Name: Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez la quantification spatiale des médicaments dans les lésions tuberculeuses pulmonaires par microdissection laser et LC/MS. Cette méthode permet de mesurer avec précision les concentrations d'éthambutol dans les différents compartiments des granulomes.

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Nous remercions Paul O'Brien, Marizel Mina et Isabella Freedman pour l’expérimentation animale, Jacquie Gonzalez et Danielle Weiner de NIH/NIAID aide avec irradiation gamma de tissus de lapin avant laser microdissection de saisie et de Jansy Sarathy manuscrit idées et conseils. Ce travail a été financé par la Bill et Melinda Gates Foundation (OPP1174780) et l’instrumentation de NIH partagé accordent 1S10OD018072. Nous remercions Eliseo A. eugénine donnant accès au microscope Leica LMD 6500 et le partage des compétences et des conseils. L’achat et soutien continu, les 6500 LMD a été financé par subvention du National Institute of Mental Health, MH096625, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, NS105584, IRSP (à E.A.E) et de contributions de GSK (à E.A.E).

Toutes les études animales ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health, avec l’approbation de l’animalier institutionnel et Comité d’urbanisme de NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. animales Experiments and prélèvement tissulaire
Cette section du protocole décrit les procédures animales et prélèvement d’échantillons dans des conditions de biosécurité de niveau 3 (BSL3). Des protocoles détaillés de la Mycobacterium tuberculosis aérosol infection procédure and drug administration protocoles chez le lapin ont été décrits précédemment11,12.
<ol><li>Infecter les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (mâles et femelles à 4-5 mois) avec M. tuberculosis HN878 en utilisant un système aérosol nez seulement, comme décrit plus haut11.</li>
	<li>Administrer les médicaments choisis (Ethambutol dans l’exemple présenté ici) via la voie préférée et euthanasier les animaux à 2, 6 et 24 h après l’administration. Tout d’abord, anesthésier le lapin par une injection intramusculaire de la kétamine à 35 mg/kg et de Xylazine à 5 mg/kg. Attendre dix minutes et confirmer le bonne anesthetization en pinçant la queue et toucher doucement les yeux. S’il n’y a aucune réaction, euthanasier par administration intraveineuse de pentobarbital et de la phénytoïne (voir Table des matières) à 1 mL/4,5 kg dans 2 mL de solution saline stérile. NOTE : Ces points sont optimales pour couvrir le profil pharmacocinétique de l’éthambutol et peuvent nécessiter de réglage/optimisation pour l’étude d’autres drogues.</li>
	<li>À l’aide de pinces, ciseaux, et/ou scalpel, enlever les poumons de la cavité thoracique, résection des biopsies pulmonaires contenant des granulomes nécrotiques grands incorporés dans les tissus pulmonaires non impliqués (comme décrit plus haut3) environnants. Granulomes nécrotiques apparaissent beige en couleur et en général dépassent légèrement du poumon environnant de couleur rouge/rose. Pour faciliter la cryosectioning facile, veiller à ce que les biopsies ne sont pas plus grands que 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>À l’aide de pinces, placer la biopsie sur un plateau préalablement étiquetées cryomold avec la surface de coupe souhaitée en contact direct avec la base de la barre d’État. Après la congélation, cela vous donnera une surface plate d'où cryosections sera coupées.</li>
	<li>Geler la biopsie en vapeur d’azote liquide. Remplir un contenant de mousse de styrol jusqu'à une profondeur de 2 pouces à l’azote liquide et placer une grille de tube métallique. Le panier doit dépasser au-dessus de la surface de l’azote liquide fournissant une surface plane sur laquelle sont placés les plateaux de tissu. Replacez le couvercle sur le récipient de styromousse et laisser les tissus pendant 10minutes de geler complètement.</li>
