Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

L’objectif global de cette technique d’analyse est de quantifier l’éthambutol, un médicament antituberculeux, dans les compartiments tissulaires des lésions pulmonaires de la tuberculose afin de déterminer si les concentrations de médicament bactéricide sont atteintes. Cette méthode peut répondre à des questions dans le domaine de la découverte et du développement de médicaments contre la tuberculose en déterminant si les médicaments administrés atteignent des populations bactériennes à des concentrations stérilisantes dans tous les compartiments des tissus du granulome. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification complète des concentrations de médicaments avec des détails spatiaux élevés au sein de structures tissulaires et de populations cellulaires spécifiques.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de coupe et de montage des tissus sont difficiles à apprendre en raison du risque de contamination des tissus et de la nature fragile des lames de membrane. Commencez cette procédure par le prélèvement de tissus comme décrit dans le protocole textuel. Pour effectuer une section de tissu, réglez d’abord le cryostat à la température de coupe souhaitée.

Transférez la biopsie pulmonaire irradiée aux rayons gamma du stockage à moins 80 degrés Celsius dans le cryostat et laissez agir pendant 30 minutes pour équilibrer la température des tissus. À l’aide d’une pince à épiler, fixez la biopsie au mandrin du cryostat à l’aide d’une petite quantité d’adhésif à température de coupe optimale pour faire adhérer la base du tissu au mandrin. Orientez le tissu de manière à ce que la surface plane soit la surface exposée pour la coupe.

Assurez-vous que l’OCT ne contamine pas la surface du tissu, car cela pourrait interférer avec l’analyse ultérieure par spectrométrie de masse. Coupez trois sections de tissu à 25 microns d’épaisseur et montez-les sur des lames de membrane PET. Touchez doucement la membrane à la section du tissu et retirez la section.

Si une pression trop importante est appliquée, la fine membrane peut se déchirer. Évitez de manipuler excessivement la lame avant le montage afin de ne pas charger la membrane PET et de diminuer l’adhérence de la section du tissu. Conservez la lame de membrane à température ambiante pour permettre le montage par décongélation et l’adhérence réussie du tissu à la membrane.

Retirez la lame du cryostat et laissez-la sécher à l’air libre pendant trois minutes. Si LCM-LC-MS/MS n’est pas effectué immédiatement, scellez la lame dans un petit sac hermétique refermable et transférez-la dans le stockage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire de la dissection. Coupez une section adjacente à 10 à 12 microns et dégelez-la sur une lame de verre standard pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine.

Des sections supplémentaires peuvent être coupées à ce moment-là pour d’autres colorations histochimiques souhaitées. Retirez le sac scellé contenant la lame du stockage à moins 80 degrés Celsius et laissez-le atteindre la température ambiante pendant cinq minutes. Si la lame froide est immédiatement exposée à l’atmosphère du laboratoire, le tissu sera recouvert de condensation et l’intégrité spatiale du médicament peut être compromise.

Allumez le microscope et le laser. Le laser a besoin de cinq à 10 minutes pour chauffer avant que la découpe puisse commencer. Chargez des tubes PCR à bouchon plat de 0,20 millilitre dans le support.

Après avoir retiré la lame du sac, prenez une image optique de la coupe de tissu sur la lame PET à l’aide d’un scanner à plat. Placez la diapositive dans le support de diapositive, côté mouchoir vers le bas. Attribuez des tubes de prélèvement séparés à des régions de granulome d’intérêt spécifiques à l’aide du logiciel de microscope.

En règle générale, il s’agit d’un poumon, d’un granulome cellulaire et d’un caséum non impliqués, mais cela peut varier en fonction de la pathologie spécifique de la biopsie du granulome. Concentrez-vous sur le tissu à l’aide de l’objectif du microscope 5X. Cette amplification devrait fournir une bonne vue d’ensemble du tissu contenant à la fois les zones de granulome cellulaire et nécrotique.

Dans le logiciel, sélectionnez le tube désigné caseum pour le mettre en position sous le tissu. Entrez les paramètres de dissection souhaités. Les réglages typiques pour une section pulmonaire de 25 microns d’épaisseur sont la puissance laser 30, la vitesse 15 et l’ouverture 35.

Cependant, ceux-ci différeront en fonction du microscope utilisé et de la baisse potentielle de la puissance en raison de l’âge du laser. Sélectionnez l’outil Dessin libre et, à l’aide d’une souris ou d’un stylet tactile, tracez le contour de la zone souhaitée pour la dissection. La surface de la région sera affichée dans le logiciel.

