Name: Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie confocale haute résolution pour visualiser la morphogenèse ramifiée des nerfs périphériques et des vaisseaux sanguins chez la souris adulte. Cette technique permet également d'analyser la distribution des cellules immunitaires dans la peau de l'oreille.

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Nous remercions la direction du laboratoire de K. Gill et appui technique, J. Hawkins et le personnel du National Institutes of Health (NIH) construction animalerie 50 pour l’aide avec soin de la souris et R. Reed et F. bartherline pour l’assistance administrative. Merci aussi à Motegi S. et M. Uwimana pour le partage de leur protocole de dissection du peau oreille, N. Burns pour aide rédactionnelle et les membres de la laboratoire de cellules souches et biologie Neuro-vasculaire de l’aide technique et une discussion réfléchie. T. Yamazaki a été appuyée par la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Heart, Lung, and Blood Institute (HL005702-11 à Y.M.)

Toutes les expériences dans cette section ont été effectuées en vertu de l’approbation de la National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI) et animalier Comité d’urbanisme.
1. adult Mouse Ear peau Collection
<ol><li>Euthanasier des souris adultes par l’exposition de dioxyde de carbone (CO2) dans une chambre fermée, puis vérifiez l’euthanasie par dislocation cervicale. Remarque : L’expérience fait suite à la recommandation de la National Institutes of Health (NIH) pour la méthode d’euthanasie.</li>
	<li>Disséquer l’oreille de la base et le placer dans un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri contenant 2 mL de Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Brièvement couper les poils avec des ciseaux.</li>
	<li>Peler la peau postérieure et antérieure peau loin soigneusement de cartilage intermédiaire. Remarque : Le Cartilage s’attache à la peau antérieure.</li>
	<li>Transférer la partie postérieure et antérieure peau séparément à un 24 puits plaque contenant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % frais glacé (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par puits. Aplatir la peau postérieure et antérieure sous les 4 % PFA.</li>
	<li>Fixer la peau postérieure et antérieure avec cartilage à 4 ° C pendant 1 h.</li>
	<li>Laver la peau postérieure et antérieure 3 fois pendant 5 min dans 1 mL de PBS avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
	<li>Transférer la peau postérieure et antérieure avec cartilage au fond d’un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri. Couper la base région, qui est pliée et a des tissus adipeux et les tissus conjonctifs. Décollez le cartilage de peau antérieur avec une pincette courbée fine.</li>
	<li>Retirez soigneusement les poils, les tissus adipeux et les tissus conjonctifs de l’intérieur de la peau postérieure à l’aide de la pincette courbée fine. Garder la peau humide avec du PBS.</li>
</ol>2. entier-Montez Immunohistochemical souillant de peau d’oreille de souris
Remarque : Toutes les expériences dans les sections suivantes ont été effectuées selon les directives de sécurité de laboratoire de NIH.
<ol><li>Préparer le tampon de blocage. Sérum de chèvre filtre chaleur 10 % inactivé (HIGS) dilué dans du PBS avec 0,2 % triton de tampon de blocage de X-100 (TX-100), ou 10 % de sérum d’âne (DS) dilué dans du PBS avec 0,2 % de tampon de blocage TX-100, à l’aide d’un filtre de 0,45 µm.</li>
	<li>Transférer la partie postérieure et antérieure peau à un 24 plaque bien contenant 1 mL de tampon de blocage de HIGS 10 % ou 10 % tampon de blocage DS / puits. Incuber la peau pendant 30 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant l’anticorps primaires (Table des matières) dans un tampon bloquant (soit 10 %, soit 10 % HIGS DS). NOTE : Ensemble-mout immunohistochemical analyse de peau d’oreille d’adulte avec des anticorps de classe de neurone-spécifique de marqueurs pan-neuronale III β-tubuline (Tuj1, IgG ou souris lapin polyclonal monocloncal IgG2a, dilution de 1/500 à la concentration finale de 2 µg/mL), molécule d’adhésion cellulaire endothéliale Pan-endothélial marqueur plaquettes 1 (PECAM-1, hamster monoclonale IgG, dilution de 1 : 300 à la concentration finale de 3,3 µg/mL), la protéine basique de la myéline de marqueur de gaine de myéline (MBP, lapin IgG polyclonaux, dilution de 1 : 200 à la concentration finale de 5 µg/mL) et un marqueur inflammatoire cellulaire myéloïde CD11b (Rat monoclonal IgG2b, 01:50 dilution à une concentration finale de 20 µg/mL) a été montré dans la Figure 1 et Figure 2. La peau a été incubée avec l’anticorps conjugué Cy3 pour le muscle lisse vasculaire marqueur α muscle lisse actine cellulaire (αSMA) ainsi que des anticorps secondaires (2.6). Les anticorps primaires testées par nous-mêmes ne figuraient dans la Table des matières. Les anticorps primaires multiples provenant de différentes espèces peuvent être mélangées en même temps.</li>