	<li>Enlever les plateaux de tissu, rapidement envelopper dans le film d’aluminium et les placer dans individuellement étiquetés seal et des sacs en plastique refermables. Transférer au congélateur-80 ° C pour le stockage. Remarque : Les étapes 1.1 à 1.6 sont effectuées dans des conditions de BSL3 (y compris tous travaux animale et manipulation des tissus et des organes infectés). Gamma irradient les biopsies pulmonaires à 3 mégarads pour activer le traitement à l’extérieur du confinement BSL3. Microdissection de saisie de laser sur les tissus non stérilisées peut-être être effectuée au sein de la BLS3 établissement s’il est approuvé les protocoles de sécurité sont en place. Cependant, le reste du présent protocole décrit la transformation en aval dans un établissement de BSL-2.</li>
</ol>2. tissu de sectionnement
<ol><li>Définissez le cryostat à la température de coupe souhaitée. Transférer la biopsie pulmonaire irradié gamma de stockage de-80 ° C dans le cryostat et laisser pendant 30 minutes pour équilibrer la température des tissus. Remarque : -20 à-22 ° C est optimale pour les biopsies de lésions de TB.</li>
	<li>À l’aide de pinces à épiler, fixer la biopsie au mandrin cryostat à l’aide d’une petite quantité d’adhésif de température de coupe optimale (OCT) à adhérer à la base du tissu pour le mandrin. Orientez le tissu de sorte que la surface plane (qui était en contact avec la base de la cryomold) est la surface exposée pour la coupe. Assurer que l’OPO ne contamine pas la surface du tissu, car cela peut interférer avec l’analyse de spectrométrie de masse ultérieures.</li>
	<li>Coupez trois coupes de tissus à 25 µm d’épaisseur et l’installer au PET membrane diapositives. Doucement toucher la membrane à la section de tissu et le retirer. Si trop de pression est appliqué, la fine membrane peut se déchirer.<ol>
<li>Éviter la manipulation excessive des diapositives avant de monter, comme cela se traduira par la membrane de PET devenant chargé et mauvaise adhérence des coupes de tissus. Veiller à ce que la lame de la membrane est conservée à température ambiante pour permettre l’adhérence de dégel-montage et réussie du tissu à la membrane.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez la lame du cryostat et laisser pour sécher à l’air pendant 3 minutes. Si LCM-LC/MS/MS ne sera pas effectuée immédiatement, scellez la lame dans un petit sac scellable hermétique et transfert vers stockage de-80 ° C jusqu'à leur utilisation pour la dissection.</li>
	<li>Couper une section adjacente au 10-12 µm et dégel-monter sur une lame de verre standard pour l’hématoxyline et éosine (H &amp; E) coloration et de référence. Des sections supplémentaires peuvent être coupées en ce moment pour les autres taches histochimie souhaitée (par exemple, Ziehl-Niellsen pour la visualisation de Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>Retirer le sachet scellé contenant la diapositive de stockage de-80 ° C et laisser à température ambiante pendant 5 minutes. Remarque : Si la lame froide est immédiatement exposée à l’atmosphère de laboratoire, le tissu va se recouvrir de condensation, et l’intégrité spatiale de la drogue peut être compromise.</li>
	<li>Allumez le microscope et le laser (laser nécessite 5-10 minutes d’échauffement avant découpe peut commencer). Charger des tubes PCR plat-cap 0,20 mL dans le support.</li>
	<li>Retirez la glissière du sac et de prendre une image optique de la section de tissu sur la diapositive de PET à l’aide d’un scanner à plat.</li>
	<li>Placez la lame dans le porte-lame (intrados vers le bas) et assigner des tubes de collecte sélective à des régions spécifiques granulome d’intérêt en utilisant le logiciel de microscope. En général, ceux-ci seront « poumon non impliqué, » « Granulome cellulaire », et « caseum » (Centre nécrotique), mais ils peuvent varier selon la pathologie spécifique de la Granulome/biopsie.</li>
