Name: Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Apprenez à créer des cassures double-brin de l'ADN localisées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser 405 nm et à quantifier automatiquement la dynamique des facteurs de réparation. Cette méthode permet d'étudier le recrutement des protéines aux lésions de l'ADN.

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Ce travail a été soutenu par les Sciences naturelles et en génie conseil de recherches [subvention à la découverte 5026 à a.M] et par une nouvelle génération de bourses d’études scientifiques de la société de recherche du Cancer [21531 à a.M]. Nous remercions m. Jean-François Lucier fournissant l’excellent contrôle de la qualité des scripts Python de Fidji et conseils sur l’analyse statistique. Nous remercions le Dr. Stephanie A. Yazinski pour la recette de solution de fixation IF. Nous remercions Paul-Ludovic Karsenti de l’aide avec les mesures de puissance laser.

1. sensibilisation préalable des cellules
<ol><li>24 h avant l’expérience de micro-irradiation, graines 40 000 U2OS cellules / puits dans 1 x DMEM contenant 10 % FBS dans 8 puits culture glisse avec fond de 170 µm d’épaisseur type lamelle verre/polymère afin d’assurer la transmission maximale de 405 nm lumière laser et l’imagerie excellent avec un laser à balayage confocal microscope inversé. Si vous utilisez un micro-lames 8 puits, utilisez 500 µL des solutions ou des médias / puits pour tous les traitements ultérieurs et les étapes de lavage du protocole. Remarque : En raison de leur morphologie plate, bonne adhérence et gros noyaux, U2OS cellules facilitent la détection du recrutement de protéines dans les sites de micro-irradié mais d’autres types de cellules adhérentes peuvent être utilisés selon les besoins. Cellules devraient idéalement être d’environ 80 % irradiés de confluence au moment de l’irradiation micro pour augmenter le nombre de cellules par expérience. Confluence très élevé peut entraîner des altérations de cycle cellulaire qui peuvent perturber les voies de réparation spécifiques tels que la recombinaison homologue qui a lieu pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire9.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO2et puis les sensibiliser les cellules avec (étape 1.3) BrdU ou (étape 1.4) BBET (Hoechst 33342). Remarque : Pour observer le recrutement direct d’une protéine d’intérêt (POI) pour les lésions de l’ADN, transfecter ou transduce ADN plasmidique transportant une fusion entre une protéine fluorescente et un POI 24h après l’ensemencement de la cellule. 24h après-transfection/transduction, les sensibiliser et micro-irradier les cellules pour surveiller le recrutement de l’IPE à sites de dommages d’ADN en temps réel.</li>
	<li>Pour augmenter le nombre des CDB générés par exposition au laser 405 nm, ajouter 10 µM de BrdU aux médias pendant 24 h avant micro-irradiation. Avant irradiation micro, à l’aide d’une micropipette, rincer les cellules deux fois avec support sans rouge de phénol pour assurer une exposition maximale des cellules au laser 405 nm.</li>
	<li>Vous pouvez également traiter les cellules pendant 15 minutes avec BBET à 10 µg/mL dans le milieu approprié dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C. Après le traitement, rincez deux fois avec support sans rouge de phénol avant micro-irradiation.</li>
</ol>2. micro-irradiation des cellules
<ol><li>Sélectionnez un approprié microscope confocal à balayage laser. Remarque : Les expériences présentées ici ont été réalisés sur un système de microscope équipé de 50 mW 405 nm laser ligne et un objectif à huile 63 X 1.4 ouverture numérique. Pour générer le CDB, cellules ont été irradiés micro à 1 X zoom scan à 1 024 x 1 024 pixels/field (0,21 µm/pixel à un grossissement de X 63) et en mode unidirectionnel à 8 µs/pixel. La puissance du laser utilisée était de 25 % et 80 % pour les cellules BBET et BrdU-pre-sensibilisée, respectivement. Pour aider les utilisateurs à configurer leur système, post-l’objectif laser sur le système présenté a été mesurée à l’aide d’un wattmètre conformément aux instructions du fabricant. Les mesures correspondent à 2,6 mW et 7,0 mW pour BBET et BrdU-pre-sensibilisés à cellules, respectivement.</li>
	<li>
Allumez le microscope et la chambre environnementale.
	<ol>
<li>La valeur de la chambre à 37 ° C, avec 5 % de CO2 avant que les échantillons sont placés dans l’incubateur sur scène pour éviter un stress inutile aux cellules tout en assurant la cinétique homogène de DDR à travers des expériences.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sélectionnez les champs avec des cellules bien réparties, ajuster la mise au point et inscrire leur position pour faciliter l’acquisition d’images après le protocole de l’IF. Acquérir au moins une image qui servira de point de référence dommages avant de suivre la cinétique du recrutement de protéines après une irradiation micro. Remarque : Récipients de culture maillées peuvent également servir pour faciliter la localisation des cellules irradiées micro à des étapes ultérieures.<ol>
<li>Pour les expériences d’IF à l’aide de cellules marquées BBET, ajuster le focus sur les cellules à l’aide de 405 nm laser à la plus faible puissance laser permettant de visualiser les cellules afin d’éviter des dommages à l’ADN injustifié.<ol>
<li>Évitez d’utiliser widefield fluorescence pour ajuster le focus sur cellules BBET comme la lumière ultraviolette émise par la lampe va entraîner des lésions de l’ADN à des sites illuminés.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Si vous utilisez les cellules marquées BrdU, ajuster le focus à l’aide de contraste interférentiel différentiel (DIC) ou l’imagerie de contraste de phase en regardant nucléaire des fonctionnalités telles que les nucléoles.</li>
