Name: Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez comment isoler des neurones, macrophages et microglies du cerveau de larves de poisson zèbre et extraire un ARN de haute qualité pour des analyses qPCR et transcriptomiques. Cette méthode permet d'étudier les profils d'expression génique avec une modification minimale.

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Nous remercions le Dr Claire Davis et Dr Véronique Miron (la Reine Medical Research Institute, Edimbourg, Royaume Uni) pour aide initiale et discussions sur l’approche expérimentale et le QMRI Flow Cytometry et centre de tri de cellule. Ce travail a été soutenu par une bourse de mise en place carrière de Cancer Research UK à Dr. Dirk Sieger.

1. échantillonnage et préparation des médias
<ol><li>Préparer les moyennes de l’embryon (E3) en dissolvant 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2O.</li>
	<li>Recueillir des embryons de poisson-zèbre immédiatement après la fécondation (0 dpf).<ol>
<li>Diviser des embryons de poisson-zèbre en 50 par 90 mm boîte de Pétri. Soulever les embryons à 28,5 ° C dans 50 mL de milieu de l’embryon (E3) traité avec 200 µM 1-phényl 2-thiourée (PTU), de la fin de la première journée du développement (0 dpf) pendant la durée de l’expérience pour inhiber la pigmentation.</li>
		<li>Changement l’E3 + PTU moyennes par jour pendant la durée de l’expérience.</li>
		<li>Mpeg1:eGFP d’écran et des larves de NBT:DsRed à 2 dpf utilisant un stéréomicroscope fluorescent d’expression du transgène positive, GFP+ macrophages/microglie et DsRed+ neurones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparez tous les médias le jour avant l’expérience sous une hotte de culture de tissus pour éviter la contamination, puis les stocker à 4 ° C.<ol>
<li>Préparer les médias A en dissolvant 15 Hepes et 25 mM D-Glucose en HBSS 1 x.</li>
		<li>Préparer le milieu de gradient de densité (100 %) en mélangeant 9 volumes du milieu de gradient de densité 1 volume de HBSS 10 x.</li>
		<li>Préparer le milieu de gradient de densité (22 %), en diluant 22 mL de milieu de gradient de densité (100 %) à 88 mL de SPD 1 x.</li>
		<li>Préparer le SPD 1 x.</li>
		<li>Préparer des E3 moyen + tricaïne en mélangeant E3 moyen avec 450 μM tricaïne.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. homogénéisation
Remarque : Toutes les étapes sont exécutées 4 ° C.
<ol><li>Ajouter 1,5 mL de tricaïne (15 mM) à 90 mm de Pétri contenant 50 larves dans 50 mL de milieu d’embryon E3 traité avec 200µm PTU à anesthésier en phase terminale eux.<ol>
<li>Aspirer 10 larves anesthésiés depuis les boîtes de Pétri avec une pipette en plastique en vrac Pasteur de 3 mL.</li>
		<li>Larves de transfert anesthésié 10 par 10 dans une boîte de Pétri 55 mm rempli de glacee moyen d’embryon E3 + tricaïne.</li>
		<li>Sous un stéréomicroscope, aligner 10 larves dans le centre de la boîte de Pétri. Puis transect larves tête hors du sac vitellin à l’aide de micro-ciseaux chirurgicaux (exclure la vessie natatoire pour éviter flottant têtes).</li>
		<li>Aspirer les chefs des boîtes de Pétri avec une pipette en plastique en vrac Pasteur de 3 mL. Attendez que toutes les têtes se rassemblent au sein de l’embout de la pipette et puis de les transférer dans un homogénéisateur de verre contenant 1 mL glacee Media A (transfert dans un volume minimal pour réduire les médias une dilution par E3 + tricaïne). Garder l’homogénéisateur de verre sur la glace. Utilisez un homogénéisateur par condition expérimentale.</li>
		<li>Remplacer chaque petite boîte de Pétri contenant de glace froide E3 + tricaïne avec un nouveau toutes les 30 minutes afin d’assurer que la résection est effectuée en froid E3 + tricaïne moyen.</li>
		<li>Remplacer le glacé A de médias de l’homogénéisateur de verre fondu au démarrage la couleur. Remarque : Dilution A Media peut altérer le tissu de siège en raison de changements de température.</li>
		<li>Une fois que tous les chefs ont été collectées (600 têtes/État), supprimer le volume maximum de médias A de l’homogénéisateur de verre et la remplacer par 1 mL frais glacé Media a</li>
