Isolement des cellules endothéliales humaines du côlon Normal et carcinome Colorectal - un protocole amélioré

L’objectif global de ce protocole d’isolement cellulaire est d’obtenir des cellules endothéliales pures et viables de patients atteints de carcinome colorectal, à la fois de la tumeur et du côlon normal correspondant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie tumorale et de l’angiogenèse, telles que l’estimation et l’analyse de l’impact du système des vaisseaux sanguins sur la tumorigenèse colorectale. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible d’obtenir des cellules endothéliales humaines pures et viables chez des patients atteints d’un carcinome colorectal.

Pour obtenir l’échantillon de tissu de patients atteints d’un carcinome colorectal, utilisez un scalpel frais pour obtenir des morceaux de tissu qui pèsent environ un gramme. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, transférez les morceaux de tissu frais dans 40 millilitres de tampon HBSS glacé avec des antibiotiques dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile séparée, transférez séquentiellement le carcinome et le tissu normal d’un tube à centrifuger à un autre pour laver quatre fois 40 millilitres de tampon HBSS glacé avec des antibiotiques.

Pour enlever toute la graisse, les tissus non tumoraux ou les parties de tissu potentiellement nécrotiques, utilisez des pinces stériles et transférez les morceaux de tissu dans une boîte de Pétri de culture cellulaire stérile. Ensuite, ajoutez trois à cinq millilitres de tampon HBSS supplémenté en antibiotiques pour laisser les morceaux de tissu humidifiés. Ensuite, utilisez un scalpel frais pour couper les morceaux de tissu.

Ensuite, utilisez un scalpel avec une lame incurvée pour couper le tissu restant en petits morceaux. Transférez les morceaux de tissu haché dans un tube de dissociation tissulaire rempli de milieu de culture cellulaire préchauffé. Dissociez les morceaux de tissu haché à l’aide d’un dissociateur de tissu, ainsi que d’un kit de dissociation tumorale pour les tissus humains en suivant les instructions du fabricant.

La première étape critique consiste à traiter et à microdisséquer correctement l’échantillon chirurgical afin d’obtenir des morceaux de tissu de la bonne taille et du bon type de tissu. Après avoir dissocié les morceaux de tissu, centrifugez-le à température ambiante à 300 fois la gravité pendant une minute. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, ajoutez 10 millilitres de DMEM Low medium préchauffé dans le tube MACS.

Ensuite, versez la suspension cellulaire du tube sur une crépine de cellule avec une taille de pores de 100 micromètres placée sur un tube de centrifugation de 50 millilitres. Pipetez 10 millilitres supplémentaires de DMEM Low medium dans le tube MACS pour rincer les cellules supplémentaires du tube à travers la crépine dans le tube de centrifugation. Une fois que toute la suspension cellulaire est filtrée, lavez la crépine cellulaire avec 10 millilitres supplémentaires de DMEM Low medium.

Centrifugez la suspension cellulaire à température ambiante à 300 fois la gravité pendant sept minutes. Ensuite, jetez le surnageant une fois la centrifugation terminée. Ensuite, dissolvez la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu EBM-2-MV supplémenté et préchauffé en antibiotiques dans le même tube de centrifugation de 50 millilitres.

Retirez la solution d’enrobage du ballon de culture et transférez la suspension cellulaire directement dans un ballon de culture T-25 maintenu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque la confluence atteint environ 80 à 90 %, ajoutez un millilitre d’Accutase pour détacher les cellules dans le ballon. Ensuite, laissez les cellules avec l’Accutase pendant 10 minutes.

Ensuite, ajoutez quatre millilitres de milieu EBM-2-MV maintenu à 37 degrés dans les cellules. Ensuite, utilisez un appareil de comptage de cellules automatisé d’une portée de 10 à 25 micromètres pour compter les cellules. La deuxième étape la plus critique est toutes les étapes où les cellules doivent être divisées.

L’estimation du bon point temporel nécessite de l’expérience. Si la scission est trop précoce, les cellules mourront. Si la scission est trop tardive, les cellules endothéliales atteindront la sénescence ou la prolifération des fibroblastes sera un problème.