		<li>Si à l’aide de cellules exprimant fluorescent marqué POI, sélectionnez un plan focal avec une intensité de fluorescence représentatif. Remarque : Évitez les cellules qui expriment des niveaux très élevés de l’IPE car localisation artéfactuelle peut entraîner une forte surexpression. En outre, sélectionnez les cellules qui expriment le POI à des niveaux comparables (sélection des clones stables est fortement recommandée afin de minimiser les variations des niveaux de recrutement et d’expression POI).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurer le microscope pour l’étape de micro-irradiation à l’aide de la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) _module du système. Remarque : Les paramètres les plus importants à considérer lors de mise en place du système de microscope pour des expériences de micro-irradiation sont : la puissance du laser 405 nm, nombre d’itérations (c.-à-d., nombre de fois le laser risque de dépasser les mêmes coordonnées), nombre de pixels/domaine (63 X grossissement et résolution de 1 024 x 1 024, 1 pixel = 0,21 µm) et les temps de pause par pixel. Tous ces facteurs auront une incidence la quantité d’énergie que les cellules expérience et ainsi la quantité et le type d’ADN endommagent généré (voir la Discussion pour plus amples renseignements sur les doses optimisation).</li>
	<li>Grâce au module FRAP du système microscope, micro-irradier les cellules. Remarque : Sur la plupart des systèmes, micro-irradiation des cellules multiples peut être effectuée dans un seul champ en taches ou lignes/rectangles (généralement 1 à 2 µm de large). Lors de l’exécution en direct-imagerie de protéines marquées fluorescent immédiatement après dommages, limiter l’irradiation micro à un petit nombre de cellules par champ parce que le temps pris pour micro-irradient chaque cellule se traduira par une induction retardée de la DDR. Ceci est particulièrement important pour l’analyse des protéines qui sont recrutés très rapidement à des lésions de l’ADN.</li>
	<li>
Après micro-irradiation, remettre les puits multiples lames ou plaques dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant la durée nécessaire avant de traiter des échantillons pour si (Section 5) ou procéder immédiatement à vivre-imagerie (Section 3).
	<ol>
<li>Dans un premier temps, fixer les cellules en quelques minutes et jusqu'à quelques heures après irradiation pour le protocole de l’IF. Selon le POI, cinétique de recrutement peut varier. En règle générale, les protéines qui sont associées à la chromatine à la CDB et BSN localiserez très rapidement à la lésion et disparaissent parfois moins de 5 min. Certains facteurs tels que ceux qui assemblent à ADN simple brin seront recrutés à des moments plus tard une fois que l’appareil de la résection a été engagé et d’y restent pendant des heures (voir Figure 1 et référence4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. vivre-imagerie de protéines marquées fluorescent
<ol><li>Effectuer le Time-lapse imagerie des cellules irradiées micro. Pour des protéines qui sont recrutés très rapidement aux lésions, quelques secondes par image seront idéal, mais pour les protéines qui localiser à la zone endommagée par la suite (p. ex., facteurs de résection), acquisition peuvent être effectuée toutes les 1 à 2 min jusqu'à l’obtention d’un plateau. Remarque : Réduire la puissance du laser pour l’acquisition d’images pour éviter le blanchiment autant que possible tout en assurant que le recrutement de protéines dans les sites de dommages n’atteint pas saturation qui empêcherait la quantification du signal et des analyses subséquentes (Voir l’analyse des données Section 4). Sur le système présenté, l’imagerie a été fait avec un 63 X / 1.4 huile objective à l’aide d’un temps de pause de 8 µs/pixel, résolution de 1 024 x 1 024, zoom de X 1 et une moyenne de 2. Notez que ces paramètres peuvent devoir être optimisé pour les autres systèmes et/ou des expériences différentes.</li>
	<li>Micro-irradier les cellules dans des champs supplémentaires jusqu'à la cinétique sont obtenus pour des cellules de 15-30. Répéter les expériences au moins 3 fois dans les réplicats biologiques afin d’assurer l’exactitude et la reproductibilité de la cinétique de recrutement. Remarque : Lors de l’adaptation de ce protocole se rapportant à un système confocal spécifique, il peut être utile de commencer par la surveillance de la cinétique de recrutement d’un facteur de maintenance génomiques connues fluorescent marqué (par exemple, 53BP1-GFP, RPA32-GFP, etc.). À l’aide d’images en direct afin d’optimiser les conditions d’irradiation-micro permettra à l’utilisateur de tester rapidement les paramètres multiples.</li>
</ol>4. recrutement cinétique analyse
<ol><li>Installer le plugin de Microirradiation analyse10 dans les Fidji image analyse logiciel11.</li>
	<li>
Ouvrez les images acquises dans les îles Fidji. Sélectionnez «L’analyseur de dégâts» dans le menu déroulant plugins dans la suite de l’analyse Microirradiation. Suivez les invites pour définir une région de fond d’intérêt (ROI) (généralement 3 x 3 µm) et les ROIs irradiés et non irradiés dans chaque cellule micro-irradié.
	<ol>
<li>ROIs d’utilisation de la même taille pour minimiser les biais potentiels en moyenne intensités du signal. Pour les images acquises, inclure au moins une frame avant irradiation qui sera utilisée comme point de référence pour surveiller le recrutement sur les sites de micro-irradié.</li>
		<li>Une fois que toutes les données ROI ont été collectées au cours de la série complète de Time-lapse, enregistrez le fichier créé par le plugin contenant les résultats dans un fichier csv (fichier délimité par des virgules) ou txt (fichier délimité par des tabulations). Ce fichier contient des mesures de l’intensité moyenne pour chaque instant et chaque ROI (moyenne intensité fond, moyenne intensité Non irradiées et moyenne intensité irradié). Remarque : Le plugin soustrait automatiquement l’intensité de l’arrière-plan (jeb) de l’intensité de la ROIs irradiée (jes) et la ROIs non irradiées (j’ain). Il calcule également un rapport entre les deux valeurs (voir la formule ci-dessous) pour corriger la photoblanchiment (irradié/Non-irradiés). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57410/57410eq1v2.jpg"> Le plugin calcule également une normalisation entre le premier point du temps (valeur 1) et tous les autres points dans le temps pour chaque noyau (ratio par rapport au premier point de temps). On trouvera des renseignements supplémentaires sur le site Web de plugin10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Effectuer l’analyse en utilisant le plugin pour toutes les cellules irradiées micro (au moins 15 à 30 cellules) et graphique de l’enrichissement relatif moyen dans les régions irradiées micro au fil du temps. Calculer les erreurs-types de la moyenne pour chacune des données point et tracer.
