Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

L’objectif global de cette procédure est de créer des cassures double brin d’ADN localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser de 405 nanomètres largement disponible, et de fournir des procédures automatisées pour quantifier la dynamique des facteurs de réparation de l’ADN au niveau de ces lésions. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer si une protéine donnée est recrutée dans les cassures d’ADN double brin et délimiter les voies de signalisation qui régulent son accumulation au niveau des lésions d’ADN. La technique utilise un système de microscope confocal couramment disponible pour induire localement des dommages à l’ADN.

Cela permet à pratiquement n’importe quel laboratoire d’étudier la cinétique de la réponse aux dommages de l’ADN. Si vous surveillez le recrutement vivant d’une protéine marquée par fluorescence, effectuez une transfection transitoire ou une sélection de lignées cellulaires stables exprimant la protéine d’intérêt, fusionnées à un rapporteur fluorescent. 24 heures avant l’expérience de micro-irradiation, ensemencez 40 000 cellules U2OS par puits dans du DMEM 1X contenant 10 % de FBS, dans des lames de culture à huit puits, avec des fonds en polymère de verre de 170 microns d’épaisseur.

Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2. Pour augmenter le nombre de cassures double brin générées par l’exposition au laser de 405 nanomètres, ajoutez BBET aux cellules, à 10 microgrammes par millilitre dans le milieu approprié. Traitez les cellules pendant 15 minutes dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius.

Avant la micro-irradiation, à l’aide d’une micropipette, rincez les cellules deux fois avec un milieu sans rouge de phénol, afin d’assurer une exposition maximale des cellules au laser de 405 nanomètres. Tout microscope confocal équipé du laser 405 nanomètres peut être utilisé pour cette méthode. Les utilisateurs doivent calibrer soigneusement leur système pour atteindre des niveaux physiologiques de dommages à l’ADN.

Nous décrivons comment procéder dans le protocole détaillé. Sélectionnez un microscope confocal à balayage laser approprié équipé d’un laser de 405 nanomètres. Allumez le microscope et la chambre environnementale.

Sélectionnez des champs avec des cellules bien distribuées, ajustez la mise au point et enregistrez leur position pour faciliter l’acquisition d’images après le protocole d’immunofluorescence. Si vous utilisez une protéine marquée par fluorescence pour l’imagerie en direct, acquérez au moins une image qui servira de point de référence avant les dommages, afin de surveiller la cinétique du recrutement des protéines après la micro-irradiation. Pour les expériences d’immunofluorescence utilisant des cellules marquées BBET, ajustez la mise au point sur les cellules à l’aide du laser de 405 nanomètres à la puissance laser la plus faible suffisante pour visualiser les cellules, afin d’éviter des dommages injustifiés à l’ADN.

Si vous utilisez des cellules exprimant la protéine d’intérêt marquée par fluorescence, sélectionnez un plan focal avec une intensité de fluorescence représentative. Configurez le microscope pour l’étape de micro-irradiation à l’aide du module de récupération de fluorescence après photoblanchiment du système. À l’aide du module FRAP du système de microscope, sélectionnez les régions d’intérêt qui seront micro-irradiées.

Une fois cela fait, micro-irradiez les cellules. En règle générale, les facteurs associés à la chromatine seront recrutés pour les cassures double brin dans les deux minutes. La résection des cassures par des nucléases va générer de l’ADN simple brin et favoriser le recrutement de facteurs de recombinaison homologues qui deviennent détectables 10 minutes après la micro-irradiation.

Après la micro-irradiation, replacez les lames multipuits dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant la durée requise avant de traiter les échantillons pour l’immunofluorescence. Vous pouvez également procéder immédiatement à l’imagerie en accéléré en direct, comme indiqué dans le protocole texte. Pour commencer l’analyse, ouvrez les images acquises aux Fidji.

Sélectionnez l’analyseur de dommages dans le menu déroulant des plug-ins de la suite d’analyse de micro-irradiation. Définissez les unités de temps et l’intervalle de temps entre les images, puis enregistrez la série d’images à l’aide de l’algorithme StackReg. Suivez les invites pour définir une région d’arrière-plan d’intérêt, ou ROI, dans chaque cellule micro-irradiée.

Définissez également les zones d’intérêt non irradiées et irradiées dans chaque cellule micro-irradiée. Une fois que toutes les données de retour sur investissement ont été collectées sur l’ensemble de la série time-lapse, enregistrez le fichier créé par le plug-in contenant les résultats sous forme de fichier délimité par des virgules. Ce fichier contient des mesures de l’intensité moyenne pour chaque point temporel et chaque retour sur investissement.

Effectuez l’analyse à l’aide du plug-in pour toutes les cellules micro-irradiées et tracez graphiquement l’enrichissement relatif dans les régions micro-irradiées au fil du temps. Cette étape doit être répétée pour au moins 15 à 30 cellules, et l’enrichissement moyen et les erreurs-types de la moyenne pour chaque point de données doivent être calculés et tracés. À l’aide d’une micropipette, retirez délicatement le milieu des puits des lames de microscopie multipuits.

