Name: Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l intestin de vivre Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Découvrez une méthode simple et reproductible pour évaluer l'alcalinisation lysosomique dans l'intestin de Caenorhabditis elegans en utilisant le colorant cDCFDA. Cette technique aide les chercheurs à étudier l'autophagie et la fonction lysosomale.

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Nous tenons à remercier le centre de génétique de Caenorhabditis pour les souches, les Sciences naturelles et Conseil de recherches en génie (CRSNG) et la Fondation canadienne pour l’Innovation (FCI) pour le financement. Nous tenons à remercier le professeur Lizhen Chen (département des systèmes cellulaire et anatomie, UT santé San Antonio) pour permettre l’utilisation sans restrictions de ses installations de laboratoire pour toutes les expériences de c. elegans comme Dr Exing Wang (directeur associé, Centre d’imagerie optique UT santé San Antonio) d’assistance avec la microscopie confocale. Nous tenons également à remercier le Dr Myron Ignatius pour fournir soutien et encouragement pour faciliter le tournage vidéo.

1. tache et Image des lysosomes intestinales
<ol><li>Milieux de culture nématode de semences (NGM) plaques avec OP50
	<ol>
<li>Préparer les assiettes NGM selon le protocole recommandé19 et laisser les plaques fermés à sécher pendant 2 jours à température ambiante.</li>
		<li>Ensemencer les bactéries OP50 bouillon stérile de bouillon Luria (LB) et de grandir dans un agitateur incubateur ou le bain-marie à 37 ° C pendant 36 h ou jusqu'à ce que le diamètre extérieur est de 0,2 à 0,4. Évitez d’utiliser une culture bactérienne avec OD > 1 ou OD < 0,2.</li>
		<li>Une fois que NGM plaques sont secs, déposez une goutte (~ 30 µL) d’inoculum OP50 vers le centre de la plaque et s’étend ensuite la goutte dans un patch à peu près qui est de 2 cm sur 2 cm dans la taille. Remarque : N’importe quel inoculum OP50 restant peut être stocké à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.</li>
		<li>Inverser les plaques OP50 une fois que l’inoculum est sèche (environ 10 ou 15 min) et puis incuber les plaques à 37 ° C pendant 36 h.</li>
		<li>Après 36 h, enlever les plaques de l’incubateur et le conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure. Remarque : Les plaques doivent être bons pendant environ 1 mois à 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Complétant cDCFDA à OP50
	<ol>
<li>Pour compléter les cDCFDA sur des plaques de OP50, préparation d’un stock de travail de 10 mM cDCFDA dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver la solution cDCFDA, protégée de la lumière et conserver à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.</li>
		<li>Placez délicatement 100 µL de solution de cDCFDA de 10 mM sur la surface du patch OP50 2 cm x 2 cm, tels que le patch entier est uniformément recouvert de cDCFDA. Remarque : Il est très important que le patch entier de OP50 est recouvert de cDCFDA. Si nécessaire, utilisez jusqu'à 150 µL de cDCFDA pour chaque plaque. Il est également impératif que la solution de cDCFDA ne s’étend pas au-delà des frontières du patch OP50, depuis n’importe quel cDCFDA qui s’écoule le patch OP50 ne figureront pas dans les aliments et se traduira par une moindre intensité de coloration.</li>
		<li>Placer les plaques OP50 dans une boîte sombre sur le dessus de banc jusqu'à ce que toute la solution cDCFDA est absorbée dans le patch bactérien (habituellement environ 25 à 30 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration à l’aide de cDCFDA les vers
	<ol>
<li>Une fois que le cDCFDA a complètement imprégné le patch OP50, sans toutefois dépasser 20 vers par plaque et incuber les plaques inversés à 20 ° C pendant au moins 14 h. Remarque : Il est recommandé de placer les plaques de cDCFDA dans une boîte opaque pour minimiser l’exposition à la lumière.</li>
		<li>Pour contrôler des différences de consommation entre les expériences et de normaliser les signaux cDCFDA, (recommandé) Co tache avec 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)) difluoro) bore (2,5 µL d’une solution fraîchement 1 mM), un colorant de faibles amine acidotrope dont la fluorescence est en grande partie non variantes sur le spectre d’un pH acide (voir Table des matières des noms communs de réactifs). Remarque : Tache pas worms pour moins de 14 h, puisque ceci peut fournir l’intensité de coloration de cDCFDA inadéquate et donner une fausse interprétation du pH lysosomal.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des lames pour la microscopie
	<ol>
<li>Placez deux bandes parallèles de marquage bande environ 3 pouces dehors sur une surface lisse et plane, comme un miroir (Figure 1).</li>
		<li>Recouvrir la surface du miroir avec vaporisateur hydrofuge et essuyer le liquide excédentaire.</li>
		<li>Faire fondre 2 % d’agarose (dissous dans distillée H2O) dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que complètement liquéfié, puis déposer une goutte de 50 µL d’agarose entre les deux morceaux de ruban adhésif et couvrir rapidement la baisse avec une lame de microscope, telle que la diapositive soit perpendiculaire aux bandes de ruban adhésif. Après que l’agarose est solidifié, formant un tampon circulaire au titre de la diapositive, retourner la diapositive et ajouter 10 à 15 µL 5mM d’azide de sodium (NaN3) sur le bloc de gel d’agarose. NOTE : NaN3 est un inhibiteur du cytochrome C que lorsqu’il est utilisé en faible concentration, anesthetizes réversible vers afin qu’ils ne bougera pas pendant la formation image.</li>