	<ol>
<li>Confirmer les différences de cinétique de recrutement entre deux conditions expérimentales en effectuant de Student t-tests pour chaque point de données.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. si protocole
<ol><li>
Préparer des solutions de IF. Préparer la solution de pré/post-extraction (glacée 1 x PBS contenant 0,25 % Triton X-100), solution de lavage (1 x PBS contenant 0,05 % Tween-20), bloquant la solution (1 x PBS contenant 3 % de BSA et 0,05 % Tween-20) et la solution de fixation (paraformaldéhyde 3 % + 2 % de saccharose dans du PBS 1 x) dans des tubes coniques en polypropylène. Remarque : Pour un seul micro-lames 8 puits, 10 mL de solution de pré/post-extraction, 50 mL de solution de 10 mL de solution de saturation et 5 mL de solution de fixation de lavage sont nécessaires.<ol>
<li>Préparer la solution de fixation.<ol>
<li>Sous une hotte chimique, mélanger 400 mL d’eau bidistillée (ddH2O) avec 15 g de paraformaldéhyde et 30 µL de 10 N NaOH dans une fiole d’Erlenmeyer de 1 litre.</li>
			<li>Fermer le récipient et la chaleur à 65 ° C sur une plaque chauffante d’agitateur magnétique tout en remuant pour solubiliser la paraformaldéhyde complètement.</li>
			<li>À l’aide d’une pipette 25 mL, ajouter 50 mL de 10 X PBS, remuer et filtre à l’aide d’un filtre de 0,45 µm.</li>
			<li>Ajouter 10 g de saccharose et compléter à 500 mL avec FD2O.</li>
			<li>Partie aliquote de la solution dans les tubes coniques 15 mL ; conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer les solution de coloration en diluant une solution mère de 1 mg/mL de 4, 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) 1 : 1 000 dans du PBS 1 x des noyaux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l’aide d’une micropipette, retirez soigneusement les médias par les puits des lames de microscope multipuits ou plaques et se laver immédiatement avec 500 µL de solution de lavage IF en changeant la solution deux fois sans attendre. NOTE : Les données de cas présentées ici ont été obtenues à l’aide de cellules cultivées dans des lames de 8 puits microscopie qui ont été lavés et incubés dans 500 µL de toutes les solutions. Des volumes doivent être ajustées selon les contenants de culture cellulaire utilisés par les expérimentateurs. En outre, effectuer le protocole IF avec un soin extrême que les cellules peuvent facilement se détacher du fond verre/polymère. Utiliser une micropipette pour toutes les modifications de la solution pour minimiser la perte de cellules.</li>
	<li>Incuber sur glace pendant 5 min avec 500 µL de glacé si solution de pré/post-extraction et agiter doucement à la main pendant 15 à 30 s effectuer l’extraction avant l’étape qui supprime la plupart des protéines cytoplasmiques et nucléoplasmiques et maximise le signal de la chromatine / Facteurs associés à l’ADN.</li>
	<li>Laver deux fois avec 500 µL de solution de lavage IF.</li>
	<li>Incuber pendant 15 min à température ambiante dans 500 µL de solution de fixation IF. Alternativement, utiliser une solution de paraformaldéhyde pré-faites (3-4 %) pour l’étape de fixation.</li>
	<li>Laver deux fois avec 500 µL de solution de lavage IF.</li>
	<li>Incuber sur glace pendant 5 min à 500 µL de solution à pré/post-extraction de glacee IF et agiter la diapositive doucement à la main pour effectuer l’étape perméabilisation.</li>
	<li>Laver deux fois avec 500 µL de solution de lavage IF.</li>
	<li>Incuber au moins 30 min à température ambiante avec 500 µL de solution de saturation IF.</li>
	<li>Enlever la solution de saturation à l’aide d’une micropipette et incuber pendant la nuit dans une chambre humidifiée à 4 ° C avec des anticorps primaires de 250 µL dilués en bloquant la solution. Remarque : Il est conseillé d’effectuer l’incubation avec l’anticorps primaires dans l’ordre pour éviter d’éventuels artefacts de co-localisation. Une fois que les contrôles appropriés ont été effectués, en même temps incuber des anticorps primaires pour accélérer le processus.</li>
	<li>Laver quatre fois pendant 5 min dans 500 µL de solution de lavage IF avec agitation modérée (60 RPM sur un agitateur).</li>
	<li>Incuber pendant 1 heure à 37 ° C, avec 250 µL d’anticorps secondaires dilué dans une solution de blocage dans une chambre humidifiée. NOTE : Protéger les échantillons de lumière lors de l’addition d’anticorps secondaires marqué fluorescent.</li>
	<li>Laver quatre fois chacun pendant 5 min à 500 µL de solution de lavage IF avec agitation douce.</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 5 min à 500 µL de 1 x PBS contenant 1 µg/mL DAPI pour colorer les noyaux.</li>
	<li>Laver deux fois avec 500 µL de PBS 1 x et laisser les cellules de 500 µL de solution de PBS pour l’imagerie 1 x.</li>
	<li>À l’aide de diapositives maillées ou positions de la scène enregistrée, trouver les cellules irradiées micro à l’aide d’un marqueur des dommages bien caractérisé (p. ex., γ-H2A.X, RPA32, etc.).</li>
	<li>Image de la culture multipuits diapositives ou des plaques sur les canaux pertinents en utilisant les paramètres appropriés sur un microscope confocal à balayage laser. Remarque : Sur le système présenté, l’imagerie a été fait avec un 63 X / 1.4 huile objective à l’aide d’un temps de pause de 8 µs/pixel, résolution de 1 024 x 1 024, zoom de X 1 et une moyenne de 2. Notez que ces paramètres peuvent devoir être optimisé pour les autres systèmes et/ou des expériences différentes.</li>
</ol>