Ensuite, centrifugez les cellules à température ambiante à 250 fois la gravité pendant quatre minutes et expulsez le surnageant à la fin de la course. Ensuite, dissolvez la pastille cellulaire dans un tampon FACS préchauffé. Ensuite, ajoutez les anticorps de coloration FACS aux cellules.

Mélangez puis incubez à température ambiante pendant 15 minutes au total. Après la moitié de cette période d’incubation, agitez le tube une fois. À l’aide d’une pipette sérologique, ajoutez deux millilitres de tampon FACS à la suspension cellulaire marquée.

Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à température ambiante à 250 fois la gravité pendant quatre minutes, et décantez le surnageant une fois la centrifugation terminée. Ensuite, ajoutez deux millilitres de tampon FACS pour dissoudre la pastille cellulaire et centrifugez la suspension cellulaire à température ambiante pendant quatre minutes à 250 fois la gravité. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de milieu EBM-2-MV supplémenté en antibiotiques.

Ensuite, transférez les cellules vers l’instrument de tri FACS. Identifiez les cellules triplement positives et laissez-les s’ensemencer dans la boîte de culture à 24 puits remplie d’un milieu EBM-2-MV frais et préchauffé. Cultivez les cellules pendant les 48 heures suivantes, puis renouvelez le milieu.

Continuez à changer de milieu tous les deux jours jusqu’à ce que la confluence atteigne 90 à 100 % en cinq à 10 jours. Ensuite, élargissez la population cellulaire en fonction de la boîte de culture souhaitée. Ensuite, récoltez une fois la confluence atteinte, et procédez à la caractérisation.

Tout d’abord, l’échantillon de tumeur obtenu est dissocié et ensemence dans une boîte de culture cellulaire. Les cellules non adhérentes sont lavées et les cellules adhérentes sont cultivées à une confluence de 80 à 90 % avant le tri FACS. Ensuite, l’analyse FACS est effectuée pour identifier la population de la tumeur viable immunomarquée et des cellules endothéliales normales.

Pour ce faire, un triple marquage spécifique aux anticorps couplés au fluorochrome des cellules endothéliales normales et tumorales est effectué pour être trié par FACS. En moyenne, 3,6 et 5,6 % de l’ensemble de la population cellulaire triée sont respectivement des cellules tumorales et des cellules endothéliales normales. Ensuite, pour identifier l’expression des marqueurs des cellules endothéliales, les cellules endothéliales normales et tumorales obtenues sont soumises à l’immunocytochimie.

Les images montrent des cellules endothéliales normales et tumorales CD31 positives. Ensuite, l’ARN est isolé de la population de cellules endothéliales CD31-positives et soumis à une RT-qPCR pour identifier les autres marqueurs spécifiques des cellules endothéliales. D’après le graphique, l’expression de marqueurs de cellules endothéliales, tels que CD105, VE-cadhérine et le facteur de von Willebrand, est également détectée, mais l’expression de marqueurs provenant de populations cellulaires potentiellement contaminantes fait défaut, ce qui indique la pureté des cultures de cellules endothéliales isolées.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois semaines si elle est exécutée correctement. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés car elle nécessite de l’expérience avec des cultures de cellules endothéliales primaires afin d’estimer quand et à quels ratios les cellules peuvent être divisées ou être traitées ultérieurement pour l’analyse de tri FACS. Les implications de cette technique s’étendent au traitement du carcinome colorectal, car les cultures cellulaires peuvent être utilisées pour identifier les mécanismes de tumorigenèse, de réponse au traitement ou de résistance dans le carcinome colorectal.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons lu de nombreux rapports dans la littérature indiquant des problèmes avec l’établissement de cellules endothéliales vraiment pures et viables à partir de tumeurs solides humaines. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de la microdissection tissulaire ou du traitement pour l’analyse de tri FACS ou la division ultérieure des cellules endothéliales nécessitent de l’expérience afin d’estimer le bon point temporel. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’établir d’abord un réseau de coopération fonctionnel avec la chirurgie, la pathologie et le registre des tumeurs.

De plus, vous devez être formé à l’exercice pour travailler avec des cultures de cellules endothéliales primaires, car ces cellules sont fragiles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules endothéliales du carcinome colorectal humain et du côlon normal correspondant.