	<li>Transférer la peau postérieure et antérieure à nouveau puits contenant 150 µL de la solution d’anticorps primaires. Incuber la peau avec un mélange doux sur une table de mixage à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, la peau de la partie postérieure et antérieure de transfert de nouveaux puits dans la plaque 24 puits ou aspirer le tampon de blocage contenant des anticorps primaires. Ajouter 1 mL de soit 2 % HIGS dilué dans du PBS avec du tampon de lavage pour le TX-100 0,2 % ou 2 % DS dilué dans du PBS avec du tampon de lavage pour le TX-100 0,2 %. Laver la peau avec 3 changements de la mémoire tampon de lavage toutes les 15 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps secondaire (Table des matières). Diluer l’anticorps secondaires dans le tampon de blocage (soit 10 % HIGS ou 10 % DS) et filtre le tampon de blocage contenant des anticorps secondaires à travers un filtre de seringue en membrane 0,22 µm polyvinylidène difluoride (PVDF) relié à une seringue de 1 mL. NOTE : Alexa 488 ou chèvre 633-conjugués du anti-lapin IgG (H + L) ou IgG2a de souris pour Tuj1, anti-hamster de chèvre Alexa 647 Conjugué IgG (H + L) pour chèvre PECAM-1, conjugué Alexa 488 du anti-lapin IgG (H + L) pour MBP, et rat Alexa 594 Conjugué IgG (H + L) pour CD11b servaient avec la dilution de 1/250 à la concentration finale de 8 µg/mL. La peau est incubée avec un anticorps conjugué Cy3 αSMA (dilution 1/500 à la concentration finale de 2 à 3 µg/mL) en combinaison avec ces anticorps secondaires.</li>
	<li>Centrifuger la solution à 13 000 x g pendant 10 min enlever les particules agrégées de l’anticorps secondaires de la mémoire tampon de blocage. Remarque : Les types d’anticorps secondaires conjugués fluorescents provenant de différentes espèces peuvent être mélangées en même temps.</li>
	<li>Transférer la peau postérieure et antérieure à cupule contenant 150 µL de la solution d’anticorps secondaires. Enrouler la plaque 24 puits dans du papier aluminium pour éviter la lumière et incuber la peau pendant 1 h avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
	<li>Transférez la peau postérieure et antérieure aux nouveaux puits de la plaque 24 puits ou aspirer la solution d’anticorps secondaire en pipette complètement. Ajouter 1 mL de tampon de lavage HIGS 2 % ou 2 % tampon de lavage DS.</li>
	<li>Enrouler la plaque 24 puits dans du papier aluminium et laver avec 3 changements de la mémoire tampon de lavage toutes les 15 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
</ol>3. montage de la peau de l’oreille de la diapositive
<ol><li>Placez la peau sur le fond d’un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri. Retirez soigneusement les poils, les tissus adipeux, les tissus conjonctifs, poussières et les fibres à l’intérieur de la peau à l’aide de fine pince courbée sous stéréomicroscope avec faible éclairage afin de minimiser la grande photo de blanchiment. Garder la peau humide avec du PBS.</li>
	<li>Transférer la peau à une lame de microscope adhésif avec une pincette. Placez la peau postérieure et antérieure avec l’intérieur vers le haut sur la diapositive. Aplatir la peau à l’aide de pinces.</li>
	<li>Montez la peau dans un milieu liquide anti-fondu montage pour éviter le photoblanchiment et préserver les signaux fluorescents. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est sur ou autour de la peau.</li>
	<li>Couvrir avec une lamelle couvre-objet sur les échantillons de peau soigneusement et entreposer les diapositives échantillon de peau monté dans la nuit sombre à température ambiante pour permettre que le support de montage se ferme. Sceller la lamelle couvre-objet de la diapositive avec vernis à ongles et conserver à 4 ° C pour le stockage à long terme.</li>
</ol>4. confocal Microscopy
<ol><li>Mettre en place des lasers pour fluorophores. Un microscope confocal avec trois sources laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm et HeNe 633 nm) est utilisé dans cette expérience.</li>
	<li>Utilisez l’outil de balayage séquentiel, qui excite en même temps les échantillons colorés à triple, pour éviter et réduire les chevauchements. NOTE : Images seront prises de manière séquentielle, en utilisant le mode de balayage séquentiel.</li>
	<li>Image sous un objectif 10 X. Utilisez l’outil d’analyse de tuile pour capturer la peau toute oreille. La valeur de Z-pile et s’assurer que la position z couvre toute l’épaisseur de la peau de l’oreille.</li>
</ol>

