliothèque fond ensemble et les deux plaques de fond préalable 96 puits plat ensemble. Passer les plaques à statique Alpes P1, P2, P6, P10, P11, P12 et P13.</li>
	<li>Répétez les étapes 3,4-3,9 trois fois, ajouter des produits chimiques dilués à projection plaques huit fois au total. Enfin, vérifiez le nombre de graines dans chaque loge des présélection des plaques conformation visual et compléter ces puits avec moins de trois graines par des graines stérilisées et vernalisées supplémentaires.</li>
</ol>4. l’incubation et la visualisation des plaques de dépistage
<ol><li>Incuber les plaques à 96 puits à fond plat de dépistage pendant quatre jours dans une chambre à 22 ° C sur un cycle de lumière/obscurité de 16/8 dans un contenant étanche de la dessiccation. Visualiser les plaques 96 puits à fond plat de dépistage sous un microscope à dissection. Enregistrer tous les phénotypes aberrants pour complément d’enquête.</li>
</ol>

<ol><li>Blackwell, H. E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+approaches+to+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic approaches to plant biology.</a> Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).</li>
<li>Dejonghe, W., Russinova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chemical+genetics%3A+From+phenotype-based+screens+to+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology.</a> Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>McCourt, P., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chemical+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Plant chemical genetics.</a> New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).</li>
<li>Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+nuclear+hormone+receptors%3A+A+role+for+small+molecules+in+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).</li>
<li>Hicks, G. R., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+plant+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in plant chemical biology.</a> Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+root+cap+in+root+branching+revealed+by+the+non-auxin+probe+naxillin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin.</a> Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+designing+chemical+screening+strategies+in+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology.</a> Front Plant Sci. 6, 131(2015).</li>
<li>Yoshitani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structure-based+strategy+for+discovery+of+small+ligands+binding+to+functionally+unknown+proteins%3A+Combination+of+in+silico+screening+and+surface+plasmon+resonance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements.</a> Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).</li>
<li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li>
<li>DeBolt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morlin%2C+an+inhibitor+of+cortical+microtubule+dynamics+and+cellulose+synthase+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).</li>
<li>Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+auxins+by+a+chemical+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Identification of auxins by a chemical genomics approach.</a> J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).</li>
<li>Drakakaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clusters+of+bioactive+compounds+target+dynamic+endomembrane+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo.</a> PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).</li>
<li>Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+inhibitors+of+auxin+transcriptional+activation+by+means+of+chemical+genetics+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).</li>
<li>Brown, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+with+differential+effects+on+the+PTS1+and+PTS2+peroxisome+matrix+import+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways.</a> Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+inhibition+of+a+subset+of+Arabidopsis+thaliana+GSK3-like+kinases+activates+brassinosteroid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling.</a> Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).</li>
<li>Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+progressing+toward+the+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality.</a> Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).</li>
<li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+interrogation+of+natural+variation+uncovers+a+molecule+that+is+glycoactivated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated.</a> Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).</li>
<li>Walsh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+field+of+chemical+genetics%3A+Potential+applications+for+pesticide+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery.</a> Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).</li>
<li>Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from:
 <a target="_blank" href="https://abrc.osu.edu/seed-handling">https://abrc.osu.edu/seed-handling</a> (2013).</li>
<li>Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthetic+elicitor+3%2C5-dichloroanthranilic+acid+induces+NPR1-dependent+and+NPR1-independent+mechanisms+of+disease+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).</li>
<li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+96-well+Plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Daniszewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+culture+systems+and+their+applications+to+human+pluripotent+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies.</a> SLAS Technol. , (2017).</li>
<li>Popa-Burke, I., Russell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+precipitation+in+high-concentration+DMSO+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions.</a> J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).</li>
<li>Partridge, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+high-throughput+system+for+phenotypic+screening+of+chemical+libraries+on+C.+elegans+and+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2017).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Ce protocole est conçu pour aider les chercheurs dans la réalisation d’un écran de génétique chimique avant sur Arabidopsis. Nous fournissons des résultats représentatifs d’un écran de 50 000 composés (Figure 2 et Figure 3), un des plus grands écrans avant génétique chimique effectuée sur Arabidopsis à ce jour9,13,23. L’utilisation d’un robot de manipulation de liquides...

