Optimisation de l’utilisation d’un Robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’Arabidopsis thaliana

L’objectif global de ce protocole est d’effectuer un criblage génétique chimique à haut débit sur des semis d’Arabidopsis. Grâce à cette méthode, nous pouvons découvrir de nouvelles petites molécules qui affectent la physiologie des plantes. Ces découvertes serviront de base à d’autres études sur les processus physiologiques, tels que la synthèse de la paroi cellulaire.

Le principal avantage de cette technique est que des dizaines de milliers de petites molécules peuvent être criblées en peu de temps. Bien que ce protocole soit conçu pour l’espèce végétale modèle Arabidopsis, il peut facilement être adapté à d’autres organismes, tels que les insectes, les micro-organismes ou la culture cellulaire. Nous avons eu l’idée de ce protocole lorsque nous avons appris que le centre de génomique de l’université devait trouver un foyer pour un robot de manipulation de liquides excédentaires.

Nous nous sommes immédiatement portés volontaires pour le leur enlever des mains. Préparez la bibliothèque de dilution et le positionneur automatisé de matériel de laboratoire multicanal Tip Wash ou ALP comme décrit dans le protocole de texte. Chargez manuellement le Stacker 10s attaché au carrousel de l’empileur.

Dans les hôtels A à D, chargez d’abord une boîte d’embouts de pipette AP96 P20 dans la première salle. Ensuite, chargez quatre plaques à fond en V de 96 puits dans les salles deux à cinq, avec deux plaques supérieures contenant les concentrations de stock de la bibliothèque commandée et les deux autres plaques inférieures vides. De plus, chargez une boîte d’embouts de pipette AP96 P20 dans la salle six.

Chargez quatre plaques à fond en V de 96 puits dans les salles sept à neuf, les deux plaques supérieures contenant les concentrations de stock de la bibliothèque ordonnée et les deux plaques inférieures vides. Installez le pont avec 300 millilitres d’eau dans le réservoir sur P3, un bain de 300 millilitres à 70 % d’éthanol sur P7, le Tip Loader ALP et le Tip Wash ALP. À l’aide du logiciel d’exploitation du robot de manipulation de liquides, présentez les pointes de pipette AP96 P20 du Stacker 10 et déplacez-les vers le Tip Loader ALP.

Présentez la salle deux de l’hôtel A et séparez les quatre plaques à fond en V de 96 puits sur le pont, en plaçant les deux inférieures sur P4 et P8 et les deux supérieures sur P5 et P9. Chargez les pointes de pipette AP96 P20 avec le Tip Loader ALP sur la tête à 96 canaux de 200 microlitres. Aspirez 90 microlitres du réservoir d’eau de 300 millilitres et distribuez-les dans la plaque de dilution à fond en V de 96 puits sur P4. Répétez l’étape pour la plaque sur P8. Mélangez la plaque de la chimiothèque sur P5 en aspirant et en distribuant trois fois 15 microlitres. De plus, aspirez 10 microlitres de la plaque de la chimiothèque sur P5 et distribuez 10 microlitres dans la plaque de dilution sur P4. Mélangez les solutions de la plaque sur P4 en aspirant et en distribuant de manière répétitive 50 microlitres un total de trois fois.

Une fois mélangés, nettoyez les pointes de pipette AP96 P20 en aspirant et en distribuant 70 microlitres d’éthanol à 70 % à partir de P7, puis lavez-les dans le Multichannel Tip Wash ALP en aspirant et en distribuant quatre fois un volume d’eau de 110 %. Répétez ces étapes pour la deuxième paire de plaques sur P8 et P9. Lors de la création de la deuxième plaque de dilution à fond en V de 96 puits, empilez les plaques P9, P5, P8 et P4 dans cet ordre de bas en haut. Ensuite, placez la pile sur un ALP statique vide.

Utilisez P1, P2, P6, P10, P11, P12 ou P13. Répétez ces étapes jusqu’à ce que la salle cinq de l’hôtel A soit vide, puis recommencez le processus en arrivant à la salle six, en déplaçant les nouvelles pointes de pipette AP96 P20 vers le chargeur de pointes ALP et en plaçant les pointes de pipette AP96 P20 usagées sur un ALP statique vide. Répétez la procédure jusqu’à ce que la salle 9 de l’hôtel A soit vide.

Afin de se rendre à l’hôtel B, les plaques et les pointes sur le pont doivent être rechargées dans l’hôtel A.Bien que le robot puisse travailler sans surveillance, il est nécessaire de remplir le réservoir d’eau après chaque cycle de dilution. Si le cycle redémarre avec une quantité d’eau insuffisante, le robot aspirera de l’air et les produits chimiques ne seront pas dilués. Remplissez manuellement le réservoir d’eau de 300 millilitres.

Le programme informatique peut intégrer une pause détaillant ce message, obligeant l’utilisateur à appuyer sur Continuer avant d’effectuer l’étape suivante. Répétez les étapes de dilution pour les trois hôtels restants. Ajoutez manuellement les graines dans le milieu à une densité de 0,1 gramme par 100 millilitres.

Cette densité se traduit par une moyenne de 3 à 10 graines par puits d’une plaque de 96 puits. Placez manuellement quatre plaques à fond plat de 96 puits dans les salles un et deux de l’hôtel A.Placez une boîte de pointes de pipette AP96 P250 sur le chargeur de pointes ALP, un réservoir de 300 millilitres rempli du mélange média-graines sur P3 et un réservoir de 300 millilitres rempli de 70 % d’éthanol sur P7. À l’aide du logiciel d’exploitation, présentez les salles un et deux de l’hôtel A et séparez les piles de quatre plaques. Placez une plaque sur chacun des ALP statiques vides, puis chargez les pointes de pipette AP96 P250 sur la tête à 96 canaux de 200 microlitres.