Lavez immédiatement les cellules avec 500 microlitres de solution de lavage IF en changeant la solution deux fois sans attendre. Ensuite, incubez sur glace pendant cinq minutes, avec 500 microlitres de solution glacée de FI avant et après l’extraction. Agitez doucement à la main pendant 15 à 30 secondes pour effectuer l’étape de pré-extraction qui élimine la plupart des protéines cytoplasmiques et nucléoplasmiques et maximise le signal des facteurs associés à la chromatine et à l’ADN.

Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 500 microlitres de solution de lavage IF. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution de fixation IF et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir lavé deux fois avec 500 microlitres de solution de lavage IF, incubez sur de la glace pendant cinq minutes dans 500 microlitres de solution glacée de pré et post-extraction IF.

Faites tourner doucement la glissière à la main pour effectuer l’étape de perméabilisation. Lavez les cellules deux fois avec 500 microlitres de solution de lavage IF. Ensuite, incuber au moins 30 minutes à température ambiante avec 500 microlitres de solution de blocage de l’IF.

Retirez la solution bloquante à l’aide d’une micropipette et ajoutez 250 microlitres de solution d’anticorps primaires. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit dans une chambre humidifiée à 4 degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cellules quatre fois pendant cinq minutes dans 500 microlitres de solution de lavage IF avec une agitation douce.

Ensuite, incubez les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius avec 250 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans une solution bloquante dans une chambre humidifiée. Protégez les échantillons de la lumière lors de l’ajout d’anticorps secondaires marqués par fluorescence. Ensuite, lavez les cellules quatre fois chacune pendant cinq minutes dans une solution de lavage de 500 microlitres d’IF avec une agitation douce.

Incuber les cellules à température ambiante pendant cinq minutes dans 500 microlitres de 1X PBS, contenant un microgramme par millilitre de DAPI pour colorer les noyaux. Après avoir lavé les cellules deux fois avec 500 microlitres de 1X PBS, laissez les cellules dans 500 microlitres de solution 1X PBS pour l’imagerie. À l’aide de lames quadrillées ou de positions de scène enregistrées, trouvez les cellules micro-irradiées à l’aide d’un marqueur de dommages à l’ADN bien caractérisé.

Imagez les lames de culture multipuits dans tous les canaux pertinents en utilisant les paramètres appropriés sur un microscope confocal à balayage laser. La micro-irradiation laser de cellules présensibilisées conduit à la production de cassures double brin de l’ADN, qui sont réséquées par des nucléases pour générer de l’ADN simple brin. Les protéines ou les modifications qui se propagent à de grands domaines de la chromatine apparaissent sous forme de larges bandes dans les deux minutes suivant la micro-irradiation.

Ceci est illustré par le modèle observé avec des anticorps ciblant la variante d’histones phosphorylée H2A. X.L’ADN simple brin peut être visualisé à des points temporels ultérieurs sous forme de foyers ponctués à l’aide d’anticorps contre la protéine de réplication A.En utilisant cette méthode, il est évident que 53BP1 est recruté sur de grands domaines chromatiniens, tandis que l’ubiquitine ligase PRP19 E3 est recrutée sur de l’ADN monocaténaire codé RPA. La transfection de plasmides codant pour des protéines marquées avec des rapporteurs fluorescents, suivie d’une micro-irradiation, permet de suivre en temps réel le recrutement des protéines dans les lésions de l’ADN.

La micro-irradiation de cellules pré-sensibilisées BRDU transfectées avec des plasmides exprimant EGFP, ou RPA32 fusionnés à GFP, montre que RPA32-GFP, mais pas EGFP seul, est rapidement recruté dans l’ADN simple brin créé par la résection des cassures d’ADN double brin. Ce graphique montre la quantification de l’enrichissement du signal GFP RPA32 au fil du temps au niveau des loci micro-irradiés à partir de 15 cellules indépendantes analysées avec le plug-in Fiji d’analyse de micro-irradiation. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures environ pour l’imagerie en direct de 10 à 15 cellules individuelles exprimant des protéines marquées par fluorescence, et en deux jours lorsque l’immunofluorescence est utilisée pour surveiller le recrutement des protéines au niveau des loci micro-irradiés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la configuration d’un microscope à balayage laser et de son utilisation pour micro-irradier des cellules et surveiller le recrutement de facteurs de réparation de l’ADN sur les sites de dommage, à la fois en temps réel et dans les cellules fixes. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les conditions décrites ici génèrent des cassures double brin, mais aussi d’autres types de lésions. Mais l’utilisateur peut modifier les méthodes de micro-irradiation et de pré-sensibilisation pour créer des types spécifiques de lésions pertinentes pour ses recherches.

À la suite de cette procédure, l’appauvrissement des facteurs de réponse aux dommages à l’ADN établis lorsque la mutation de domaines spécifiques dans la protéine d’intérêt peut être effectuée pour fournir des informations supplémentaires sur le mécanisme de recrutement de ces facteurs lors des cassures de l’ADN. N’oubliez pas que travailler avec des lasers et du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle et le travail avec une cagoule chimique si nécessaire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.