		<li>Choisissez vers de la plaque OP50 additionné de cDCFDA et les transférer sur un plat NGM propre sans aucune OP50. Laissez les vers se déplacer pendant quelques secondes permettre à la plupart de la OP50 à supprimer de la surface vers et ensuite transférer les vers sur le tampon de gel d’agarose contenant de l’azide de sodium 5 mM.</li>
		<li>Couvrir immédiatement le tampon de gel d’agarose avec une lamelle couvre-objet. N’oubliez pas de placer délicatement la lamelle couvre-objet sans exercer trop de pression, car cela peut entraîner vers d’éclatement. NOTE : OP50 bactéries additionnés de cDCFDA sont fluorescents lors de microscope, c’est pourquoi il est important de nettoyer les vers autant que possible avant de les placer sur le coussinet de gel d’agarose contenant de l’azide de sodium. S’apprêter à plus de 6 souches c. elegans (y compris N2, contrôle de type sauvage), il est conseillé de préparer les échantillons dans des lots de 6, afin de s’assurer que les vers ne sèchent pas sur le coussinet de gel d’agarose. Chez certaines souches, la vulve commence à se rompre après une période prolongée en raison de la pression de la lamelle couvre-objet, il est donc important de planifier en conséquence.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopie confocale Remarque : Certains microscopes ont une fonction intégrée qui augmente automatiquement l’intensité de la fluorescence pour compenser des niveaux variables de la fluorescence. Ces microscopes peuvent ne pas fonctionner bien pour imagerie vers colorées avec cDCFDA, car ils augmenteront intrinsèquement l’intensité de la fluorescence des échantillons.<ol>
<li>Effectuer l’imagerie sur un microscope confocal standard en utilisant des longueurs d’onde d’excitation/émission définis sur 488/530 nm pour cDCFDA. Prendre des images de plan unique (pas de Z-cheminées) de lysosomes intestinales et utiliser uniquement les lysosomes qui sont en discussion (intensité du signal maximale) pour la quantification de l’intensité. NOTE : Peut-être à cause de différences dans la disponibilité de colorant, les lysosomes des cellules intestinales directement derrière le pharynx maintiennent cDCFDA coloration intensité quel que soit le génotype ou l’âge, c’est pourquoi il faut éviter d’imagerie lysosomes dans ces cellules.</li>
		<li>Image de la diapositive contenant 2 jour vieux type sauvage que N2 worms tout d’abord. Ce faisant, régler les paramètres d’imagerie confocale tels que la puissance du laser, sténopé et l’ouverture pour s’assurer que le cDCFDA à l’intensité de la coloration n’est pas saturé. Remarque : Une fois que ces paramètres sont définis, ne les modifiez pas pendant toute la durée de l’imagerie pour ce jour-là.</li>
		<li>Un seul plan de l’intestin (3 à 4 images par ver) en 1024 x 1024 pixels images à l’aide d’un 60 X lentille de grossissement. Remarque : Le spectre d’émission de cDCFDA à worms produira un seul pic important à 520 nm coïncidant avec sa fluorescence déclarés spectre20, fournissant une lecture du signal spécifique qui se distingue de l’autofluorescence intestinale (Figure 3).</li>
		<li>Export image confocale raw (fichiers .lsm) sous forme de fichiers .tiff pour chaque canal.</li>
		<li>Ensuite, ouvrez ImageJ et cliquez sur fichier | Ouvrez pour ouvrir le fichier image à quantifier. Une fois le chargement de l’image, utilisez l’outil de sélection de forme ovale en ImageJ pour sélectionner une région d’intérêt (ROI).</li>
		<li>Par la suite, cliquez sur Analyze | Mesure pour quantifier l’intensité de fluorescence pour ce retour sur investissement. Sélectionnez les 4 – 5 différents lysosomes de mise au point par l’image et calculer l’intensité de la fluorescence relative moyenne de chaque région d’intérêt (ROI).</li>
		<li>Pour chaque image, mesurer l’intensité de fluorescence de fond dans une région de l’intestin entre lysosomes. Soustraire les valeurs d’intensité de fluorescence fond depuis les valeurs d’intensité de fluorescence lysosomal.</li>
		<li>Au total, recueillent environ 30 à 50 valeurs normalisées individuels pour cDCFDA intensité (animaux de 6 à 10) pour chaque souche testée. Utilisez ces valeurs pour tracer un tracé boîte et moustaches à l’aide de n’importe quel logiciel de statistique appropriée. NOTE : La coloration peut varier considérablement selon des facteurs comme la température, le temps d’incubation et la santé globale/âge des animaux tels que les comparaisons d’intensité de fluorescence n’est pertinentes dans les processus d’échantillons dans la même expérience de coloration. Il est donc important de traiter les commandes dans chaque expérience de coloration. Calculer des différences statistiques (t-tests) à l’aide de n’importe quel logiciel de statistique appropriée.</li>
		<li>Image de toutes les souches de la même expérience (teintée le jour même) dans l’ordre, en prenant soin de ne pas pour changer les paramètres d’imagerie.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Une variété d’événements cellulaires et moléculaires contribuent au vieillissement, influencé par les caractéristiques du cycle vital et de facteurs génétiques. Notre récente étude22 suggère que le cycle de la reproduction joue un rôle important dans le contrôle de l’aptitude du soma en régulant la dynamique pH lysosomal. Nous avons montré que cette protéolyse médiée par les lysosomes est encouragée tandis que les animaux se reproduire activement par l’augmentation de la transcription de v-ATPase,...

