Un test Simple, Rapid et Quantitative à la mesure de réparation d’ADN-protéine Crosslinks sur des plasmides transfectés dans des cellules de mammifères

Le but du présent protocole est de quantifier la réparation des définis ADN-protéine crosslinks sur l’ADN de plasmide. Les plasmides lésés sont transfectés dans des lignées cellulaires de mammifères bénéficiaires et de faible poids moléculaire récoltée à plusieurs temps points après transfection. Cinétique de réparation de l’ADN sont quantifiées par extension d’amorce de volet spécifique suivie de qPCR.

L’objectif global de cet essai QPCR d’extension d’amorce transpacifique est d’évaluer quantitativement la réparation des adduits, réticulés à l’ADN plasmidique, après la transfection dans des cellules de mammifères. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réparation de l’ADN. Par exemple, quelles voies sont impliquées dans la réparation des réticulations des protéines de l’ADN.

Cette technique a le potentiel de fournir une meilleure compréhension de la réponse aux dommages de l’ADN. Parce qu’il permet d’étudier de manière sélective la réparation des réticulations des protéines de l’ADN et l’absence d’autres types de dommages à l’ADN. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la réparation des réticulations des protéines de l’ADN, elle peut également être appliquée à d’autres types de dommages à l’ADN.

Tels que les sites abasiques et d’autres adduits bloquant la polymérase. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut détecter la réparation des plasmides contenant des adduits, à des moments aussi précoces que deux heures. Nous avions initialement l’intention d’utiliser la réactivation des cellules internes pour étudier la réparation, mais ces tests ne mesurent pas directement la réparation ou peuvent surestimer l’efficacité de la réparation.

Surtout si l’ARN polymérase peut lire à travers des produits de réparation incomplets. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de purification et d’extension de l’amorce spécifiques au brin sont autrement difficiles à visualiser. Mélangez 20 microlitres d’une solution contenant 80 picomoles d’un oligonucléotide contenant huit oxoguanine avec cinq microlitres de tampon 10x ligase.

Et ajoutez un microlitre d’une solution contenant 10 unités de polynucléotide kinase T4. Ajustez le volume final à 50 microlitres et incubez le tube dans un bain-marie pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, constituez la réaction d’amorce-extension sur la glace.

Réglez le programme sur le thermocycleur et démarrez la course. Après l’incubation, ajustez le volume total à 375 microlitres en ajoutant différents réactifs, enzymes et tampons. Ensuite, incubez la réaction dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Pour préparer un mélange de phényle-chloroforme dans un rapport de 50:50, ajoutez des volumes égaux de phénol et de chloroforme. Mélangez ensuite les deux composants et faites-les tourner dans une centrifugeuse de table à 21, 130 G pendant cinq minutes. Une fois l’essorage terminé, ajoutez 375 microlitres de la couche organique à la réaction d’extension-amorce. Mélanger.

Et à nouveau centrifuger à 21, 130 G pendant cinq minutes. Après la centrifugation, pipetez soigneusement la couche supérieure. Et mélanger avec de l’acétate d’ammonium jusqu’à une concentration finale de 0,3 molaire.

Et puis ajoutez-y deux volumes de 100 % d’éthanol. Conservez le mélange à moins 20 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes jusqu’au lendemain. Une fois la période d’incubation terminée, centrifugez l’échantillon à 15 000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, jetez le surnageant et lavez la pastille dans de l’éthanol à 70 %. Faites tourner à nouveau l’échantillon dans une centrifugeuse de table à 15 000 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, jetez le surnageant et dissolvez la pastille dans 100 microlitres d’eau.

Combinez 50 microlitres d’ADN avec 34 microlitres d’eau et 16 microlitres de colorant 6x gel. Analysez l’échantillon sur un gel d’agarose à faible point de fusion de 10 centimètres, à 0,8 %, contenant 0,5 microgramme par millilitre de bromure d’éthidium à deux volts par centimètre pendant six heures dans 1 tampon TAE. Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour exciser l’ADN superenroulé.

Et pesez la tranche de gel. Ajoutez ensuite un tampon de réaction bêta-agarase d’un microlitre pour digérer tous les 10 milligrammes de tranche de gel. Ensuite, incubez la tranche à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis refroidissez-la à 42 degrés Celsius dans un thermocycleur.

Une fois que la tranche de gel s’est dissoute et refroidie à 42 degrés Celsius, ajoutez 10 unités de bêta-agarase et laissez à 42 degrés Celsius pendant une heure dans le thermocycleur. Au bout d’une heure, mesurez le volume de la tranche de gel dissous et ajoutez de l’acétate d’ammonium à une concentration finale de 0,3 molaire et incubez sur de la glace pendant 15 minutes. Après l’incubation, centrifugez le mélange à 15 000 G pendant 15 minutes à température ambiante.