	<li>Mettre l’accent sur le tissu à l’aide de la 5 X objectif de microscope. Ce grossissement devrait fournir une bonne vue d’ensemble du tissu contenant les deux zones de granulome cellulaires et nécrotiques. Dans le logiciel, sélectionnez le tube désigné « caseum » pour le déplacer dans la position sous le tissu.</li>
	<li>Entrez les paramètres souhaités dissection. Paramètres par défaut pour une section de poumon épais 25 µm sont laser puissance 30, vitesse 15 et ouverture 35 (unités arbitraires). Toutefois, ces différera selon le microscope utilisé et le potentiel de baisse de puissance en raison de l’âge du laser.</li>
	<li>Sélectionnez l’outil « dessin » et, à l’aide d’une souris ou un écran tactile stylet, décrire la région souhaitée pour la dissection. La superficie de la région s’affichera dans le logiciel. Garder les régions sélectionnées sous 500 000 µm2 (0. 5 mm2) pour faciliter la dissection plus facile. Répéter la dissection jusqu'à 3 millions µm2 (2de 3 mm) ont été collectés au total dans le capuchon du tube.<ol>
<li>À l’occasion, la région disséquée peut restent accrochée à la membrane environnante (par exemple en raison de l’attraction statique) et ne pas tomber dans le plafond de la collection. Supprimer ces zones de la surface cumulée totale en sélectionnant et en supprimant manuellement dans le logiciel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez le bouchon pour « lésion cellulaire » et de recueillir 3 millions µm2 du tissu suivant le même processus, comme indiqué dans l’étape de 3,7.</li>
	<li>Sélectionnez le bouchon pour « poumon non impliqué » et de recueillir 3 millions µm2 du tissu suivant le même processus, comme indiqué dans l’étape de 3,7. Notez que les tissus pulmonaires non impliqués contient beaucoup des bronchioles et des espaces alvéolaires. Être très attentif à exclure ces provenant des régions de tissus définis pour la dissection.</li>
	<li>Retirez le porte-bouchon et soigneusement dégrafer, sceller et étiqueter chaque tube. Protéger les tissus disséqués de perturbations d’air (par exemple, à partir de perturbation flux aérien d’une ouverture de porte) environnantes. Analyser les tissus disséqués immédiatement, ou stocker à-80 ° C et décongeler avant le traitement et l’analyse LCMS.</li>
</ol>4. extraction et analyse par LCMS
<ol><li>Préparer la solution d’extraction de 1:1 dans l’acétonitrile/méthanol contenant l’étalon interne d-10 éthambutol. Lorsque vous sélectionnez une norme interne, utiliser une forme stable marquée de la drogue de l’analyte (tels que EMB marqués au deutérium utilisé dans cette démonstration) avec suffisant Maj masse afin d’éviter des isotopes cross talk entre le médicament de l’analyte et la norme (généralement un minimum de 4 daltons) . Remarque : La création de normes dans l’homogénat de chaque type de tissu respectif est difficile parce qu’il y a un contrôle très limité des tissus permettant de créer des normes de l’homogénat. Comme alternative à rendre les normes auprès d’un échantillon d’homogénat enrichis, une norme peut être créée en ajoutant le tissu blanc et composé d’essai ensemble et extraction. Un volume de tissu témoin dans un homogénat qui correspond au volume cible de l’étude des sections de tissu échantillon est associé directement à une quantité de la substance d’essai qui serait présent à une concentration donnée.</li>