L’apparition d’agrégats de protéines est largement reconnue pour être une caractéristique du vieillissement dans les cellules eucaryotes1,2,3et la formation dont est pensé pour être parmi les pilotes de principe de sénescence cellulaire4 , 5 , 6 , 7. il n’y a plus de preuves que, comme l’âge des cellules, catabolisme protéique est altérée, conduisant à une augmentation dans l’agrégation des protéines. L’effondrement de la protéolyse dans le vieillissement des cellules implique une déficience de l’autophagie8 ainsi que la dégradation de protéine induite par le protéasome9. Enfin, oxydation irréversible de protéines est augmentée dans les anciennes cellules, outre une atteinte de catabolisme de protéine10.
Autophagie était initialement considéré comme un processus non sélectif pour la dégradation de la majeure partie des protéines endommagées, mais des études récentes indiquent que l’autophagie est hautement sélective pour le catabolisme des agrégats de protéine et dysfonctionnels organites qui ne sont pas se prêtent à la dégradation par d’autres protéines clairance mécanismes11. Au cours du processus de l’autophagie, protéines endommagées et agrégées sont séquestrés dans une vésicule double membrane appelée l’autophagosome. Cette autophagosome fusionne alors avec les organites acides appelés lysosomes, qui conduit à la dégradation de l’autophagosome fret12. Lysosomes représentent l’aboutissement de la voie de l’autophagie et participent aux différents processus cellulaires tels que la réparation de la membrane, contrôle transcriptionnel et détection des éléments nutritifs ; mettant en évidence leur rôle central dans l’homéostasie cellulaire (examinée par Réf. 13). Plusieurs études ont montré une association entre une diminution de la fonction de l’âge en fonction lysosomale et divers de troubles neurodégénératifs13. Constamment, le fait de restaurer une fonction lysosomale dans les cellules plus âgées peut retarder l’apparition de phénotypes liés au vieillissement14,15. Étude de la composition du milieu intralumen suggère que l’effondrement de la fonction lysosomale dans les cellules plus âgées n’est pas due à une diminution de la production de protéases lysosomales16. Par ailleurs, il a été proposé que la perte d’acidité intralysosomal, une exigence essentielle de l’activité enzymatique, pourrait expliquer la baisse induite par le lysosome protéolyse17. Pour être en mesure d’explorer cette hypothèse, il est essentiel de développer des réactifs et protocoles pour sonder les variations dynamiques de pH lysosomal dans des cellules vivantes de manière reproductible et cohérente.
L’intestin de c. elegans est un tissu métabolique majeur à worms et c’est un critique régulateur de l’homéostasie systémique et de la durée de vie. Nous avons développé des tests pour évaluer les changements de l’acidité de la lumière des lysosomes intestinales de worms pour déterminer comment le lysosome-mediated protéolyse contribue au vieillissement. Bien que sensibles au pH fluorophores ont été utilisés auparavant chez c. elegans pour marquer les lysosomes intestinales, il n’y a encore un effort pour établir un protocole de succès qui peut de détecter de faibles hausses en pH lysosomal en vivo18. Ici, nous fournissons un protocole qui peut être utilisé pour détecter la perte d’acidité lysosomale dans les cellules intestinales de c. elegans en utilisant un protocole alimentaire simple et pratique qui intègre un fluorophore sensibles au pH (cDCFDA) dans la nourriture OP50.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Commandez en ligne sur https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescéine diacétate&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Communément appelé cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diéthylamino-5H-benzo(a)phénoxazine-5-one et (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))méthylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(diméthylamino)éthyl]propanamidato)(difluoro)bore</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Communément appelé Lysotracker Microscope confocal rouge</td></tr><tr><td>(par exemple Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Télécharger gratuitement sur https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Bouillon en poudre</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol en poudre</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Lames de protection</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miroir ou autre surface</td><td></td><td></td><td></td> plane lisse</tr></tbody></table>