		<li>Perturber le tissu de cerveau avec un homogénéisateur verre serré sur la glace. Effectuer 40 tours de broyage et de tours pour 3-5 larves de dpf et 50 pour les larves de dpf 7 et 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 2 mL de médias A suspension cellulaire (1 mL médias / 200 têtes), qui va diluer les cellules et réduire leur agglomération avec la myéline pour faciliter leur séparation pendant la centrifugation dans milieu de gradient de densité.<ol>
<li>Pour éliminer l’agglomération de cellule, exécutez la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 40 µm placé au dessus d’un tube de faucon de froid 50 mL maintenu sur la glace. Répéter cette opération 3 fois.</li>
		<li>Transférer 1 mL de suspension cellulaire dans des tubes à froid 1,5 mL et leur filer à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Retirez le surnageant à l’aide d’une seringue de 10 mL + aiguille 23 x 1''.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspendre le culot cellulaire avec 1 mL de milieu dégradé de glacee 22 % densité délicatement recouvert par 0,5 mL de SPD glacée 1 x (do mélangez pas à eux, une interphase entre les deux solutions on le verra).<ol>
<li>Faites tourner les tubes à 950 g sans frein et d’accélération lente pendant 30 min à 4 ° C. Remarque : Cette étape sépare de la myéline des autres cellules par séquestration il à l’interphase de SPD 1 x et milieu gradient de densité de 22 %, alors que les cellules seront granulé au fond du tube. Enlèvement de la myéline est plus efficace quand la concentration cellulaire n’est pas trop élevée.</li>
		<li>En utilisant une seringue de 10 mL + aiguille 23 x 1'' jeter le maximum de SPD, milieu de gradient de densité et la myéline piégé à leur interphase.</li>
		<li>Laver les cellules avec 0,5 mL de médias A + 2 % de sérum de chèvre normal (NGS), puis faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Jeter le surnageant au maximum, puis mettre en commun toutes les boulettes de cellule de la même condition expérimentale ensemble dans 1 mL de médias + 2 % NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si les cellules d’intérêt expriment une protéine fluorescente comme macrophages/microglie de mpeg1:eGFP ou les neurones des NBT:DsRed poissons transgéniques (dépistage des poissons transgéniques voir 1.1.3), exécutez la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 35 µm cap et transférez-les dans un tubes froid 5 mL FACS sur ice, abri de la lumière. Remarque : Par ailleurs, immunomarquage des microglies peut être effectuée.</li>
</ol>3. la microglie Immuno-coloration
Remarque : Toutes les mesures sont effectuées à 4 ° C.
<ol><li>Resuspendre le culot cellulaire avec 0,3 mL de médias + 2 % NGS. Divisez-les en tubes de 3 x 1,5 mL : un pour les cellules incolores sur mesure auto-fluorescence des cellules d’intérêt, deuxième pour l’anticorps secondaire (1/200) mesurer la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire dans la microglie et troisième comme un test (4 4 souris monoclonal anticorps (microglies spécifique) (1/20) + anticorps secondaire (1/200)).<ol>
<li>Ajouter faible endotoxine, exempte d’azoture (feuille) à 1 % pour les cellules (tous les tubes) pour bloquer les interactions CD16/CD32 avec le domaine Fc des immunoglobulines. Incuber les cellules pendant 10 min avec agitation douce toutes les 5 min.</li>
		<li>Ajouter les 4 4 anticorps (1/20) aux cellules (tube 3) et incuber pendant 30 minutes avec agitation douce toutes les 10 min.</li>
		<li>Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.</li>
		<li>Laver une fois avec 0,5 mL de médias A + 2 % NGS, puis essorer tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Une nouvelle suspension du culot avec 0,5 ml de médias + 2 % NGS et incuber les cellules avec des feuilles à 1 % pendant 10 min avec agitation douce toutes les 5 min.</li>
		<li>Ajoutez l’anticorps secondaire (1/200) aux cellules (tube 2 et 3). Incuber les cellules pendant 30 min avec agitation douce toutes les 10 min et protection contre la lumière.</li>
		<li>Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant.</li>
		<li>Laver deux fois avec 0,5 mL de médias + 2 % NGS, puis remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 mL de médias + 2 % NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécuter la suspension cellulaire en établissant un plafond de crépine 35 µm cellulaire et de les transférer dans des tubes à froid 5 mL FACS sur ice, abri de la lumière.</li>
</ol>4. cellule triant (FACS)
Remarque : Effectuez toutes les opérations à 4 ° C.