Au cours des 20 dernières années chercheurs dans le domaine de la biologie végétale ont fait des progrès considérables, grâce à la génétique chimique avant et arrière, améliorer notre compréhension de la biosynthèse de la paroi de la cellule, le cytosquelette, la biosynthèse des hormones et de signalisation, gravitropisme, pathogenèse, biosynthèse de la purine et endomembranaire traite1,2,3,4,5. Employant des techniques de génétique chimique avant permet l’identification des phénotypes d’intérêt et permet aux chercheurs de comprendre les fondements génotypiques des procédés particuliers. À l’inverse, génétique chimique inverse recherche les produits chimiques qui interagissent avec une protéine pré-déterminé cible6. Arabidopsis a été à l’avant-garde de ces découvertes en biologie végétale, parce que son génome est petit, mappé, avec mention. Il a un temps de génération court, et il y a plusieurs lignes de mutant/journaliste disponibles afin de faciliter l’identification des machines subcellulaire aberrante7.
Il y a deux principaux goulets d’étranglement qui ralentissent la progression d’avancer les écrans génétiques chimiques, le processus de sélection et de déterminer la cible du composé d’intérêt8initial. Une aide importante en augmentant la vitesse de sélection de petite molécule est l’utilisation de l’automatisation et l’équipement automatisé de9. Robots de manutention de liquides sont un excellent outil pour gérer les grandes bibliothèques de petites molécules et ont joué un rôle important dans la conduite des progrès dans les sciences biologiques10. Le protocole présenté ici vise à alléger le goulot d’étranglement lié au processus de sélection, permettant d’identifier des molécules bioactives petits à un rythme accéléré. Cette technique diminue la charge de travail et le temps pour le compte de l’opérateur tout en diminuant aussi le coût économique à l’enquêteur de principe.
Jusqu’ici, les bibliothèques plus chimiques analysés ont lieu entre 10 000 et 20 000 composés, certains avec jusqu'à 150 000 et certains avec aussi peu que 709,11,12,13,14, 15 , 16. le protocole présenté ci-après a été implémenté sur une bibliothèque de petite molécule de 50 000 composés (voir la Table des matières), un de la plus grande génétique chimique avant écrans menée sur Arabidopsis à ce jour. Ce protocole s’inscrit dans la tendance actuelle vers une efficacité accrue et la vitesse au sujet du avant génétique chimique, en particulier en ce qui concerne à la découverte de l’herbicide, découverte de l’insecticide, fongicide Découvrez, drug discovery et la biologie du cancer17 ,18,19,20,21. Bien que mis en œuvre ici avec Arabidopsis, ce protocole, pourrait facilement être adaptés aux cultures de cellules, des spores et potentiellement même insectes dans un milieu liquide dans 96-, 384- ou plaques 1536 puits. En raison de sa petite taille, Arabidopsis se prête au dépistage en plaques bien 96. Toutefois, distribuer les graines uniformément entre les puits est un défi. Ensemencement de la main est exacte mais de forte intensité de main de œuvre, et qu’il existe des dispositifs conçus pour répartir les graines dans des plaques à 96 puits, ils sont coûteux à l’achat. Ici, nous montrons comment cette étape peut être contournée avec juste une petite perte en précision.
L’objectif général de cette méthode était de faire le dépistage d’une grande bibliothèque chimique contre Arabidopsis plus facile à gérer, sans compromettre la précision, via l’utilisation d’un robot de manipulation de liquides. L’utilisation de cette méthode améliore l’efficacité du chercheur en diminuant le temps nécessaire pour compléter la gestion de série de dilution initiale et des examens subséquents phénotypiques, ce qui permet une visualisation rapide des échantillons sous un microscope à dissection et rapide identification de nouvelles petites molécules bioactives. La figure 1 illustre les principaux résultats de ce protocole en 4 étapes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> Figure 1 : flux de travail dans l’ensemble de l’écran avant génétique chimique. Une vue d’ensemble du protocole pour être décrit avec quelque détail pour chacune des 4 étapes clés. 1 : recevant la bibliothèque chimique, 2 : faire la Dilution bibliothèque, 3 : rendre les plaques de dépistage et 4 : incubation et visualiser les plaques de projection. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Clavier</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour la conception et l’exploitation du protocole Biomek</td></tr><tr><td>FX Souris</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour la conception et l’exploitation du protocole Biomek FX Écran d’ordinateur</td></tr><tr><td></td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour la conception et l’exploitation du protocole Biomek FX</td></tr><tr><td>Fournisseur</td><td>local</td> N<td>/A</td><td>Utilisé pour la conception et l’exploitation du protocole le Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet Bibliothèque de criblage diversifiée</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>Bibliothèque chimique</td></tr><tr><td>Biomek Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Exécute et conçoit le contrôleur de dispositif Biomek FX</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>Commande la pompe à eau/la station de lavage des pointes</td></tr><tr><td>Empileur Carrousel Pendent</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>Fonctionnement manuel de Biomek Empileur Carrousel</td></tr><tr><td>Biomek Stacker Carrousel</td><td>Beckman Coulter</td><td>148520</td><td>Unité rotative qui abrite tous les FX Stacker 