Évaluer l’alcalinisation lysosomal dans l' intestin de vivre caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Le nématode Caenorhabditis elegans (c. elegans) est un système de modèle qui est largement utilisé pour étudier la longévité et les voies de développement. Ces études sont facilitées par la transparence de l’animal, la possibilité de d’avance et de retour des tests génétiques, la facilité relative de la production de protéines fluorescent étiquetés et l’utilisation des colorants fluorescents qui peut soit être micro dans le début embryon ou incorporés dans sa nourriture (e. coli de souche OP50) d’étiqueter les organites cellulaires (par exemple 9-diéthylamino-5 H-benzo [a] Phénoxazine-5 et la (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) disodique]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Nous présentons ici l’utilisation d’un colorant fluorescent de sensibles au pH qui taches intestinales lysosomes, fournissant une lecture visuelle de la dynamique des changements physiologiques en acidité lysosomale en direct vers. Ce protocole ne mesure pas pH lysosomal, mais vise plutôt à établir une méthode fiable d’évaluation des variations physiologiques importantes en acidité lysosomale. cDCFDA est un composé cellulaire perméable qui est converti en fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) après hydrolyse par les estérases intracellulaires. Protonation à l’intérieur des lysosomes des pièges cDCF dans ces organites, où il s’accumule. En raison de sa faible pKa de 4,8, ce colorant a été utilisé comme un capteur de pH dans la levure. Nous décrivons ici l’utilisation de cDCFDA comme un complément alimentaire afin d’évaluer l’acidité des lysosomes intestinales dans c. elegans. Cette technique permet la détection des lysosomes alcalinisants animaux vivants,, et a une large gamme d’applications expérimentales, notamment des études sur le vieillissement, autophagie et biogenèse lysosomale.