<ol><li>Trier les neurones, macrophages/microglie et la microglie en utilisant un FACS. Remarque : Cette étape est généralement effectuée par un membre du personnel de l’installation de FACS et paramètres dépendent du type de matériel utilisé.<ol>
<li>Ajouter DAPI à une concentration de 1 µg/mL dans chaque tube de FACS d’étiqueter les cellules mortes.</li>
		<li>Définir les neurones FACS et tri, macrophages/microglie ou microglie de toutes les cellules du cerveau. Séparer les cellules des débris en fonction de leur taille et la granularité, puis single-cellules de forward scatter et diffusion latérale de la porte. Exclure les cellules mortes par DAPI marquage de cellules vivantes. Identifier les neurones, les macrophages/microglie ou microglie par leur coloration positive respectifs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prélever des cellules dans des tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de glacé de médias A + de 2 % end sur la glace. Utilisez des tubes différents pour chaque type de cellule.<ol>
<li>Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite jeter le surnageant.</li>
		<li>Laver une fois avec 0,5 mL de médias A puis jeter le liquide surnageant au maximum.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Extraction de l’ARN
<ol><li>Extrait les différents types de cellules séparées par des FACS de RNA. Pour extraire l’ARN utilise un kit spécifique et suivre les directives du fabricant. Vérifier que vous travaillez dans un environnement libre de RNase par espace de travail de nettoyage et des pipettes avec un produit de décontamination de RNase et utiliser des pointes à filtre.<ol>
<li>Fraîchement préparer 1 mL de tampon de lyse additionné de 50 µM de β-mercaptoéthanol. Remarque : Ici, les β-mercaptoéthanol est ajouté pour réduire la dégradation de l’ARN.</li>
		<li>Préparer de solution d’éthanol à 70 % et 80 % à l’aide de RNase eau gratuite.</li>
		<li>Lyse des cellules avec 75 µL de tampon de lyse additionné de 50 µM de β-mercaptoéthanol. Puis utilisez un broyeur pour améliorer la désorganisation de la cellule.</li>
		<li>Continuer le Guide de l’extraction de l’ARN selon le fabricant.</li>
		<li>À la fin du protocole, éluer l’ARN avec 14 µL d’eau libre de RNase pour obtenir une concentration suffisante d’ARN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole expérimental décrit ici représente une méthode robuste et efficace d’isoler les cellules du cerveau des larves de poisson zèbre de 3 à 8 dpf. Ce qui est important, c’est le premier protocole qui permet l’isolement spécifique des cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre. Le protocole est conçu pour préserver l’intégrité de la membrane cellulaire et pour réduire au minimum les modifications possibles de l’expression des gènes qui se produisent pendant le traitement. Ce dernier point est crucial pour la pertinence des résultats basés sur l’analyse de ces profils génomiques cellulaires isolés. En effet, polarisation de la microglie et les macrophages sont fortement influencées par leur microenvironnement. À 37 ° C, ces cellules auraient changé leur profil d’expression génique en réponse à des conditions expérimentales (réponse de blessures (résection)). Par conséquent, il était essentiel réaliser cette expérience à 4 ° C avant l’extraction de l’ARN, à ralentir les processus cellulaires et activités métaboliques. En outre, l’homogénéisation de tissu de cerveau mécanique à 4 ° C a été choisie au lieu de la digestion enzymatique de tissus à 37 ° C pour éviter tout impact sur les profils d’expression génique.