Maintenez les régions sélectionnées en dessous de 500 000 microns carrés pour faciliter la dissection. Répétez la dissection jusqu’à ce que trois millions de microns carrés aient été collectés au total dans le capuchon du tube. À l’occasion, la région disséquée peut rester collée à la membrane environnante et ne pas tomber dans le chapeau de collecte.

Supprimez ces régions de la surface totale cumulée en les sélectionnant et en les supprimant manuellement dans le logiciel. Ensuite, sélectionnez le capuchon pour la lésion cellulaire et collectez trois millions de microns carrés de tissu en utilisant le même processus. Sélectionnez le capuchon pour le poumon non impliqué et collectez trois millions de microns carrés de tissu en utilisant le même processus.

Notez que le tissu pulmonaire non impliqué contient de nombreuses bronchioles et espaces alvéolaires. Faites très attention à les exclure des régions tissulaires définies pour la dissection. Retirez le porte-capuchon et déclipsez, scellez et étiquetez soigneusement chaque tube.

Protégez les tissus disséqués des perturbations de l’air ambiant. Analysez immédiatement les tissus disséqués ou conservez-les à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les avant le traitement et l’analyse LC/MS. En supposant une densité tissulaire d’un gramme par millilitre, préparez le stock d’homogénat en pesant 50 milligrammes de tissu témoin et en ajoutant un tampon PBS à diluer.

Homogénéisez le tissu en battant le tissu pulmonaire et le tampon PBS pendant cinq minutes à 1750 tr/min sur un homogénéisateur de billes. Ensuite, diluez un milligramme par millilitre de médicaments dans de l’acétonitrile/de l’eau pour créer des solutions standard de dopage de courbe. Déterminer les concentrations étalons de dopage en fonction du volume de spicule et du volume tissulaire cible.

L’exemple illustré est celui d’un étalon de 100 nanogrammes par millilitre utilisant un volume de pointe de 10 microlitres. Retirez les tubes contenant le tissu microdisséqué de l’entreposage à moins 80 degrés Celsius et laissez-les atteindre la température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez 10 microlitres de solution individuelle d’acétonitrile/eau et deux microlitres de tampon PBS dans les tubes contenant le tissu microdisséqué.

Pour les tubes de courbe standard et de contrôle de la qualité, ajoutez 10 microlitres de solution de dopage à deux microlitres d’homogénat pulmonaire de contrôle. Ajoutez 50 microlitres de solution d’extraction dans chaque tube. Agitez chaque tube pendant cinq minutes.

Ensuite, sonicez-les pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez les tubes à 5 000 tr/min pendant cinq minutes pour former une pastille de film et de tissu dans chaque tube. Après la centrifugation, transférez 50 microlitres de surnageant dans une plaque de puits profonds de 96 puits et diluez avec 50 microlitres supplémentaires d’eau désionisée dans chaque puits.

Enfin, effectuez l’analyse LC-MS/MS et la validation de la méthode comme décrit dans le protocole texte. La méthode LCM-LC/MS a d’abord été validée en analysant des régions microdisséquées au laser à partir d’un homogénat de tissu enrichi à l’éthambutol. Comme le montre ici, la méthode était hautement reproductible et a démontré une excellente récupération du médicament.

Les concentrations d’éthambutol mesurées par LCM-LC/MS dans plusieurs tissus pulmonaires ont été validées par comparaison directe avec les concentrations déterminées par une approche LC/MS établie. Des concentrations équivalentes ont été détectées par les deux techniques. Les concentrations absolues d’éthambutol dans le parenchyme pulmonaire non impliqué, le bord des lésions cellulaires et le caséum nécrotique ont été déterminées par LCM-LC/MS.

niveaux de stérilisation de Mycobacterium tuberculosis ont été atteints dans tous les compartiments lésionnels. Les concentrations minimales requises pour tuer 99 % des bacilles réplicatifs extracellulaires et 99 % des bacilles intracellulaires dans les macrophages sont indiquées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de microdisséquer les tissus et de quantifier les niveaux de médicament dans des structures de granulome pulmonaire définies.

Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les médicaments antimicrobiens d’évaluer avec précision et quantification si les médicaments administrés atteignent des populations d’agents pathogènes cibles à des concentrations stérilisantes. Cette approche a une large applicabilité à de nombreux tissus et états pathologiques différents.