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li>
<li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature%3A+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li>
<li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons%3A+looking+for+innervation+in+all+the+right+places%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749(2014).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Whole+Mount%3A+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick%2C+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540(2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li>
<li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoriasis%3A+what+we+have+learned+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li>
<li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+challenges+of+chronic+wounds%3A+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li>
<li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615439">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit l’imagerie immunonohistochemical entiers de peau d’oreille d’adulte pour l’analyse des structures neuro-vasculaires et de la distribution de cellules immunitaires. Nous croyons que cette méthode a de nombreux avantages expérimentales aux chercheurs d’étudier la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la répartition en trois dimensions des composants de peau y compris les cheveux et les cellules immunitaires follicules. Les résult...

La peau se compose de trois couches : épiderme, derme et hypoderme. Il a servi comme modèle pour étudier les cellules souches entretien, différenciation et morphogenèse en développement ainsi que la régénération, tumorigenèse et l’inflammation chez les adultes. La peau est richement vascularisée et innervée tels que le développement du système nerveux périphérique et du système vasculaire est bien coordonné.
Nous avons déjà démontré une technique d’imagerie entier-Montez la peau embryonnaire avec étiquetage multiples pour l’étude des nerfs périphériques intacts et les vaisseaux sanguins, y compris leurs composants cellulaires1,2,3, 4: axones sensoriels, axones sympathiques, Schwann dans les nerfs, les cellules, les cellules endothéliales, péricytes et cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV) dans les vaisseaux sanguins. Au cours de l’angiogenèse, un premier réseau capillaire subit un remodelage vasculaire intense et se développe en un réseau de ramification vasculaire hiérarchique. Dans le derme en développement/hypoderme, artères branche aux côtés des veines et des nerfs sensoriels périphériques puis forment adjacentes aux artères. Une fois le réseau vasculaire hiérarchique est complètement recouvert de CMLV, nerfs sympathiques s’étendent le long et innervent le grand diamètre des vaisseaux sanguins1,5,6. Malgré l’importance de l’association étroite entre les développement des systèmes nerveux et vasculaires, une question importante a consisté à aborder ce qui se passe aux réseaux neuro-vasculaires dans diverses situations pathologiques chez l’adulte. Une imagerie de haute résolution en trois dimensions est nécessaire pour apprécier la pathogenèse, ainsi que de la morphogenèse ramification reconnaissable anatomiquement et structuration.
Morphogenèse neuronale et vasculaire dans la peau de souris adulte est couramment analysée par la coloration de la section de tissu. D’autres études ont utilisé entier-Montez l’imagerie de la peau pour visualiser les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, en plus les follicules pileux, glandes sébacées et arrecteur pili muscles7,8,9. Cependant, l’épaisseur de la peau adulte a rendu difficile analyser la peau dans son ensemble de la profondeur.
Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle imagerie haute résolution d’entier-montent de peau d’oreille d’adulte pour surmonter ces difficultés. Peau de l’oreille est facilement accessible pour la dissection et l’imagerie entier-Montez subséquent de la peau sur l’ensemble de la profondeur. Ainsi, c’est une méthode simple et hautement reproductible qui peut être appliquée pour comparer l’architecture tridimensionnelle des systèmes nerveux et vasculaires périphériques dans la peau, avec des mesures de quantification globale. Nous avons démontré que l’alignement des nerfs sensitifs et sympathiques périphériques avec grand diamètre des vaisseaux sanguins est préservée dans la peau de l’adulte. Le but du présent protocole est de visualiser la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la distribution des cellules immunitaires au niveau cellulaire dans les modèles de souris adulte dans diverses conditions telles que l’inflammation et régénération.