	<li>Calculer le volume de tissu ciblé basé sur la surface et l’épaisseur de la section de tissus et de déterminer le facteur de dilution nécessaire pour l’homogénat en utilisant le volume d’homogénat qui sera ajouté à la norme et les échantillons de CQ. Les calculs sont illustrées ci-dessous pour une zone cible disséqué de µm 3 millions2 (3 mm2) avec un 25 µm d’épaisseur et volume 2 µL d’homogénat. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>En supposant une densité de tissu de 1 g/mL, préparer le stock de l’homogénat pesant 50 mg de tissu témoin et ajout de tampon PBS pour diluer (en utilisant le facteur de dilution de le 26,67 homogénat calculé à l’étape 4.2, le diluant est 1,283 mL). Homogénéiser au talon battant des tissus pulmonaires et tampon PBS pendant 5 minutes à 1750 tr/min sur un homogénéisateur de perle. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Diluer la concentration en acétonitrile/eau de 1:1 pour créer la courbe d’étalonnage de fortification des solutions stocks du médicament de 1 mg/mL. Déterminer la concentration standard basée sur le volume de la pointe et le volume de tissu cible de fortification. L’exemple illustré est d’un standard à l’aide d’un volume de pointe 10 µL 100 ng/mL. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Retirer les tubes contenant des tissus microdisséqués de stockage de-80 ° C et laisser à température ambiante pendant 5 minutes.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de solution d’acétonitrile/eau de 1:1 et 2 µL de tampon PBS aux tubes contenant du tissu microdissected.</li>
	<li>Pour la courbe d’étalonnage et les tubes de contrôle de la qualité, ajouter 10 µL de solution de 2 µL de l’homogénat de poumon de contrôle de dopage.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de solution d’extraction dans chaque tube.</li>
	<li>Vortex chaque tube pendant 5 minutes, laisser agir pendant 5 minutes et centrifuger à 5000 tr/min pendant 5 minutes pour former une boulette de film et de tissus dans chaque tube.</li>
	<li>Transférer 50 µL de liquide surnageant d’une plaque 96 puits puits profonds et diluer avec un supplémentaire 50 µL d’eau déionisée dans chaque puits.</li>
	<li>Effectuer une analyse de LC/MS/MS à l’aide de paramètres optimisés pour l’éthambutol et éthambutol-d10 étalon interne (comme décrit dans le détail12).</li>
	<li>Utiliser un facteur de dilution pour corriger le montant exact du tissu découpé pour chaque échantillon. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. Validation de la méthode
<ol><li>Créer un homogénat de tissu pulmonaire de contrôle en combinant 1 partie du poumon, 2 pièces PBS et 3-4 billes en acier. Battre les tissus pulmonaires et tampon PBS pendant 5 minutes à 1750 tr/min en utilisant un homogénéisateur de perle.</li>
	<li>Doper l’homogénat en ajoutant 10 µL de 1 mg/mL stock DMSO Ethambutol dans 990 µL homogénat de créer une concentration finale de 10 000 ng/mL (10 mg/mL) et vortex pendant 1 minute.</li>
	<li>Créez un bloc congelé homogénat en versant l’homogénat dans un cryomold et congélation rapide sur la glace sèche pendant 5 minutes.</li>
	<li>Préparer 25 µm des coupes d’épaisseur du bloc de l’homogénat comme indiqué aux paragraphes 2.1 à 2.5.</li>
	<li>Disséquer la zone cible de tissu tel que spécifié dans les étapes 3.2-3.10.</li>
	<li>Ajouter 10 µL 1:1 dans l’acétonitrile/eau et 2 µL de tampon PBS aux tubes contenant du tissu microdissected.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de solution d’extraction dans chaque tube. Suivez les étapes 4,9-4.12 pour créer une courbe d’étalonnage et déterminer la concentration du médicament dans le bloc de l’homogénat tissulaire.</li>
	<li>Calculer le rendement d’extraction à l’aide de la formule ci-dessous : <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Résolue spatialement quantification des médicaments au sein des lésions pulmonaires de TB est nécessaire pour déterminer si l’exposition au médicament atteint stérilisant les concentrations de populations bactériennes qui résident dans les compartiments de différentes lésions. La méthode de LCM-LC/MS décrite ici permet une quantification absolue de médicaments antituberculeux dans tous les compartiments de la lésion, y compris le caseum riche en bactéries, en utilisant uniquement des sections de tissu 1-3 au total. Homog...