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<li>Dinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+multiple+DNA+repair+pathways+by+sub-nuclear+damage+induction+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods.</a> Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Research. 37 (9), e68(2009).</li>
<li>Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Laser+Micro-irradiation+for+Examination+of+Single+and+Double+Strand+Break+Repair+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+a+%CE%B3H2AX-53BP1+interaction+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).</li>
<li>Soultanakis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+of+8-oxoguanine+in+nuclear+and+mitochondrial+DNA+of+cultured+cells+using+a+recombinant+Fab+and+confocal+scanning+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Utilisant les méthodes décrites ci-dessus, 405 nm laser micro-irradiation des cellules pré sensibilisées avec BBET ou BrdU permet la génération localisée des lésions de l’ADN dont la CDB dans le noyau des cellules humaines adhérentes. Cinétique de DDR à ces DSBs sont similaires à ceux générés avec d’autres méthodes dans les cellules eucaryotes9,18,19. Résection de DSB sur les sites de micro-irradié mène à ssDNA-génération qui pe...

Les cellules sont constamment exposés à des sources de dommages à l’ADN endogènes et exogènes qui menacent leur intégrité génomique. Le DDR est un ensemble de voies que détecter et réparer les lésions de l’ADN pour maintenir la stabilité du génome de signaux de signalisation. Cassures double-brin d’ADN (CDB), le DDR se produit principalement sur les deux plateformes complémentaires : γ-H2A.X-étiqueté de la chromatine et une région d’ADN (ADN simple brin) simple brin réséquée généralement recouvertes d’ADNsb-liaison complexe Apr1,2.
UV-laser micro-irradiation des cellules pré sensibilisées avec la thymidine analogique 5-bromo-2' désoxyuridine (BrdU) ou la teinture d’ADN bisbenzimide éthylate TRIHYDROCHLORURE (BBET, Hoechst 33342) crée un mélange de lésions de l’ADN y compris cassures simple brin ( BSN) et CDB qui suscitent un DDR localisé sur la chromatine et ADN simple brin plates-formes3,4. Des travaux antérieurs ont montré que recrutement des facteurs d’entretien de génome de ces deux plateformes distinctes à ORD peut être distinguée en utilisant des lasers de haute énergie UV-A (335-365 nm) combinés avec IF2,5. Microscopes équipés de ces lasers sont coûteuses car elles nécessitent un laser à haute énergie et dédiés objectifs transmission UV-A, ce qui les rend beaucoup moins répandue dans les milieux universitaires et pharmaceutiques que les microscopes confocaux à balayage laser avec laser à 405 nm lignes. L’étude du recrutement de protéines et d’échange sur les sites de micro-irradiés s’oppose également à l’analyse d’image manuel laborieux pour décrire le comportement dynamique des facteurs d’entretien de génome.
Ici, nous montrons que la sensibilisation préalable des cellules avec des taches d’acide nucléique BrdU ou BBET suivie par micro-irradiation utilisant un laser à 405 nm sur un microscope confocal commun permet de contrôler la dynamique de facteur de maintenance du génome aux lésions de l’ADN. À l’aide de γ-H2A.X ou sous-unités complexes de l’armée patriotique rwandaise comme marqueurs de la plate-forme avec empilement z pour une plus grande profondeur de champ et déconvolution pour une résolution améliorée permet l’expérimentateur de discriminer les facteurs qui sont recrutés localement à la CDB de celles qui se propagent à domaines de chromatine grand entourant la lésion initiale. Cette sous-classification selon différents compartiments intra nucléaires contribue à affiner les rôles possibles des protéines non caractérisés recrutés aux sites de micro-irradié. En outre, nous fournissons des protocoles pratiques et optimisée des pipelines pour rapidement analyser la dynamique des facteurs d’entretien de génome en utilisant le logiciel open-source Fidji (une distribution de ImageJ)6,7,8. Ces raffinements aux méthodes actuelles de micro-irradiation de l’étude du processus de DDR rendent possible dans pratiquement n’importe quel arrangement de laboratoire.