Il est important de souligner que cette méthode est très rapide ; en une journée, plusieurs populations de cellules cérébrales peuvent être isolées dans au moins deux des conditions expérimentales différentes et leur ARN extrait. La longueur totale du protocole dépend du nombre de larves utilisé pour chaque condition car la transection de têtes larvaire est l’étape limitante (∼ 350 têtes/h). En général, pour travailler avec les cellules microgliales du 3, 5 et 7 dpf il est recommandé transect 600 têtes de ∼ par test d’obtenir assez ARN pour extraire (tableau 1). Comme la microglie représentent le type de cellule avec le plus faible rendement (env. 112 cellules par habitant à 7 dpf), le nombre de têtes peut être réduit pour les autres types de cellules, y compris les macrophages (env. 170 cellules par habitant à 7 dpf).
Un autre avantage de ce protocole est qu’une fois les paramètres sur la trieuse de FACS ont été établis, les mêmes paramètres peuvent être utilisés pour différentes expériences. Il a été observé que populations cellulaires parfaitement d’une expérience à l’autre avec portes déjà conçus, montrant la reproductibilité des expériences à l’aide de cette méthode.
Un léger désavantage de cette méthode est la quantité relativement basse de l’ARN qui est récoltée. Toutefois, cette limitation est plus un problème biologique à une question technique, comme le nombre de cellules microgliales est très faible aux premiers stades du développement du cerveau (tableau 1). En raison de cette faible quantité d’ARN recueillie, amplification il faut considérer pour effectuer l’analyse du génome de l’expression génique large. Heureusement, ces étapes d’amplification produisent des quantités suffisantes de cDNA de haute qualité. Ainsi, les changements globaux dans les profils d’expression génique de cellules isolées peuvent être étudiées.
En conclusion, ce protocole fournit une méthode robuste pour isoler et étudier les différents types de cellules du CNS de cerveaux de larves de poisson zèbre. Ceci peut être appliqué pour acquérir une meilleure compréhension de ces cellules au cours du développement ainsi qu’à étudier leur rôle dans la maladie.

Connaissances sur le développement du cerveau et les maladies du cerveau a considérablement amélioré depuis la première quantification de cerveau de souris transcriptomes1ces dix dernières années. En effet, analyse du génome de l’expression génique large nous donne accès à l’information génétique détaillée sur les tissus du cerveau et des cellules qui peuvent compléter et améliorer les observations faites avec d’autres techniques et outils.
Le poisson-zèbre est un modèle biologique puissant, facile à reproduire et à modifier génétiquement ; sa transparence optique à l’état larvaire permet aux vivants d’observations d’imagerie2. Malheureusement, par rapport aux humains et de souris, le nombre d’anticorps disponibles pour effectuer l’immunomarquage est plutôt faible. Pour remédier à cela, lignes de poissons transgéniques zebrafish se font facilement en modifiant génétiquement des poissons pour exprimer les protéines fluorescentes sous promoteurs spécifiques de type cellulaire. Lignes de poissons zèbres transgéniques ont été utilisés dans le passé pour étudier le rôle des macrophages et des cellules microgliales pendant le développement du système nerveux central (SNC) et la maladie3,4,5,6. Cependant, pour acquérir une compréhension détaillée de ces processus, nous avons besoin de comprendre les changements dans l’expression des gènes dans les types cellulaires respectives. Dans ce but, nous avons développé une méthode expérimentale pour isoler spécifiquement des cellules, comme les neurones, les macrophages et les cellules microgliales de 3 à 8 jours cerveaux de larves de poisson zèbre après fécondation (dpf). Pour la mise en place du protocole, nous avons travaillé avec des lignées de poissons transgéniques qui expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans les macrophages/la microglie dans le promoteur du gène exprimés par les macrophages (mpeg1:eGFP) et la DsRed dans les neurones en vertu de la ß-tubuline neurale promoteur (NBT:DsRed)7,8,9. En outre, nous avons effectué immunomarquage des microglies utilisant 4 4, un anticorps monoclonal de souris qui taches spécifiquement zebrafish microglie10,11. Par la suite, l’acide ribonucléique (ARN) est extraite de ces cellules d’autres réaction en chaîne de polymérase quantitative (qPCR) ou analyse du transcriptome. Ce protocole a été conçu pour homogénéiser efficacement les tissus cérébraux des larves de poisson zèbre ; recueillir des neurones, des macrophages/microglie et des microglies sans altération de leur intégrité de la membrane plasmique et enfin extraire RNA de ces cellules en haute qualité (RIN > 7) et la quantité à effectuer des analyses génomiques. Contrairement aux études déjà publiées qui utilisent le traitement par la trypsine à 37 ° C à digérer le tissu de cerveau12,13, ce protocole favorise le travail à 4 ° C jusqu'à l’étape d’extraction RNA pour réduire les modifications du profil de l’expression génique. Cette étape est cruciale comme la microglie et les macrophages sont des cellules très sensibles qui réagissent aux changements de leur microenvironnement immédiatement en altérant leur gene expression profil et polarisation14,15, 16.