Aspirez 90 microlitres du réservoir de semis de 300 millilitres sur P3 et distribuez-les dans la première plaque à fond plat de 96 puits. Répétez ce processus jusqu’à ce que les huit plaques contiennent le mélange de milieu de vie et de graines. Nettoyez les pointes de pipette AP96 P250 en aspirant et en distribuant 70 microlitres à partir du réservoir de 300 millilitres rempli à 70 % d’éthanol sur P7. Lavez les pointes dans l’embout multicanal Lavez ALP en aspirant et en distribuant quatre fois un volume d’eau de 110 %, puis déchargez les pointes à TL1.

Enfin, rassemblez les assiettes à la main. Chargez manuellement une boîte de pointes de pipette AP96 P250 dans la première salle de l’hôtel A.Chargez également deux plaques de bibliothèque de dilution à fond en V de 96 puits dans les salles deux, quatre, six et huit. Chargez deux plaques de criblage à fond plat de 96 puits dans les salles trois, cinq, sept et neuf.

À l’aide du logiciel d’exploitation, configurez le plateau pour qu’il contienne un réservoir de lavage de 300 millilitres d’éthanol à 70 % à P7. Le réservoir de semis peut être laissé sur le pont à P3. De plus, allumez le variateur de console via la connexion du contrôleur de l’appareil pour faire circuler l’eau à travers le Multichannel Tip Wash ALP. Cela s’éteindra automatiquement à la fin du protocole. Présentez la boîte d’embouts de pipette AP96 P250 de l’hôtel A et déplacez-la vers le chargeur d’embouts ALP.

Ensuite, présentez les plaques de bibliothèque de dilution à fond en V de 96 puits de la salle deux de l’hôtel A sur le pont. Placez une plaque sur l’ALP P4 statique et une plaque sur P8. Ensuite, présentez les plaques de criblage à fond plat de 96 puits de la salle trois de l’hôtel A sur le pont. Placez une plaque sur ALP P5 statique et une sur P9. Chargez les pointes de pipette AP96 P250 avec le chargeur de pointes ALP sur la tête à 96 canaux de 200 microlitres.

Mélangez la plaque de dilution à fond en V de 96 puits sur P4 en aspirant et en distribuant trois fois 50 microlitres. Ensuite, aspirez 10 microlitres de cette plaque et distribuez-les dans la plaque de criblage à fond plat à 96 puits sur P5. Mélangez les solutions dans la plaque à P5 en aspirant et en distribuant trois fois 50 microlitres. Nettoyez les pointes de pipette AP96 P250 avec de l’éthanol en aspirant et en distribuant 70 microlitres d’éthanol à partir du réservoir en P7. Ensuite, lavez les pointes dans le Multichannel Tip Wash ALP en aspirant et en distribuant quatre fois un volume d’eau de 110 %.

Répétez ces étapes pour la deuxième plaque de bibliothèque de dilution à fond en V à 96 puits et la plaque de criblage à fond plat à 96 puits. Empilez les deux plaques de bibliothèque de dilution à fond en V de 96 puits et les deux plaques de criblage à fond plat de 96 puits ensemble. Déplacez les plaques vers les ALP statiques.

Ensuite, répétez le processus trois fois, en ajoutant des produits chimiques dilués aux plaques de criblage un total de huit fois. Enfin, vérifiez le nombre de graines dans chaque puits des plaques de criblage par confirmation visuelle. Complétez les puits avec moins de trois graines en ajoutant des graines stérilisées et vernalisées.

Il est essentiel de s’assurer que le milieu dans lequel poussent les semis ne se dessèche pas, car cela entraînerait une mauvaise germination. Les plaques contenant des semis doivent être conservées à une humidité élevée ou stockées dans des récipients résistants à la dessiccation. Incuber les plaques de criblage à fond plat à 96 puits pendant quatre jours dans une chambre environnementale à 22 degrés Celsius sur un cycle lumière/obscurité 16/8 dans un récipient résistant à la dessiccation.

Visualisez les plaques de criblage à fond plat à 96 puits sous un microscope de dissection et enregistrez tous les phénotypes aberrants pour une enquête plus approfondie. Des exemples de phénotypes normaux et aberrants sont l’absence d’anomalies morphologiques visibles, les poils racinaires bruns, les racines rabougries, les racines sévèrement rabougries, le mucilage blanchi et vert, la germination incomplète et l’absence de germination. Les phénotypes visibles en pourcentage sont affichés dans un graphique circulaire.

Les plantules présentaient des anomalies dans la morphologie des racines, la pigmentation, les poils racinaires et la germination. Une variété d’autres sont également incluses, notamment la production de mucilage vert. Une fois maîtrisée, cette technique peut augmenter considérablement l’efficacité et la précision des grands criblages génétiques chimiques avancés.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de stériliser et de vernaliser les graines, de remplir le réservoir d’eau pendant les étapes de dilution, de s’assurer que les échantillons sont stockés dans des contenants résistants à la dessiccation et que toutes les images sont effectuées dans des plaques à fond plat. Selon le processus physiologique que vous souhaitez étudier, ce dépistage initial peut être suivi d’analyses supplémentaires pour aider à déterminer le mode d’action de chaque produit chimique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser un robot de manipulation de liquides pour améliorer l’efficacité et la précision d’un dépistage génétique chimique.