<table><tbody><tr><td>10 x solution saline tamponnée au phosphate</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, sans Ca2+/mg2+</td></tr><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, avec Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>16 % Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixateur, dilué dans PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Détergent</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Composant du tampon de blocage/lavage</td></tr><tr><td>Normal Normal sérum d’âne</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Composant du tampon de blocage/lavage</td></tr><tr><td>Pince à épiler fine incurvée</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler incurvée</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration 0,45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>Pour la filtration</td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>Pour filtration</td></tr><tr><td>Filtre à seringue Unité 0,22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>Pour la filtration</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Support de montage anti-décoloration</td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72180</td><td>Pour l’étanchéité</td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Logiciel d’édition</td><td>graphique Adobe</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Logiciel d’édition</td><td>graphique Adobe</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Logiciel de traitement d’images</td></tr><tr><td>Anticorps anti-PECAM-1 (CD31)</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, marqueur de cellules endothéliales vasculaires, anticorps</td></tr><tr><td>anti-PECAM-1 (CD31)</td> 1:300 <td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, marqueur de cellules endothéliales vasculaires, anticorps</td></tr><tr><td>anti-&#945 ;SMA 1:300 conjugué à cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>IgG2a de souris, marqueur de cellules musculaires lisses vasculaires, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-EphB1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Polyclonal de chèvre, marqueur de cellules endothéliales veineuses 1:100, 1:100</td></tr><tr><td>Classe III spécifique aux neurones &#946 ;-tubuline (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, IgG polyclonales de lapin, marqueur panaxonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Tuj1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>IgG2a de souris, marqueur panaxonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-MBP</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>IgG polyclonale de lapin, marqueur de myélinisation, 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps anti-tyrosine hydroxylase</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Marqueur de neurone sympathique polyclonal de lapin, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-périphérine</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Polyclonal de lapin, marqueur neuronal périphérique, 1:1000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD11b</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>IgG2b de rat, marqueur cellulaire inflammatoire (macrophages),</td></tr><tr><td>anticorps anti-CD45</td> 1:50 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>IgG2b kappa de rat, marqueur cellulaire pan-hématopoïétique, anticorps anti-CD3 1:500</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, marqueur de cellules immunitaires, 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD45R (B220)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, marqueur de cellules inflammatoires, 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Polyclonal de lapin, 1:300</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Polyclonal de poulet, 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-&#946 ;-gal</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Polyclonal de lapin, 1:5000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Polyclonal de lapin, 1:300</td></tr><tr><td>IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Alexa 488 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Anticorps secondaire polyclonal de lapin, 1:250</td></tr><tr><td>IgG anti-hamster de chèvre (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Anticorps secondaire polyclonal de hamster, 1:250</td></tr><tr><td>IgG anti-rat de chèvre (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Anticorps secondaire polyclonal de rat, 1:250</td></tr><tr><td>IgG2a anti-souris de chèvre Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Anticorps secondaire IgG2a de souris, 1:250</td></tr></tbody></table>

entier-montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification neuro-vasculaire et la distribution de cellules immunitaires

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Nous présentons ici un protocole d’une peau d’oreille d’adulte entier-montent d’imagerie technique pour étudier la morphogenèse de ramification neuro-vasculaire tridimensionnelle complète et structuration, ainsi que distribution de cellules immunitaires au niveau cellulaire. L’analyse des structures anatomiques nerveuses et des vaisseaux sanguins périphériques dans les tissus adultes fournit un aperçu de la compréhension du câblage neuro-vasculaire fonctionnelle et la dégénérescence neuro-vasculaires dans certaines pathologies telles que la cicatrisation des plaies. Comme système modèle hautement instructif, nous avons concentré nos études sur peau d’oreille d’adulte, qui est facilement accessible pour la dissection. Notre protocole simple et reproductible fournit une description précise des composants cellulaires de la peau entière, tels que les nerfs périphériques (axones sensoriels, axones sympathiques et les cellules de Schwann), des vaisseaux sanguins (cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses vasculaires ) et des cellules inflammatoires. Nous croyons que ce protocole préparera le terrain pour enquêter sur des anomalies morphologiques dans les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que l’inflammation dans la peau de l’oreille d’adulte dans des conditions pathologiques différentes.

Souris adulte oreille postérieure (Figure 1 a) et peaux oreille antérieure (Figure 1 b) ont été immunomarquées avec anticorps anti-αSMA (rouge), Tuj1 (vert) et PECAM-1 (bleu). Peau postérieure a été immunomarquées pour étudier la distribution de neuro-immunitaire à l’aide d’anticorps anti-CD11b (rouge) et MBP (vert), ainsi que Tuj1 (bleu) (Figure 2 a). Distribution de CD11b+ des cellules i...

Nous décrivons ici une méthode d’imagerie de haute résolution entier-montent dans la peau d’oreille de souris adulte entier, qui nous permet de visualiser la ramification de la morphogenèse et structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que distribution de cellules immunitaires.

Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la morphogenèse ramifiée et la structuration des nerfs périphériques et des vaisseaux sanguins, ainsi que la distribution des cellules immunitaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la neurobiologie, de la biologie vasculaire et de l’immunologie en mettant en lumière les anomalies morphologiques des nerfs périphériques et des vaisseaux sanguins, ainsi que l’inflammation. La principale force de cette technique est que nous pouvons visualiser les composants cellulaires des nerfs périphériques, des vaisseaux sanguins et des cellules immunitaires de la peau sur toute sa profondeur et comparer l’architecture tridimensionnelle des systèmes nerveux et vasculaire.Cette méthode peut donner un aperçu des structures neurovasculaires et de la distribution des cellules immunitaires chez les souris juvéniles et adultes dans des conditions normales et pathologiques. Après avoir euthanasié des souris adultes selon le protocole de texte, disséquez l’oreille à partir de la base et placez-la dans une boîte de Pétri de 35 x 10 millimètres contenant deux millilitres de HBSS. Ensuite, utilisez des ciseaux

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Developmental Biology

Biologie du développement

Nous introduisons une immunohistochimie toute monture et laser microscopie confocale à balayage avec un étiquetage multiple pour analyser la formation de complexes réseau vasculaire dans la peau de souris membres de l'embryon.

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

La matrice extracellulaire subit un remodelage important lors de la cicatrisation des plaies, l'inflammation et la tumorigenèse. Nous présentons une nouvelle approche de microscopie par immunofluorescence intravitale de visualiser la dynamique des fibrillaire ainsi que maille-comme composants de la matrice avec une résolution spatiale et temporelle en utilisant épifluorescence ou la microscopie à deux photons.

À long terme intravitale immunofluorescence imagerie de tissus composants matriciels avec épifluorescence et deux microscopie biphotonique

La peau des mammifères contient un large éventail de structures - comme les follicules pileux et les terminaisons nerveuses - qui présentent des modèles distinctifs de l'organisation spatiale. Analyser la peau comme un support plat profite de la géométrie à 2 dimensions de ce tissu pour produire toute l'épaisseur des images haute résolution des structures de la peau.

Appartement Mont imagerie de la peau de souris et son application à l&#39;analyse des follicules pileux Modélisation et sensorielle Axon Morphologie

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d'autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

Nous décrivons ici une nouvelle préparation pour l’imagerie des terminaisons sensorielles lancéolées en direct des terminaisons palissadiques qui innervent les follicules pileux de la peau de l’oreille de souris pendant la coloration et la décoloration avec des colorants de styrylpyridinium.

Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris oreille peau

Ce protocole décrit l'induction d'un modèle d'ischémie-reperfusion (IR) sur la peau de l'oreille de la souris utilisant un aimant de serrage. En utilisant un modèle d'imagerie intravitale sur mesure, nous étudions dans les réponses inflammatoires in vivo post-reperfusion. La raison derrière le développement de cette technique est d'étendre la compréhension de la façon dont les leucocytes réagissent aux blessures IR de la peau.

Induire ischémie-reperfusion chez la souris Ear Skin pour Intravitale multiphotonique Imaging des réponses immunitaires

Le modèle de l' oreille de la souris sans poils SKH1-Hr permet la microscopie à fluorescence intravitale de la microcirculation et phototoxique induction de thrombus sans préparation chirurgicale préalable dans le lit microvasculaire examiné. Par conséquent, l'oreille de la souris sans poil est un excellent modèle in vivo pour étudier les interactions complexes pendant la formation de thrombus microvasculaire, l' évolution de thrombus et thrombolyse.

Microscopie intravitale et thrombus induction dans le lobe de l&#39;oreille d&#39;une souris sans poils

Le poussin est un organisme modèle rentable, accessible et largement disponible pour une variété d’études. Ici, une série de protocoles est détaillée pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et à la régénération de l’oreille interne aviaire.

Méthodes in ovo et ex ovo pour étudier le développement de l’oreille interne aviaire

Le protocole présente un nouvel outil pour simplifier l’imagerie intravitale à l’aide de la microscopie confocale inversée.

Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

Ce protocole, destiné aux utilisateurs novices de tissu de l’oreille interne de souris, détaille de manière exhaustive les étapes de traitement des oreilles internes de souris à différents stades de développement pour l’immunomarquage en section.

Cryosectionnement et immunomarquage du tissu de l’oreille interne de souris : du stade embryonnaire au stade adulte

Découvrez une méthode d'imagerie confocale haute résolution pour visualiser la morphogenèse ramifiée des nerfs périphériques et des vaisseaux sanguins chez la souris adulte. Cette technique permet également d'analyser la distribution des cellules immunitaires dans la peau de l'oreille.

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Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

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