<table><tbody><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 Microscope confocal à balayage laser résonant</td><td>Logiciel Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV3000 (version 2.1)</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405 nm</td><td>laser Source de rayonnement cohérent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de microscope AIO-UNO-OLYUS-1</td><td>Okolab</td><td>OKO-UNO-1</td><td></td></tr><tr><td>60X /1.4 Objectif</td><td>Olympus</td><td></td><td>Oil objectif d’immersion</td></tr><tr><td>Lames de culture à 8 puits sur verre de couverture (X-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6190.802</td><td></td></tr><tr><td>U2OS ostéosarcome lignée cellulaire humaine</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td>Lignées cellulaires stables&nbsp ;</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phénylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Attention</td></tr><tr><td>toxique 5-bromo-2&prime ;-désoxyuridine&nbsp ;( BrdU)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59-14-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Attention</td></tr><tr><td>toxique Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA 0,1 %&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>BioShop</td><td>TRX777.100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp ;</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection JetPRIME&nbsp ;</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade avec DAPI&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, + rouge phénol</td><td>Wisent ;</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1X, - rouge phénol</td><td>Wisent</td><td>319-051-CL</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Wisent&nbsp ;</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-RPA32</td><td>anticorps Abcam</td><td>ab2175</td><td>1:500 pour IF</td></tr><tr><td>Lapin anti-&gamma ;-H2A. </td><td>Signalisation cellulaire de l’anticorps X&nbsp ;</td><td>9718S</td><td>1:500 pour</td></tr> la <tr>signalisation cellulaire de<td>l’anticorps anti-53BP1</td> de <td>l’IF Rabbit&nbsp ;</td><td>4937S</td><td>1:500 pour IF</td></tr><tr><td>Lapin Anticorps Anti-PRP19</td><td>Abcam</td><td>ab27692</td><td>1:500 pour IF</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin IgG Alexa Fluor 647</td><td>Signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>4414S</td><td>1:250 pour IF</td></tr><tr><td>Goat anti-souris&nbsp ; IgG Alexa Fluor 488° ;</td><td>Signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>4408S</td><td>1:250 pour IF</td></tr><tr><td>Fiji logiciel open source d’analyse d’images&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>Capteur de puissance 1918-K avec capteur 918D-SL-0D3</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’adn à l’aide de 405 nm laser micro-irradiation

