Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

L’objectif global de ce protocole est d’isoler les neurones, les macrophages et les microglies des cerveaux de larves de poisson-zèbre et d’extraire de l’ARN de haute qualité pour effectuer des analyses en aval telles que la qPCR et la transcriptomique. Les larves de poisson-zèbre transgéniques sont un outil puissant pour l’imagerie en direct et nous offrent la possibilité d’observer des cellules individuelles comme la microglie dans leur environnement de vie au fil du temps. Cependant, pour obtenir une compréhension détaillée de leurs fonctions, nous devons comprendre leur profil d’expression génique, et notre protocole d’isolement et de tri est conçu à cet effet.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut isoler différents types de cellules du système nerveux central avec une modification minimale de leur profil d’expression génique, de sorte que les fonctions et les propriétés cellulaires peuvent être caractérisées. L’efficacité de ce protocole se reflète dans son efficacité. Grâce à ce protocole, des quantités suffisantes d’ARN peuvent être produites dans de courts laps de temps pour diverses applications en aval.

Après avoir élevé des embryons de poisson-zèbre dans un milieu E3 contenant du PTU conformément au protocole textuel, utilisez un stéréomicroscope fluorescent pour dépister les larves à deux dpf pour les macrophages positifs à la GFP et les microglies dans les neurones positifs à DsRED. Pour homogénéiser les embryons, en un point, cinq ml de tricaïne de 15 millimolaires pour 50 ml de milieu à 50 larves pour préparer l’anesthésie. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur de trois ml, transférez 10 larves à la fois dans une boîte de Pétri de 55 ml remplie d’un milieu E3 glacé avec de la tricaïne pour les anesthésier finalement.

Sous un stéromicroscope, alignez 10 larves au centre de la boîte de Pétri, puis à l’aide de micro-ciseaux chirurgicaux, transectez les têtes larvaires au-dessus du sac vitellin. À l’aide d’une pipette Pasteur de trois ml, prélever toutes les têtes et, avec le moins de liquide possible, les transférer dans un homogénéisateur en verre sur de la glace contenant un ml de milieu glacé A.Remplacez chaque petite boîte de Pétri contenant du E3 plus Tricaïne glacé par une nouvelle toutes les 30 minutes pour vous assurer que la section est effectuée dans un milieu E3 plus Tricaïne froid. Remplacez le média A glacé dans l’homogénéisateur en verre lorsque la couleur commence à s’estomper.

Une fois que tout le groupe de têtes a été collecté, retirez tout le média A de l’homogénéisateur en verre et remplacez-le par un ml de média A frais et glacé. Avec l’homogénéisateur encore sur la glace, utilisez un pilon bien ajusté pour perturber le tissu cérébral en effectuant 40 cycles d’écrasement et de retournement pour trois à cinq larves de dpf et 50 tours pour sept et huit larves de dpf. Ajoutez ensuite deux ml de Média A à la suspension cellulaire pour diluer les cellules et réduire leur agglomération avec de la myéline. Éliminez l’agglomération cellulaire en faisant passer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 microns dans un tube faucon froid de 50 ml sur de la glace.

Répétez cette étape trois fois. Transférez un ml d’aliquotes de suspension cellulaire dans des tubes froids de cinq ml et faites-les tourner à 300 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une seringue de 10 ml avec une aiguille d’un pouce de calibre 23, retirez le surnageant.

Avec un ml de milieu glacé à gradient de densité de 22 % doucement recouvert par un point zéro cinq ml de 1X dbps glacé, remettez doucement la pastille en suspension cellulaire. Faites tourner les tubes à 950 fois g sans interruption en accélération lente à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après le spin, jetez le milieu de gradient de densité dbps dans la myéline piégée à leur interphase.

Ensuite, utilisez zéro virgule cinq ml de média A avec deux pour cent de NGS pour laver les cellules, et faites tourner les tubes à 300 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez autant de surnageant que possible, puis rassemblez les pastilles cellulaires des mêmes conditions expérimentales dans un ml de milieu A avec deux pour cent de NGS. Si les cellules d’intérêt expriment une protéine fluorescente, faites passer la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine de 35 microns et transférez-les dans des tubes FACS froids de 5 ml sur de la glace à l’abri de la lumière.