10</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Unité d’ascenseur qui abrite les composants pour l’écran</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Unité d’ascenseur qui abrite les composants pour l’écran</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Unité d’ascenseur qui abrite les composants de l’écran</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Unité d’ascenseur qui abrite les composants de l’écran</td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>Robot qui effectue les opérations souhaitées</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>Bras de cadres pour placer les composants correctement</td></tr><tr><td>Dispositif de charpente</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>Centre le bras dans l’Accuframe</td></tr><tr><td>Lavage multicanal des pointes ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>Lave les pointes après le bain d’éthanol</td></tr><tr><td>Chargeur de pointes ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>charge pneumatiquement les pointes sur le bras</td></tr><tr><td>Compresseur d’air</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Fournit de l’air pour le chargement pneumatique des pointes</td></tr><tr><td>Entraînement de console MasterFlex</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>Pompe utilisée pour faire circuler l’eau à travers le tuyau d’air de rondelle de pointe multicanal</td></tr><tr><td></td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Fournit de l’air du compresseur d’air au chargeur de pointes</td></tr><tr><td>Tuyau d’eau</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Fournit de l’eau de 5 gallons de réservoir à la rondelle de pointe</td></tr><tr><td>Static ALP Le</td><td>soc Beckman</td> d’ALP <td>est livré avec Biomek FX</td><td>Prend en charge l’équipement pour l’écran</td></tr><tr><td>5 gallons Reservour</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Recirculation de l’eau sale du nettoyage des pointes</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Beckman Coulter</td><td>Livré avec Biomek FX</td><td>Saisit et déplace l’équipement aux bons endroits</td></tr><tr><td>96 canaux 200 & micro ; Tête en L</td><td>Beckman Coulter</td><td>Livré avec Biomek FX</td><td>Maintient les 96 pointes utilisées dans l’écran</td></tr><tr><td>AP96 P200 Pointes de pipette</td><td>Beckman Coulter</td><td>717251</td><td>Utilisé pour fabriquer la bibliothèque de criblage</td></tr><tr><td>96 Well Flat Bottom Plate Plate</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>Aide à la visualisation de l’écran</td></tr><tr><td>96 Well V-Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>Aide au stockage de la bibliothèque de dilution</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96 Film d’étanchéité</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>Scelle pour le stockage de la bibliothèque de produits chimiques et de la bibliothèque de dilution</td></tr><tr><td>Sacs à sandwich ziplock en plastique</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour assurer un environnement humide pour l’écran</td></tr><tr><td>AP96 P20 Pointes de pipette</td><td>Beckman Coulter</td><td>717254</td><td>Utilisé dans la création de la bibliothèque de dilution</td></tr><tr><td>Chambre de croissance</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>Germe des graines pour phénotypique </td></tr><tr><td>visulation Spatule</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Conserve les graines à ajouter dans les puits où l’ensemencement liquide a échoué</td></tr><tr><td>Cure-dent</td><td>Fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Pousse les graines de la spatule aux puits</td></tr><tr><td>Murashige et Skoog Mélange de sels basaux</td><td></td><td>PhytoTechnology Laboratories M524</td><td>Ajouter au mélange de milieux</td></tr><tr><td>MS MES Monohydrate acide libre</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19483580</td><td>Ajouté au support MS pour diminuer le pH</td></tr><tr><td>Poudre de gélose</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>Augmente l’épaisseur du support pour supporter la suspension des graines</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Augmente le pH à des niveaux adéquats</td></tr><tr><td>Bouteille de stockage de support 1L</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>Contient suffisamment de support pour un écran</td></tr><tr><td>Tubes de centrifugation en polypropylène</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>Stérilise les graines avant la vernilisation</td></tr><tr><td>Sonde de pH</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>Utilisé pour la fabrication de supports</td></tr><tr><td>ALP (Automated Labware Positioners) Manuel d’utilisation</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987836</td><td>Aide à la configuration de l’équipement d’accompagnement pour le Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek 2000 Guide d’utilisation du carrousel d’empilage</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>Aide à la configuration du carrousel</td></tr> <tr><td>d’empilageStations de travail d’automatisation de laboratoire Biomek FX et FXP Manuel d’utilisation</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>Utilisé pour encadrer le pod multicanal</td></tr><tr><td>Guide de démarrage du client Poste de travail d’automatisation de laboratoire Biomek FXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>Utilisé pour aider à la configuration du</td></tr><tr><td>logiciel Biomek FX Manuel d’utilisation du logiciel Biomek</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>Utilisé pour configurer et comprendre le Logiciel</td></tr></tbody></table>