Le protocole, décrit ici en détail, montre que l’isolement des neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau larves de poisson zèbre, mais pratiquement, il peut être adapté à n’importe quelle autre cellule présente dans le cerveau - à l’aide de lignes de poissons transgéniques ou étiquetés au moyen anticorps spécifiques. Cette méthode permettra une meilleure caractérisation des cellules de la CNS à travers leurs analyses d’expression de gène large du génome et aidera à comprendre leur rôle lors du développement et de maladies du cerveau.

<table><tbody><tr><td>1-phényle 2-thiourée (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Stérile standard Boîtes de Pétri 90mm</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ciseaux chirurgicaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Pasteur Pipette en vrac en plastique</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur en verre</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri standard Sterilin 55mm</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro ; Filtre cellulaire m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tube conique en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 mL</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 23G x 1''</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal (NGS)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu ; m cell strainer cap</td><td>Tubes BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trieur FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS facility</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>&nbsp ; 31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAdestructeur</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Système de synthèse de premier brin</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Système de PCR en temps réel&nbsp ;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Réactifs Pico</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et extraction de l’arn des neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Pour obtenir une compréhension détaillée du rôle des différentes cellules de CNS pendant le développement ou la mise en place et l’évolution des pathologies cérébrales, il est important d’isoler ces cellules sans modifier leur profil d’expression génique. Le modèle de poisson-zèbre fournit un grand nombre de lignes de poissons transgéniques dans lesquelles les types spécifiques de cellules sont étiquetées ; par exemple les neurones dans le fil de la NBT:DsRed ou les macrophages/microglies dans la ligne de mpeg1:eGFP. En outre, les anticorps ont été développés pour colorer des cellules spécifiques, tels que les cellules microgliales avec 4 4 anticorps.
Nous décrivons ici l’isolement des neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre. Central de ce protocole est l’évitement d’une digestion enzymatique de tissus à 37 ° C, ce qui pourrait modifier les profils cellulaires. Au lieu de cela, un système mécanique d’homogénéisation des tissus à 4 ° C est utilisé. Ce protocole comporte l’homogénéisation des cerveaux en suspension cellulaire, leur immunomarquage et l’isolement des neurones, les macrophages et les cellules microgliales par FACS. Par la suite, nous RNA extraites de ces cellules et évalué leur qualité/quantité. Nous avons réussi à obtenir l’ARN de haute qualité (nombre d’intégrité RNA (RIN) > 7) exercer qPCR, analyse des macrophages/la microglie et les neurones et transcriptomique microglie. Cette approche permet une meilleure caractérisation de ces cellules, mais aussi une meilleure compréhension de leur rôle dans le développement et les pathologies.