La capacité de résoudre dans l’espace et de quantifier les concentrations du médicament est une condition essentielle pour déterminer si des médicaments antituberculeux atteint sous-populations bactériennes au sein des lésions pulmonaires à des concentrations1de stérilisation. Une importance particulière consiste à déterminer la pénétration de drogue dans le noyau nécrotique de la lésion (appelée caseum), qui généralement contient le plus grand nombre de bacilles et qui peut être difficilement accessibles aux médicaments en raison de l’absence de vascularisation.
Les méthodes traditionnelles pour évaluer la pénétration de la lésion, qui impliquent l’homogénéisation des lésions pulmonaires excisées suivie d’extraction par solvant et l’analyse de spectrométrie de masse (LC/MS) de chromatographie en phase liquide, sont hautement sensible et sélectif pour les médicaments de intérêt. Cependant, ces méthodes offrent l’information spatiale pauvre, limitée à la taille du tissu original homogénéisé. Basé sur la spectrométrie de masse des approches d’imagerie, telles que matrix-assisted laser desorption ionisation (MALDI)2,3, désorption electrospray ionisation (DESI)4 ou extraction surface liquide-enhanced5, 6 offrent des capacités d’imagerie très résolue spatialement, mais quantification directe peut être extrêmement difficile, voire impossible en raison d’effets de suppression ion hétérogènes et différentes efficacité d’extraction de l’analyte de la cellule de divers types de tissu7ou. En outre, des approches d’imagerie tissulaire MS plus directes sont intrinsèquement moins sensibles que LC/MS en raison du manque de séparation chromatographique des espèces endogènes en compétition pour l’ionisation et l’efficacité d’extraction par solvant plus faible de la drogue du tissu.
Microdissection de saisie de laser (LCM) combinée à une analyse LC/MS a été systématiquement appliquée pour isoler et caractériser des regions tissulaires distinctes pour la protéomique étudie8,9 et récemment utilisée pour la quantification de la drogue en ayant reçu une dose 10de tissus d’origine animale. Nous présentons ici un protocole optimisé appliquant LCM couplée à une analyse de LC/MS (LCM-LC/MS) afin de quantifier les antituberculeux dans les compartiments distincts de granulome. Dans le processus de microdissection laser capture, un laser UV vise à travers l’objectif de microscope sur la section de tissu, ce qui coupe et d’isole la zone de tissu désiré en suivant un tracé défini par l’utilisateur. Pour l’assistance gravitationnelle LCM (la technique utilisée pour cette étude), la section de tissu est montée sur une lame de membrane mince polymère (PET ou stylo) et le tissu est capturé dans un bouchon de tube de collection situé en bas de la diapositive. Les médicaments sont extraits des tissus excisés et quantifiées à l’aide des procédures types de LC/MS. La quantité de tissu nécessaire à recueillir est finalement déterminée de la concentration attendue du médicament présent dans le tissu et la sensibilité de la méthode LC/MS. Aire de la surface est suffisante pour la plupart des analyses de drogues dosé à des niveaux thérapeutiques et analysées à l’aide d’un spectromètre de masse quadripolaire triple systématique, 3 millions µm2 (2de 3 mm) de tissu.
Ce protocole décrit la combinaison puissante de profilage spatiale et quantification complet offert par LCM-LC/MS, fournissant des concentrations du médicament absolue dans tous les compartiments des granulomes de TB. La technique peut également être appliquée à la détermination des concentrations du médicament dans de nombreux tissus malades différents fournissant des informations de découverte et le développement de médicaments vitaux.