optimisation de l’utilisation d’un robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’arabidopsis thaliana

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Génétique chimique est plus en plus utilisée pour décoder les caractères chez les plantes qui peuvent être récalcitrants à la génétique traditionnelle en raison de la redondance de gène ou de la létalité. Cependant, la probabilité d’une petite molécule synthétique étant bioactive est faible ; par conséquent, des milliers de molécules doivent être testés afin de trouver ceux d’intérêt. Manipulation robotique systèmes sont conçus pour gérer un grand nombre d’échantillons, augmentation de la vitesse avec laquelle une chimique peut être criblée outre minimiser/standardisation erreur de liquides. Pour obtenir un écran haut débit avant génétique chimique d’une bibliothèque de 50 000 petites molécules sur Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocoles utilisant un liquide multicanaux de paillasse robot de manutention ont été élaborés nécessitant un minimum participation du technicien. Avec ces protocoles, 3 271 petites molécules ont été découverts qui a provoqué des altérations phénotypiques visibles. 1 563 composés induisirent des racines courtes, coloration de 1 148 composés modifiés, 383 composés causés les poils absorbants et autres, hors-catégorie, altérations et la germination de 177 composés inhibées.

La capacité à exactement et efficacement caractériser les phénotypes basées sur l’ajout de petites molécules au dépistage des concentrations sous un microscope à dissection est l’objectif final de cette méthode de génétique chimique avant sur Arabidopsis. Les phénotypes observés lorsque tous les 50 000 composés ont été menées est diverses et peut être divisée en plusieurs classes distinctes (Figure 2). Figure 3 a <strong...

Un écran à haut débit de petites molécules de synthèse a été réalisé sur les espèces de plantes de modèle, Arabidopsis thaliana. Ce protocole, développé pour un robot de manipulation de liquides, augmente la vitesse d’écrans avant génétique chimique, accélérer la découverte de nouvelles petites molécules affectant la physiologie végétale.

Optimisation de l’utilisation d’un Robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

L’objectif global de ce protocole est d’effectuer un criblage génétique chimique à haut débit sur des semis d’Arabidopsis. Grâce à cette méthode, nous pouvons découvrir de nouvelles petites molécules qui affectent la physiologie des plantes. Ces découvertes serviront de base à d’autres études sur les processus physiologiques, tels que la synthèse de la paroi cellulaire.Le principal avantage de cette technique est que des dizaines de milliers de petites molécules peuvent être criblées en peu de temps. Bien que ce protocole soit conçu pour l’espèce végétale modèle Arabidopsis, il peut facilement être adapté à d’autres organismes, tels que les insectes, les micro-organismes ou la culture cellulaire. Nous avons eu l’idée de ce protocole lorsque nous avons appris que le centre de génomique de l’université devait trouver un foyer pour un robot de manipulation de liquides excédentaires.Nous nous sommes immédiatement portés volontaires pour le leur enlever des mains. Préparez la bibliothèque de dilution et le positionneur automatisé de matériel de laboratoire multicanal Tip Wash ou ALP comme décrit dans le protocole de texte. Chargez manuellement le Stacker 10s attaché au carrousel de l’em

optimizing-use-liquid-handling-robot-to-conduct-high-throughput

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous rapportons une méthode pour l'introduction, le suivi et l'analyse quantitative de l'expression de GFP dans les cellules végétales. Cette méthode utilise un système conçu sur mesure pour la robotique collection d'images en semi-continu d'un grand nombre d'échantillons, au fil du temps. Nous démontrons également l'utilisation d'ImageJ et ImageReady pour l'analyse des séries d'images.