cDCFDA taches lysosomes de manière dépendante du pH, et sa faible pKa et capture de prêt dans les lysosomes rend un pH idéal capteur21. cDCFDA intensité de coloration est inversement proportionnel au pH lysosomal (c'est-à-dire la coloration des augmentations comme pH diminue d’intensité)18,22. cDCFDA signaux sont toujours faibles dans les lysosomes des animaux traités avec 20 mM de la chloroquine, ...

Un guide étape par étape pour sonder la perte d’acidité lysosomale dans l’intestin c. elegans en utilisant le colorant vital sensibles au pH 6 - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescéine diacétate (cDCFDA)

Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l' intestin de vivre Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer une perte relative d’acidité lysosomale dans les lysosomes intestinaux de C. elegans. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’autophagie en fournissant indirectement des informations sur la fonction lysosomale et la dégradation des protéines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, peu coûteuse, pratique et reproductible.Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons observé la technique de coloration utilisée pour évaluer l’alcalinisation vacuolaire chez les levures. La démonstration visuelle de cette méthode est importante car certaines étapes, telles que l’ajout de cDCFDA à la nourriture OP50 et le contrôle d’imagerie de vers de type sauvage âgés de deux jours, sont essentielles. Après avoir préparé les plaques NGM, laissez sécher les plaques à température ambiante pendant deux jours avec le couvercle fermé.Ensuite, inoculez la bactérie OP50 dans le bouillon stérile Luria. Après l’inoculation, laissez l’inoculant dans l’incubateur jusqu’à ce que la DO soit comprise entre 0,2 et 0,4. Ensuite, placez une goutte de l’inoculant OP50 au centre de la plaque NGM sèche.Ensuite, utilisez un épandeur pour étaler l’inoculant en patch d’environ deux centimètres sur deux. Environ après 15 minutes, inverser la plaque OP50 une fois que l’inoculant a séché. Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 36 heures.Une fois l’incubation terminée, transférez la plaque à quatre degrés Celsius jusqu’à l’utilisation. Ensuite, préparez un stock de travail de 10 millimolaires de cDCFDA dans un tampon M9. Conservez la solution cDCFDA à l’abri de la lumière à moins 20 degrés Celsius.Ensuite, pipetez 100 microlitres de cDCFDA de 10 millimolaires pour couvrir uniformément l’ensemble du patch OP50 sur la plaque. Laissez les plaques cDCFDA dans une boîte sombre sur la paillasse pendant environ 30 minutes. Une fois que le cDCFDA a complètement imprégné le patch OP50, transférez 20 vers sur la plaque, puis laissez la plaque à l’état inversé pendant environ 14 heures à 20 degrés Celsius.Ensuite, prenez deux bandes de rubans d’étiquetage et placez-les à 1,5 pouce d’intervalle sur une surface miroir lisse et plane. Ensuite, enduisez la surface du miroir d’un spray hydrofuge et retirez l’excès de liquide. Ensuite, faites fondre 2 % d’agarose dans de l’eau distillée au micro-ondes.Une fois l’agarose liquéfiée, placez une goutte d’agarose entre les deux bandes des bandes et couvrez la goutte avec la lame de microscope. Une fois que l’agarose s’est solidifiée en forme de tampon circulaire sous la lame, retournez la lame. Ensuite, ajoutez 10 à 15 microlitres d’azoture de sodium de cinq millimolaires sur le tampon d’agarose.Maintenant, transférez les vers de la plaque supplémentée cDCFDA vers une plaque NGM propre sans OP50. Laissez les vers se déplacer pendant quelques secondes pour que l’OP50 soit retiré de leur surface. Ensuite, transférez le ver sur le tampon d’agarose contenant cinq millimolaires d’azoture