Le protocole décrit est une approche simple d’isoler les neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau larves de poisson zèbre. Ces isolé des cellules, des quantités importantes de haute qualité (RIN &gt; 7) RNA ont été extraites. Le but du présent protocole est d’isoler les différents types de cellules du SNC, avec une modification minime de leur profil d’expression génique d’analyser et de caractériser les fonctions et les propriétés de cellule. Par conséquent, l’ensemble du protocole est effectué à 4 ° C avec une homogénéisation de tissu de cerveau mécanique. Cette méthode a été utilisée avec succès pour les deux études réalisées en laboratoire. Dans la première étude, les neurones et les macrophages/microglie ont été isolées 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larves (Figure 1). FACS permis la séparation des cellules des débris en fonction de leur taille (FSC-A) et la granularité (SSC-A) (Figure 1A). Cellules individuelles ont ensuite été séparés de doublets ou agglomérés (Figure 1B) de la cellule. De la population de cellule unique, une porte a été dessinée pour éliminer les cellules mortes (DAPI+). L’intrigue de point correspondant a révélé que ce protocole expérimental préserve l’intégrité cellulaire membrane plasmique, le taux de cellules mortes est seulement 26,7 % (Figure 1C). Enfin, les neurones (DsRed+) et les macrophages/cellules microgliales (GFP+) étaient facilement séparés depuis les portes de la population de cellules vivantes. La population de neurones (23,1 %) semble être plus important que la population de macrophages/cellules microgliales (1,56 %) dans le cerveau (Figure 1D). Ce protocole a permis d’isoler l’ARN à partir de ces cellules pour effectuer des analyses ultérieures de qPCR pour comparer l’expression des gènes spécifiques entre les neurones et les macrophages/microglie. La figure 2 illustre neuronale et macrophages/microglie niveaux d’expression de gène de l' antigène nucléaire de prolifération cellulaire (pcna)en regard du gène β-actine de ménager à titre d’exemple.
Pour la seconde étude cette méthode axée sur la microglie isolement de 3, 5 et 7 dpf cerveau larvaire. Contrairement à l’expérience décrite ci-dessus, les cellules ont été isolées par immunomarquage à l’aide de 4 4, un anticorps qui étiquète spécifiquement la microglie (Figure 3 A-D). Comme décrit précédemment, la microglie (4 4+) ont été sélectionnés dans des cellules vivantes et recueillies (Figure 3D). Les nombres de la microglie dans les cerveaux larves de poisson zèbre sont variables (tableau 1) et très bas à 3 dpf (∼ 25 par poisson). Qualité et la quantité d’ARN extrait de ces cellules ont été mesurées à l’aide d’un système d’électrophorèse capillaire-micro basé. Résultats obtenus de l’ARN extrait des cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre dpf 5 ont été fournis pour illustrer un exemple d’analyse de RNA (tableau 1 (dpf 5 ; expérience 4)). La figure 4 montre la trace de l’électrophorèse et de sa représentation graphique obtenue pour cet exemple avec une visualisation claire de l’ARN ribosomique (28 s et 18 s). Ces données sont nécessaires pour calculer l’échantillon RIN et déterminer la concentration en ARN. Le tableau 1 résume le nombre de microglie isolé par les poissons, la quantité d’ARN par la microglie et la note de RIN obtenue pour chacune des expériences différentes à 3, 5 et 7 dpf. La quantité et la qualité de l’ARN extrait de microglie isolée à l’aide de cette méthode nous a permis d’amplifier l’ARN en ADNc à l’aide d’un kit. Des tests qualité et la quantité fournies par Édimbourg génomique confirment que l’ADNc amplifié est d’une qualité suffisante pour la préparation de la bibliothèque et le séquençage subséquent. La figure 5 montre la distribution de taille des fragments d’ADNc et leur hauteur d’eau mesurée à l’aide d’un système d’électrophorèse. Dans cet exemple, l’ADNc affichait une taille moyenne de 299bp à une concentration de 36100 pmol/l. le tableau 2 illustre respectivement qualitativement et quantitativement les essais effectués sur ADNc amplifié des échantillons d’ARN (tableau 1 (dpf 5 ; expérience 4)). L’ADNc amplifié a été utilisée avec succès pour le séquençage.