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

La réponse de dommages ADN (DDR) utilise une pléthore de protéines pour détecter, signaler et réparer les lésions de l’ADN. Délimiter cette réponse est essentiel de comprendre les mécanismes de maintien du génome. Recrutement et échanges de protéines à des lésions étant très dynamiques, leur étude nécessite la capacité de générer des dommages à l’ADN de façon rapide et dans l’espace délimité. Nous décrivons ici les procédures pour induire localement des lésions de l’ADN dans les cellules humaines à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser couramment disponible équipé d’un faisceau de 405 nm. Accumulation de maintenance du génome à rayures de laser peut être évaluées par immunofluorescence (IF) ou en temps réel à l’aide de protéines fluorescents reporters le tag. À l’aide de phosphorylés histone H2A. X (γ-H2A.X) et Replication Protein A (RPA) comme marqueurs, la méthode fournit une résolution suffisante pour distinguer les facteurs recrutés localement de celles qui se propagent sur la chromatine adjacente. Nous fournir également des scripts basés sur ImageJ pour surveiller efficacement la cinétique de la relocalisation de la protéine à ADN endommagent des sites. Ces améliorations simplifient grandement l’étude de la dynamique de la DDR.

Après irradiation micro, les cellules sont autorisés à récupérer pendant un certain temps selon la nature du génome entretien protéines1,12. CDB est traitées par les nucléases, plus intensivement durant les phases S et G2 du cycle cellulaire, pour créer une région limitée de l’ADN simple brin qui est rapidement recouvert par l’armée patriotique rwandaise et autres génome entretien facteurs9. Cette région de...

Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

L’objectif global de cette procédure est de créer des cassures double brin d’ADN localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser de 405 nanomètres largement disponible, et de fournir des procédures automatisées pour quantifier la dynamique des facteurs de réparation de l’ADN au niveau de ces lésions. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer si une protéine donnée est recrutée dans les cassures d’ADN double brin et délimiter les voies de signalisation qui régulent son accumulation au niveau des lésions d’ADN. La technique utilise un système de microscope confocal couramment disponible pour induire localement des dommages à l’ADN.Cela permet à pratiquement n’importe quel laboratoire d’étudier la cinétique de la réponse aux dommages de l’ADN. Si vous surveillez le recrutement vivant d’une protéine marquée par fluorescence, effectuez une transfection transitoire ou une sélection de lignées cellulaires stables exprimant la protéine d’intérêt, fusionnées à un rapporteur fluorescent. 24 heures avant l’expérience de micro-irradiation, ensemencez 40 000 cellules U2OS par puits dans du DMEM 1X contenant 10 % de FBS, dans des lames de culture à huit puits, avec des fonds

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Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Ce protocole vise à décrire l’utilisation de laser microirradiation d’induire différents types de lésions de l’ADN, y compris relativement simples brins et lésions complexes, afin d’étudier l’ADN des dommages de signalisation et de réparation facteur Assemblée à sites de dommages in vivo .

Laser Microirradiation à l’étude In Vivo des réponses cellulaires aux dommages d’ADN simples et complexes

Confocal fluorescence microscopie et laser micro-irradiation offre des outils pour induisant des dommages à l’ADN et le suivi de la réponse des protéines de réparation d’ADN dans certaines zones Sub nucléaires. Cette technique a grandement avancer nos connaissances sur la détection des dommages causés, de signalisation et de recrutement. Ce manuscrit montre ces technologies afin d’examiner la réparation de rupture de brins simples et doubles.

Application de Micro-irradiation Laser pour examen du Single et Double brin pause réparation dans les cellules de mammifères

Ce protocole décrit une méthode non invasive pour identifier efficacement les cellules en phase S pour les études de microscopie en aval, telles que la mesure du recrutement des protéines de réparation de l’ADN par micro-irradiation laser.

Micro-irradiation laser pour étudier le recrutement de l’ADN pendant la phase S

Dans la présente, nous présentons un protocole permettant d’utiliser le petit ARN interférent spécifique de la protéine de choc thermique 27 (HSP27) pour évaluer la fonction de HSP27 pendant la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes. L’interférence ARN est la meilleure méthode pour inhiber efficacement l’expression des gènes afin d’étudier la fonction des protéines dans divers types de cellules.

Enquête basée sur l&#39;interférence ARN de la fonction de la protéine de choc thermique 27 pendant la cicatrisation cornéenne épithéliale Wound

Des dommages ciblés à l’ADN peuvent être obtenus en attachant un agent endommageant l’ADN à un oligonucléotide formant un triplex (TFO). À l’aide de TFO modifiés, l’association de protéines spécifiques aux dommages à l’ADN et la modification de la topologie de l’ADN peuvent être étudiées dans des cellules humaines à l’aide de tests d’immunoprécipitation de la chromatine modifiée et de tests de super-enroulement de l’ADN décrits dans le présent document.

Des outils pour étudier le rôle de l&#39;architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l&#39;ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks

La protéine Cpf1 associée à CRISPR peut être guidée par un ARN CRISPR spécialement conçu (CRRNA) pour cliver l'ADN bicaténaire aux sites souhaités, générant des extrémités collantes. Sur la base de cette caractéristique, une norme d'assemblage d'ADN (C-Brick) a été établie, et un protocole détaillant son utilisation est décrit ici.

Protocoles pour l&#39;assemblage standard d&#39;ADN de C-Brick utilisant Cpf1

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la synthèse de l’ARN. 5-Bromouridine est ajouté aux cellules et incorporé dans l’ARN synthétisé. Synthèse de l’ARN est mesurée par l’extraction de l’ARN immédiatement après marquage, suivi par immunoprécipitation 5-Bromouridine-ciblées d’étiquetés RNA et analyse par transcription inverse et la PCR quantitative.

Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation

Apprenez à créer des cassures double-brin de l'ADN localisées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser 405 nm et à quantifier automatiquement la dynamique des facteurs de réparation. Cette méthode permet d'étudier le recrutement des protéines aux lésions de l'ADN.

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

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