de sodium.Couvrez rapidement le tampon d’agarose avec une lamelle. Ensuite, utilisez un objectif grossissant 60X et capturez des images dans un seul plan de l’intestin à partir de vers de type sauvage et mutants âgés de deux jours. Ensuite, ouvrez ImageJ et cliquez sur le fichier.Ensuite, cliquez sur Ouvrir pour ouvrir le fichier qui doit être quantifié. Une fois l’image chargée, utilisez l’outil de sélection de forme ovale pour sélectionner la région qui vous intéresse. Cliquez ensuite sur Analyser, puis sur Mesurer pour quantifier l’intensité de fluorescence de la région d’intérêt.Pour étudier l’activité fonctionnelle lysosomale, l’intensité de la coloration cDCFDA est quantifiée à l’aide de l’imagerie confocale. Sur cette image, il y a une intensité robuste du signal de fluorescence cDCFDA dans les lysosomes intestinaux de C.Elegans de type sauvage le deuxième jour. Cela indique un lysosome acide fonctionnellement compétent.Au contraire, l’intensité de la fluorescence est considérablement supprimée dans les lysosomes intestinaux de type sauvage jour huit vers âgés. Ceci est en comparaison avec les lysosomes intestinaux des vers du deuxième jour. Le résultat a indiqué la présence de lysosome alcalin fonctionnellement incompétent chez les vers âgés du huitième jour.Il est intéressant de noter que l’intensité de la fluorescence cDCFDA est également nettement réduite chez les vers ARNi âgés du deuxième et du huitième jour par rapport au ver de type sauvage. Ici, le gène vha, codant pour les sous-unités vacuolaires de l’ATPase dans la muqueuse lysosomale, a été éliminé chez les vers âgés du deuxième et du huitième jour. Une fois maîtrisé, l’ensemble de ce régime de coloration et de microscopie peut être complété en moins de 18 heures, s’il est effectué correctement.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’incuber les vers dans le supplément cDCFDA dans la nourriture OP50 pendant au moins 14 heures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la perte d’acidité lysosomale dans les lysosomes intestinaux de C. elegans vivants.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Source : Le, T. A. N. , et al., Mesurer les effets des bactéries et des substances chimiques sur la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo présente un test basé sur la fluorescence pour quantifier la perméabilité intestinale chez C. elegans exposée à Pseudomonas aeruginosa. Comparés aux témoins nourris avec Escherichia coli, les vers traités par agents pathogènes présentent une fuite accrue de fluorophores dans la cavité corporelle, indiquant des...

Évaluation de la perméabilité intestinale chez C. elegans après exposition bactérienne

Cette vidéo décrit un test colorimétrique pour la mesure du lactate dans les lysats cellulaires à l’aide de l’enzyme lactate déshydrogénase. Cette enzyme convertit le lactate en pyruvate, ainsi que la conversion du NAD en NADH qui réagit avec les colorants au tétrazolium et donne un produit coloré qui peut être mesuré spectrophotométriquement pour quantifier le lactate.

Dosage colorimétrique pour la quantification du lactate dans les échantillons d’essai

Nous décrivons des méthodes pour étudier les aspects de amylopathies dans le...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Pour étudier la relation entre l’homéostasie des protéines, le stress et le vieillissement, nous avons surveillé les changements dans le repliement des protéines en suivant le dysfonctionnement des protéines, la localisation des protéines dans la cellule et la stabilité des protéines aux niveaux de l’organisme, des cellules et des protéines, en utilisant le métazoaire génétiquement traitable Caenorhabditis elegans comme système modèle.