Robotique et d&#39;analyse d&#39;images dynamiques pour les études d&#39;expression génique dans les tissus végétaux

Une procédure de liquides à base de culture et de la distribution...

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

Un protocole pour l'expression de criblage à haut débit quantitatif et la purification d'analyse de protéines de fusion à partir de cultures d'Escherichia coli à petite échelle est décrite et appliquée à l'expression de protéines cibles du venin d'animaux riches en disulfures.

High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans<em&gt; E. coli</em

Ici, nous décrivons un test de gène rapporteur basé sur des cellules comme un outil précieux pour cribler les bibliothèques chimiques à la recherche de composés modulant les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par 3' UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Une méthode à haut débit automatisée, la production de tabac en protoplastes et la transformation est décrite. Le système robotisé permet l'expression du gène massivement parallèle et de découverte dans le système modèle BY-2 qui devrait être traduisible aux cultures non-modèle.

Une plate-forme robotique pour haut débit protoplastes Isolement et Transformation

Est présenté ici, un workflow automatisé pour effectuer le montage de « dispositif » ADN modulaire en utilisant une méthode d’assemblage des ADN clonage modulaire sur les robots de manutention liquide. Le protocole utilise un outil logiciel intuitif pour générer des listes déroulantes gestionnaire liquide pour combinatoire génération de bibliothèque dispositif ADN, qui nous montrent l’utilisation de deux plates-formes de manipulation de liquides.

Automatisé de robotique Liquid Handling assemblage de dispositifs modulaires ADN

Nous décrivons ici un protocole simple pour produire rapidement des centaines de gélose de croissance nématode de médias, des plaques de 96 puits de culture avec un nombre uniforme de Caenorhhabditis elegans / puits. Ces cultures sont utiles pour le dépistage phénotypique des organismes entiers. Nous nous concentrons ici sur l’utilisation de ces cultures de produits chimiques pour des effets Pro-longévités.

Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

Un protocole à haut débit pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) est fourni, optimisant les étapes de manipulation des liquides avec un simple dispositif d’aspiration construit avec une pompe à vide. Des centaines d’échantillons de semences peuvent être stérilisés en surface en une journée.

Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Ce protocole fournit une méthode pour l’optimisation globale systématique des biocapteurs génétiquement codés par la génération et l’évaluation de bibliothèques génétiques assistées par automatisation. Ceci est associé à des méthodologies de conception d’expérience pour rationaliser l’expérimentation et permettre la sélection de composants génétiques pour ajuster les biocapteurs à des résultats de conception spécifiques.

Échantillonnage efficace de l’espace de conception de biocapteurs génétiquement codés grâce à un plan d’expériences et à un flux de travail d’automatisation

Ce protocole présente un flux de travail standard de criblage à haut débit pour les micro-organismes industriels. Il consiste à construire une bibliothèque de mutants via la mutagenèse ARTP, à effectuer un dépistage de gouttelettes positif avec microfluidique automatisée, puis à vérifier les résultats. La fiabilité du flux de travail a été validée en criblant des souches à haut rendement de B. coagulans .

Criblage à haut débit des mutants de Bacillus coagulans hyperproducteur d’acide L-lactique utilisant une plateforme microfluidique automatisée à gouttelettes

Découvrez un criblage génétique chimique à haut débit sur Arabidopsis thaliana utilisant un robot de manipulation liquide. Cette méthode permet d'identifier rapidement de nouvelles petites molécules affectant la physiologie végétale.

Optimisation de l’utilisation d’un Robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’Arabidopsis thaliana (Vidéo) | JoVE Journal

Optimisation de l’utilisation d’un Robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’Arabidopsis thaliana

Explorer plus de vidéos