Pour immunocolorer la microglie, utilisez zéro virgule trois ml de Medium A plus deux pour cent de NGS pour remettre la pastille cellulaire en suspension, puis divisez les cellules en trois tubes d’un virgule cinq ml, un pour les cellules non colorées pour mesurer l’autofluorescence, un pour mesurer la liaison non spécifique d’un anticorps secondaire à la microglie et un troisième comme test. À tous les tubes, ajoutez un pour cent d’azoture à faible teneur en endotoxines ou une feuille pour bloquer les interactions CD16, CD32 avec le domaine FC des immunoglobulines. Ensuite, incubez les cellules pendant 10 minutes avec une légère agitation toutes les cinq minutes.

Ensuite, dans le troisième tube, ajoutez l’anticorps 4C4 et incubez-le pendant 30 minutes avec une légère agitation toutes les 10 minutes. Ensuite, faites tourner les tubes à 300 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir jeté le surnageant, lavez la pastille une fois avec zéro virgule cinq ml de média A plus deux pour cent de NGS avant de faire tourner à nouveau les tubes.

Remettez la pastille en suspension avec zéro virgule cinq ml de milieu A plus deux pour cent de NGS, puis ajoutez un pour cent de feuille et incubez les cellules pendant 10 minutes en agitant doucement toutes les cinq minutes. Aux tubes deux et trois, ajoutez des anticorps secondaires et placez les tubes dans l’obscurité. Après avoir fait tourner les tubes et jeté le surnageant, utilisez zéro virgule cinq ml de milieu A plus deux pour cent de NGS pour laver les échantillons deux fois, puis remettez les pastilles en suspension avec un ml de milieu A plus deux pour cent de NGS.

Faites passer la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine de 35 microns et transférez-la dans des tubes FACS froids de cinq ml sur de la glace à l’abri de la lumière. Enfin, effectuez le tri FACS et l’extraction de l’ARN selon le protocole texte. Dans cette étude, des neurones et des macrophages ainsi que des microglies ont été isolés chez huit larves dpf mpeg1 EGFP-positive NBT dsRED-positive.

Le FACS a été utilisé pour séparer les cellules des débris en fonction de leur taille et de leur granularité. Les cellules simples ont ensuite été séparées des doublets ou des agglomérats cellulaires. À partir de la population de cellules uniques, une porte a été dessinée pour éliminer les cellules mortes.

Le graphique à points correspondant a révélé que ce protocole expérimental préserve l’intégrité de la membrane plasmique cellulaire, car le taux de cellules mortes n’est que de 26,7 %. Comme montré ici, les neurones et les macrophages ainsi que la microglie ont été facilement séparés des portes de la population de cellules vivantes. Dans le cerveau, la population de neurones semblait être plus importante que la population de macrophages et de microglies.

Dans une deuxième étude, le tri FACS a été utilisé pour isoler des microglies vivantes du cerveau des larves avec 4C4, un anticorps qui marque spécifiquement les microglies. Comme le résume ce tableau des données d’isolement de la microglie et d’extraction de l’ARN, le nombre de microglies dans le cerveau des larves de poisson-zèbre varie et est très faible à trois dpf. Enfin, les résultats d’extraction d’ARN obtenus avec une expérience à partir de la microglie de cinq cerveaux de poisson-zèbre larvaire dpf sont montrés dans cette trace d’électrophorèse avec une visualisation claire de l’ARN ribosomique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures selon le nombre de têtes nécessaires par condition. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de tout garder froid et les surfaces propres pour éviter la dégradation de l’ARN. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences en utilisant le poisson zèbre comme modèle pour explorer les profils d’expression génique de différentes cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les neurones, les macrophages et la microglie du cerveau des larves de poisson-zèbre, et comment extraire de l’ARN de haute qualité pour effectuer une analyse en aval comme la qPCR et la transcriptomique.