Utilisation de Caenorhabditis elegans comme système modèle pour étudier l’homéostasie des protéines dans un organisme multicellulaire

Le transparent c. elegans intestin peut servir comme une «en vivo tissu chambre » pour l’étude des apicobasal la biogenèse membranaire et lumen au niveau unicellulaire et subcellulaire pendant tubulogenèse multicellulaires. Ce protocole décrit comment combiner un étiquetage standard, perte de fonction génétique/ARNi et approches microscopiques de disséquer ces processus au niveau moléculaire.

Le c. elegans intestin comme un modèle intercellulaires Lumen morphogenèse et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire au niveau unicellulaire : marquage par des anticorps, RNAi perte de fonction analyse et imagerie

Le canal excréteur de c. elegans est un modèle unique de cellules individuelles pour l’analyse visuelle in vivo de la biogenèse membranaire de novo polarisé. Ce protocole décrit une combinaison de génétique/Arni standard et approches, adaptables pour l’identification et la caractérisation des molécules diriger tubulogenèse unicellulaires et apicale biogenèse membranaire et lumen d’imagerie.

Le c. elegans Excretory Canal comme modèle pour la morphogenèse Lumen intracellulaire et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire dans une seule cellule : étiquetage de GFP-fusions, Arni Interaction écran et imagerie

Nous décrivons une extraction artisanale modifiée et les dosages colorimétriques de lactate et pyruvate chez le nématode elegans de c. Lors de l’utilisation de trousses d’analyse commerciale, le développement technique de leur sensibilité et de précision est important. Précipitation de protéines dans l’extraction est l’étape la plus critique pour le dosage des métabolites intracellulaires.

Petits dosages colorimétriques de Lactate intracellulaire et Pyruvate chez le nématode Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit comment mesurer la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans. Cette méthode est utile pour la recherche biologique fondamentale sur la santé intestinale liée à l'interaction entre les bactéries intestinales et leur hôte et pour le dépistage pour identifier les agents probiotiques et chimiques pour guérir le syndrome de l'intestin qui fuit et les maladies inflammatoires de l'intestin.

Mesurer les effets des bactéries et des produits chimiques sur la perméabilité intestinale de Caenorhabditis elegans

Le déclin protéostatique est une caractéristique du vieillissement, facilitant l’apparition de maladies neurodégénératives. Nous décrivons un protocole pour mesurer quantifiablement la protéostase dans deux tissus différents de Caenorhabditis elegans par l’expression hétérologue de répétitions de polyglutamine fusionnées à un rapporteur fluorescent. Ce modèle permet une analyse génétique in vivo rapide de la protéostasie.

Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez Caenorhabditis elegans

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet l’imagerie sélective et sans étiquette de fractions chimiques spécifiques et elle a été utilisée efficacement pour imager des molécules lipidiques in vivo. Ici, nous fournissons une brève introduction au principe de la microscopie SRS et décrivons des méthodes pour son utilisation dans le stockage des lipides d’imagerie dans Caenorhabditis elegans.

Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée

L’enseignement des sciences biologiques peut être rendu plus stimulant pour les élèves par l’utilisation de l’expérimentation. Ce manuscrit présente deux protocoles différents mais complémentaires qui peuvent être utilisés en classe pour encourager les élèves à formuler et à tester des hypothèses liées aux régimes riches en calories, à la famine et au vieillissement.

Utilisation de colorants à faible coût pour visualiser l’accumulation de glycogène et l’intégrité intestinale chez Caenorhabditis elegans

Découvrez une méthode simple et reproductible pour évaluer l'alcalinisation lysosomique dans l'intestin de Caenorhabditis elegans en utilisant le colorant cDCFDA. Cette technique aide les chercheurs à étudier l'autophagie et la fonction lysosomale.

Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l' intestin de vivre Caenorhabditis elegans

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