<table><tbody><tr><td>Nouvelle-Zélande Lapins blancs</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Cétathesie (kétamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodique et phénytoïne sodique) Solution</td> Acétonitrile <td>710101</td><td></td> <td>Virbac</td></tr><tr><td>(grade LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol (grade LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique (grade LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Eau (grade LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>Tubes PCR à bouchon plat de 0,2 mL</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Cadres en acier, membrane PET</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Lames de microscope givrées</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Plaque à puits profonds 2,0 ml PP rb</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 colonne (4,6 x 50 mm ; taille des particules, 3,5 &mu ; m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>"Fermeture éclair » Sacs d’échantillons de scellés</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Discontinued</td><td>Leica CM1860 est le modèle actuel</td></tr><tr><td>Système de microdissection laser 6500</td><td>Leica</td><td>Discontinué</td><td>Leica LMD 6 est le modèle actuel</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Spectromètre de masse</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par laser capturer microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (lcm-lc/ms)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

La tuberculose est toujours des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Améliorations à des régimes médicamenteux existants et le développement de nouveaux traitements sont requis de toute urgence. La capacité des antituberculeux dosé d’atteindre et de stériliser des bactéries au sein des régions nécrotiques mal vascularisé (caseum) des granulomes pulmonaires est cruciale pour une intervention thérapeutique réussie. Régimes thérapeutiques efficaces doivent donc contenir médicaments ayant des propriétés de pénétration caseum favorable. Les méthodes actuelles de LC/MS pour quantifier les concentrations du médicament dans les tissus biologiques ont limité les capacités de résolution spatiale, rend difficile de déterminer avec précision les concentrations du médicament absolue dans les milieux de petits tissus tels que ceux trouvés dans les granulomes nécrotiques. Nous présentons ici un protocole associant microdissection de saisie de laser (LCM) des régions de tissus pathologiquement distinctes avec quantification de LC/MS. Cette technique fournit quantification absolue de la drogue au sein du Granulome caseum, entourant la lésion cellulaire et tissu pulmonaire non impliqués et, donc, avec précision détermine si des concentrations bactéricides sont réalisées. Outre la recherche de la tuberculose, la technique a de nombreuses applications potentielles pour résolue spatialement quantification des drogues dans les tissus malades.

Un aperçu de l’approche de LCM-LC/MS est illustré à la Figure 1. Après le tissu de la stérilisation par irradiation gamma, toutes les étapes subséquentes (à partir de tissus à partir de sectionnement) ont lieu en dehors des conditions BSL3. La figure 2 montre la lésion sections biopsie avant et après l’isolement des tissus par LCM. Zones nécrotiques et cellulaires des lésions de la TB peuvent être facilement identifiés et isolés ...

Nous décrivons ici un protocole à l’aide de microdissection de saisie de laser couplée à l’analyse de LC/MS dans l’espace-quantifier des distributions de médicaments au sein des granulomes de tuberculose pulmonaire. L’approche a largement applicables à la quantification des concentrations du médicament dans les tissus à haute détails spatiaux.

Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