Ensuite, prélevez le super natant et pipetez-y deux volumes d’isopropanol et mélangez. Conservez ensuite le mélange à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, centrifugez l’ADN superenroulé purifié dans une centrifugeuse de table à 15 000 tr/min pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez le super natant et remettez le granulé en suspension dans 40 microlitres d’eau. Combinez ensuite 15 microlitres d’une solution contenant 12 picomoles d’ADN avec un microlitre d’une solution de 36 picomoles d’oxoguanine glycosylase dans un tampon et ajustez le volume final à 30 microlitres. Ensuite, incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes au bain-marie.

Un jour avant la transfection, ensemencez les cellules dans une plaque de culture à six puits. Le lendemain, mélangez 1,5 microgramme du plasmide réticulé avec 300 microlitres de milieu de culture sans sérum dans un tube, en vous assurant de conserver un microlitre d’ADN comme point de signe zéro heure. Dans un autre tube, mélangez 12 microlitres de réactif de transfection avec 300 microlitres de milieu sans sérum.

Combinez ensuite 300 microlitres d’ADN réticulé avec un volume égal de réactif de transfection dilué. Et incubez pendant cinq minutes à température ambiante dans une hotte à flux laminaire. Après l’incubation, ajoutez 250 microlitres du complexe dans chacun des deux puits et incubez à 37 degrés Celsius.

Après un minimum d’une heure, retirez le milieu et ajoutez un millilitre de solution de dodécylsulfate de sodium à 0,6 % avec 0,1 molaire d’EDTA et incubez à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, détachez les cellules en grattant avec un policier en caoutchouc et transférez-les dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 200 microlitres de solution de chlorure de sodium à 5 molaires à une concentration finale d’une molaire et retournez le tube cinq fois.

Ensuite, incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, centrifugez l’échantillon à 21, 130 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, récupérez le surnageant.

Et ajoutez de l’acétate d’ammonium à une concentration finale de 0,3 molaire, mélangez et ajoutez deux volumes d’éthanol à 100 % pour précipiter l’ADN. Conservez le mélange à moins 20 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Après la précipitation à l’éthanol et la remise en suspension des échantillons d’ADN récupérés dans 50 microlitres d’eau, diluer l’échantillon de l’heure zéro dans 500 microlitres d’eau et constituer les réactions PCR à l’aide des échantillons non transfectés et transfectés.

Réglez ensuite le programme sur le thermocycleur et commencez la course. Cette étape d’extension de l’amorce spécifique au trans est cruciale car elle nous permet d’amplifier le brin endommagé. Si elles n’étaient pas utilisées, les valeurs delta CT seraient inférieures à un, ce qui rendrait difficile la détection de faibles niveaux de réparation DPC.

Après avoir terminé huit cycles, ajoutez 100 picomoles de la deuxième amorce. Mélangez ensuite un microlitre d’ADN non amplifié à partir des échantillons non transfectés et transfectés avec 2x master mix, de l’eau et 100 picomoles des deux amorces jusqu’à un volume final de 60 microlitres. Chargez les échantillons en trois exemplaires sur une plaque de PCR à 96 puits.

Effectuez une PCR quantitative pendant 30 cycles et faites la moyenne du seuil de cycle pour chacun des échantillons triples. Dans cette étude, la QPCR est réalisée avec et sans extension d’amorce spécifique au brin afin de calculer le pourcentage d’ADN plasmidique qui a été réparé. La différence dans les valeurs seuils de cycle entre les échantillons à amorce étendue et les échantillons non étendus à amorce est appelée delta CT.As comme on le voit ici, un échantillon réparé soumis à SSPE-QPCR a un delta CT plus grand qu’un échantillon non réparé.

Les données représentatives du pourcentage de réparation calculé à partir des valeurs delta CT montrent que les échantillons récupérés après trois heures de transfection sont réparés à 66 %, tandis que les échantillons récupérés après huit heures sont réparés à 93 %. Les valeurs de fond en pourcentage calculées à partir de deux échantillons de contrôle avec une efficacité de réticulation des protéines respectivement élevée et faible sont présentées ici. Le faible pourcentage de bruit de fond présent dans le témoin indique pourquoi seuls des substrats réticulés efficaces sont utilisés pour les transfections.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de prendre le temps zéro échantillon pour soustraire tout arrière-plan de ce test. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse de séquence peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que : est-ce que la réparation du DPC est sujette aux erreurs ?

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer, de transfecter et de quantifier la réparation des plasmides contenant des adduits dans les cellules de mammifères. N’oubliez pas que travailler avec du phénol, du chloroforme et du bromure d’éthidium peut être dangereux. Et des précautions telles que le port de gants et le travail dans une hotte doivent toujours être prises.