L’objectif global de cette technique d’analyse est de quantifier l’éthambutol, un médicament antituberculeux, dans les compartiments tissulaires des lésions pulmonaires de la tuberculose afin de déterminer si les concentrations de médicament bactéricide sont atteintes. Cette méthode peut répondre à des questions dans le domaine de la découverte et du développement de médicaments contre la tuberculose en déterminant si les médicaments administrés atteignent des populations bactériennes à des concentrations stérilisantes dans tous les compartiments des tissus du granulome. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification complète des concentrations de médicaments avec des détails spatiaux élevés au sein de structures tissulaires et de populations cellulaires spécifiques.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de coupe et de montage des tissus sont difficiles à apprendre en raison du risque de contamination des tissus et de la nature fragile des lames de membrane. Commencez cette procédure par le prélèvement de tissus comme décrit dans le protocole textuel. Pour effectuer une section de tissu, réglez d’abord le cryostat à la température de coupe souhaitée.Transférez la biopsie pulmonaire irradiée aux rayons gamma du stockage à moins 80 degrés Celsius dans le cryostat et laissez agir pendant 30 minutes pour équilibrer la température des tissus. À l’aide d’une pince à épiler, fixez la biopsie au mandrin du cryostat à l’aide d’une petite quantité d’adhésif à température de coupe optimale pour faire adhérer la base du tissu au mandrin. Orientez le tissu de manière à ce que la surface plane soit la surface exposée pour la coupe.Assurez-vous que l’OCT ne contamine pas la surface du tissu, car cela pourrait interférer avec l’analyse ultérieure par spectrométrie de masse. Coupez trois sections de tissu à 25 microns d’épaisseur et montez-les sur des lames de membrane PET. Touchez doucement la membrane à la section du tissu et retirez la section.Si une pression trop importante est appliquée, la fine membrane peut se déchirer. Évitez de manipuler excessivement la lame avant le montage afin de ne pas charger la membrane PET et de diminuer l’adhérence de la section du tissu. Conservez la lame de membrane à température ambiante pour permettre le montage par décongélation et l’adhérence réussie du tissu à la membrane.Retirez la lame du cryostat et laissez-la sécher à l’air libre pendant trois minutes. Si LCM-LC-MS/MS n’est pas effectué immédiatement, scellez la lame dans un petit sac hermétique refermable et transférez-la dans le stockage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire de la dissection. Coupez une section adjacente à 10 à 12 microns et dégelez-la sur une lame de verre standard pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine.Des sections supplémentaires peuvent être coupées à ce moment-là pour d’autres colorations histochimiques souhaitées. Retirez le sac scellé contenant la lame du stockage à moins 80 degrés Celsius et laissez-le atteindre la température ambiante pendant cinq minutes. Si la lame froide est immédiatement exposée à l’atmosphère du laboratoire, le tissu sera recouvert de condensation et l’intégrité spatiale du médicament peut être compromise.Allumez le microscope et le laser. Le laser a besoin de cinq à 10 minutes pour chauffer avant que la découpe puisse commencer. Chargez des tubes PCR à bouchon plat de 0,20 millilitre dans le support.Après avoir retiré la lame du sac, prenez une image optique de la coupe de tissu sur la lame PET à l’aide d’un scanner à plat. Placez la diapositive dans le support de diapositive, côté mouchoir vers le bas. Attribuez des tubes de prélèvement séparés à des régions de granulome d’intérêt spécifiques à l’aide du logiciel de microscope.En règle générale, il s’agit d’un poumon, d’un granulome cellulaire et d’un caséum non impliqués, mais cela peut varier en fonction de la pathologie spécifique de la biopsie du granulome. Concentrez-vous sur le tissu à l’aide de l’objectif du microscope 5X. Cette amplification devrait fournir une bonne vue d’ensemble du tissu contenant à la fois les zones de granulome cellulaire et nécrotique.Dans le logiciel, sélectionnez le tube désigné caseum pour le mettre en position sous le tissu. Entrez les paramètres de dissection souhaités. Les réglages typiques pour une section pulmonaire de 25 microns d’épaisseur sont la puissance laser 30, la vitesse 15 et l’ouverture 35.Cependant, ceux-ci différeront en fonction du microscope utilisé et de la baisse potentielle de la puissance en raison de l’âge du laser. Sélectionnez l’outil Dessin libre et, à l’aide d’une souris ou d’un stylet tactile, tracez le contour de la zone souhaitée pour la dissection. La surface de la région sera affichée dans le logiciel.Maintenez les régions sélectionnées en dessous de 500 000 microns carrés pour faciliter la dissection. Répétez la dissection jusqu’à ce que trois millions de microns carrés aient été collectés au total dans le capuchon du tube. À l’occasion, la région disséquée peut rester collée à la membrane environnante et ne pas tomber dans le chapeau de collecte.Supprimez ces régions de la surface totale cumulée en les sélectionnant et en les supprimant manuellement dans le logiciel. Ensuite, sélectionnez le capuchon pour la lésion cellulaire et collectez trois millions de microns carrés de tissu en utilisant le même processus. Sélectionnez le capuchon pour le poumon non impliqué et collectez trois millions de microns carrés de tissu en utilisant le même processus.Notez que le tissu pulmonaire non impliqué contient de nombreuses bronchioles et espaces alvéolaires. Faites très attention à les exclure des régions tissulaires définies pour la dissection. Retirez le porte-capuchon et déclipsez, scellez et étiquetez soigneusement chaque tube.Protégez les tissus disséqués des perturbations de l’air ambiant. Analysez immédiatement les tissus disséqués ou conservez-les à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les avant le traitement et l’analyse LC/MS. En supposant une densité tissulaire d’un gramme par millilitre, préparez le stock d’homogénat en pesant 50 milligrammes de tissu témoin et en ajoutant un tampon PBS à diluer.Homogénéisez le tissu en battant le tissu pulmonaire et le tampon PBS pendant cinq minutes à 1750 tr/min sur un homogénéisateur de billes. Ensuite, diluez un milligramme par millilitre de médicaments dans de l’acétonitrile/de l’eau pour créer des solutions standard de dopage de courbe. Déterminer les concentrations étalons de dopage en fonction du volume de spicule et du volume tissulaire cible.L’exemple illustré est celui d’un étalon de 100 nanogrammes par millilitre utilisant un volume de pointe de 10 microlitres. Retirez les tubes contenant le tissu microdisséqué de l’entreposage à moins 80 degrés Celsius et laissez-les atteindre la température ambiante pendant cinq minutes. Ajoutez 10 microlitres de solution individuelle d’acétonitrile/eau et deux microlitres de tampon PBS dans les tubes contenant le tissu microdisséqué.Pour les tubes de courbe standard et de contrôle de la qualité, ajoutez 10 microlitres de solution de dopage à deux microlitres d’homogénat pulmonaire de contrôle. Ajoutez 50 microlitres de solution d’extraction dans chaque tube. Agitez chaque tube pendant cinq minutes.Ensuite, sonicez-les pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez les tubes à 5 000 tr/min pendant cinq minutes pour former une pastille de film et de tissu dans chaque tube. Après la centrifugation, transférez 50 microlitres de surnageant dans une plaque de puits profonds de 96 puits et diluez avec 50 microlitres supplémentaires d’eau désionisée dans chaque puits.Enfin, effectuez l’analyse LC-MS/MS et la validation de la méthode comme décrit dans le protocole texte. La méthode LCM-LC/MS a d’abord été validée en analysant des régions microdisséquées au laser à partir d’un homogénat de tissu enrichi à l’éthambutol. Comme le montre ici, la méthode était hautement reproductible et a démontré une excellente récupération du médicament.Les concentrations d’éthambutol mesurées par LCM-LC/MS dans plusieurs tissus pulmonaires ont été validées par comparaison directe avec les concentrations déterminées par une approche LC/MS établie. Des concentrations équivalentes ont été détectées par les deux techniques. Les concentrations absolues d’éthambutol dans le parenchyme pulmonaire non impliqué, le bord des lésions cellulaires et le caséum nécrotique ont été déterminées par LCM-LC/MS.Les niveaux de stérilisation de Mycobacterium tuberculosis ont été atteints dans tous les compartiments lésionnels. Les concentrations minimales requises pour tuer 99 % des bacilles réplicatifs extracellulaires et 99 % des bacilles intracellulaires dans les macrophages sont indiquées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de microdisséquer les tissus et de quantifier les niveaux de médicament dans des structures de granulome pulmonaire définies.Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les médicaments antimicrobiens d’évaluer avec précision et quantification si les médicaments administrés atteignent des populations d’agents pathogènes cibles à des concentrations stérilisantes. Cette approche a une large applicabilité à de nombreux tissus et états pathologiques différents.

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Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS) (Vidéo) | JoVE Journal

Quantification spatiale des drogues dans les lésions de la tuberculose pulmonaire par Laser capturer Microdissection liquide chromatographie en spectrométrie de masse (LCM-LC/MS)

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