Plusieurs études menées en laboratoire ont confirmé que la qualité et la quantité de l’ARN extrait des neurones, les macrophages et les cellules microgliales utilisable pour qPCR ultérieur et les analyses d’expression de gène large du génome. Par conséquent, ce protocole expérimental peut servir à isoler efficacement différents types de cellules de CNS sans altérer leur intégrité membranaire et limiter la modification de leur profil d’expression génique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> Figure 1 : FACS trier des neurones et des macrophages/microglie de /NBT:DsRed mpeg1:GFP++ 8 larves de poisson zèbre dpf. (A-C) Gating successives montre une sélection séquentielle de tous les cerveau des cellules (A), dispersent de cellules individuelles de dispersion vers l’avant et de côté (B). Les cellules mortes (C) ont été exclus par marquage au DAPI. (D) les neurones et les macrophages/microglie ont été identifiés respectivement par une coloration positive DsRed et GFP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> Figure 2 : Analyse de l’expression génique pour pcna et β-actine dans les neurones et les macrophages/microglie. ARN de neurones isolés et macrophages/microglies peut être transcrit en ADNc devant servir à une analyse par PCR quantitative. niveaux d’expression de mRNA de pcna contre β-actine -gène dans les neurones isolés et macrophages/microglie déterminé par qPCR (N = 3). Changement de pli a été mesuré à l’aide de la méthode comparative (ΔΔCT). Erreur bar représentent moyenne ± SEM. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> Figure 3 : FACS trier des microglies 3 larves de poisson zèbre dpf. (A-C) Gating successifs voir la sélection séquentielle du cerveau toutes les cellules (A), dispersent de cellules individuelles de dispersion vers l’avant et de côté (B). Les cellules mortes (C) ont été exclus par marquage au DAPI. (D) la microglie ont été identifiés par 4 4 coloration positive. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> Figure 4 : Résultats de l’électrophorèse micro-capillaire de l’ARN extrait des microglies de poisson-zèbre dpf 5. Les deux pics de hautes sont l’ARN ribosomique 18 s et 28. Nombre d’intégrité RNA (RIN) a été calculé automatiquement par le logiciel bioanalyzer en utilisant le rapport généré entre les 18 et 28 sous-unités ribosomiques et l’analyse du tracé électrophorétique ensemble. La microglie ARN a une 8.6 RIN. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> Figure 5 : Tests de qualité et la quantité du cDNA amplifié de l’échantillon de RNA de dpf 5 poisson zèbre la microglie. L’image montre la distribution de taille de fragment de cDNA de l’échantillon analysé avec une taille moyenne de 299 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Condition</td>
			<td>Experiment</td>
			<td>Nombre de poissons</td>
			<td>Nombre de cellules</td>
			<td>Nombre de cellules par poisson</td>
			<td>Concentration d’ARN (pg/ul)</td>
			<td>ARN total (pg)</td>
			<td>Montant de RNA par cellule (pg)</td>
			<td>Score de RIN</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0,13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37,55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0,13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0,16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0,10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19,94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0,26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97,72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0,07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54,18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0,13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0,09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84,59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0,07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123,37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0,06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0,07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99,87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0,08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0,06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Sommaire des microglies isolement et données d’extraction d’ARN de larves de poisson zèbre dpf 3, 5 et 7.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Échant. interne</td>
			<td>Échant. externe</td>
			<td>Qubit (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/UL)</td>
			<td>Concentration moyenne (ng/ul)</td>
			<td>Volume (ul)</td>
			<td>UG a reçu</td>
			<td>Réussite/échec pour concentration minimale</td>
			<td>Réussite/échec pour quantité minimum</td>
			<td>Réussite/échec pour quantité recommandée</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (expérience 4)</td>
			<td>58,8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58,6</td>
			<td>30</td>
			<td>1,76</td>
			<td>Pass</td>
			<td>Pass</td>
			<td>Pass</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">Échantillon requis pour la préparation de la bibliothèque :</td>
		</tr>
<tr>
<td>Préparation de la bibliothèque</td>
			<td>Quantité minimale (ng)</td>
			<td>Quantité recommandée (ng)</td>
			<td>Concentration minimale ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq Nano gel gratuit Banque d’inserts bp 350 de cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Tests de quantité d’ADNc amplifié d’échantillon de RNA de dpf 5 poisson zèbre la microglie.

Nous présentons un protocole visant à isoler les neurones, les macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre dans des conditions physiologiques et pathologiques. Après isolement, l’ARN est extrait de ces cellules à analyser leur profil d’expression génique. Ce protocole permet à la collection de l’ARN haute qualité pour effectuer des analyses en aval comme qPCR et transcriptomique.

Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

L’objectif global de ce protocole est d’isoler les neurones, les macrophages et les microglies des cerveaux de larves de poisson-zèbre et d’extraire de l’ARN de haute qualité pour effectuer des analyses en aval telles que la qPCR et la transcriptomique. Les larves de poisson-zèbre transgéniques sont un outil puissant pour l’imagerie en direct et nous offrent la possibilité d’observer des cellules individuelles comme la microglie dans leur environnement de vie au fil du temps. Cependant, pour obtenir une compréhension détaillée de leurs fonctions, nous devons comprendre leur profil d’expression génique, et notre protocole d’isolement et de tri est conçu à cet effet.Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut isoler différents types de cellules du système nerveux central avec une modification minimale de leur profil d’expression génique, de sorte que les fonctions et les propriétés cellulaires peuvent être caractérisées. L’efficacité de ce protocole se reflète dans son efficacité. Grâce à ce protocole, des quantités suffisantes d’ARN peuvent être produites dans de courts laps de temps pour diverses applications en aval.Après avoir élevé des embryons de poisson-zèbre dans un milieu E3 contenant du PTU conformément au protocole textuel, utilisez un stéréomicroscope fluorescent pour dépister les larves à deux dpf pour les macrophages positifs à la GFP et les microglies dans les neurones positifs à DsRED. Pour homogénéiser les embryons, en un point, cinq ml de tricaïne de 15 millimolaires pour 50 ml de milieu à 50 larves pour préparer l’anesthésie. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur de trois ml, transférez 10 larves à la fois dans une boîte de Pétri de 55 ml remplie d’un milieu E3 glacé avec de la tricaïne pour les anesthésier finalement.Sous un stéromicroscope, alignez 10 larves au centre de la boîte de Pétri, puis à l’aide de micro-ciseaux chirurgicaux, transectez les têtes larvaires au-dessus du sac vitellin. À l’aide d’une pipette Pasteur de trois ml, prélever toutes les têtes et, avec le moins de liquide possible, les transférer dans un homogénéisateur en verre sur de la glace contenant un ml de milieu glacé A.Remplacez chaque petite boîte de Pétri contenant du E3 plus Tricaïne glacé par une nouvelle toutes les 30 minutes pour vous assurer que la section est effectuée dans un milieu E3 plus Tricaïne froid. Remplacez le média A glacé dans l’homogénéisateur en verre lorsque la couleur commence à s’estomper.Une fois que tout le groupe de têtes a été collecté, retirez tout le média A de l’homogénéisateur en verre et remplacez-le par un ml de média A frais et glacé. Avec l’homogénéisateur encore sur la glace, utilisez un pilon bien ajusté pour perturber le tissu cérébral en effectuant 40 cycles d’écrasement et de retournement pour trois à cinq larves de dpf et 50 tours pour sept et huit larves de dpf. Ajoutez ensuite deux ml de Média A à la suspension cellulaire pour diluer les cellules et réduire leur agglomération avec de la myéline. Éliminez l’agglomération cellulaire en faisant passer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 microns dans un tube faucon froid de 50 ml sur de la glace.Répétez cette étape trois fois. Transférez un ml d’aliquotes de suspension cellulaire dans des tubes froids de cinq ml et faites-les tourner à 300 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une seringue de 10 ml avec une aiguille d’un pouce de calibre 23, retirez le surnageant.Avec un ml de milieu glacé à gradient de densité de 22 % doucement recouvert par un point zéro cinq ml de 1X dbps glacé, remettez doucement la pastille en suspension cellulaire. Faites tourner les tubes à 950 fois g sans interruption en accélération lente à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après le spin, jetez le milieu de gradient de densité dbps dans la myéline piégée à leur interphase.Ensuite, utilisez zéro virgule cinq ml de média A avec deux pour cent de NGS pour laver les cellules, et faites tourner les tubes à 300 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez autant de surnageant que possible, puis rassemblez les pastilles cellulaires des mêmes conditions expérimentales dans un ml de milieu A avec deux pour cent de NGS. Si les cellules d’intérêt expriment une protéine fluorescente, faites passer la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine de 35 microns et transférez-les dans des tubes FACS froids de 5 ml sur de la glace à l’abri de la lumière.Pour immunocolorer la microglie, utilisez zéro virgule trois ml de Medium A plus deux pour cent de NGS pour remettre la pastille cellulaire en suspension, puis divisez les cellules en trois tubes d’un virgule cinq ml, un pour les cellules non colorées pour mesurer l’autofluorescence, un pour mesurer la liaison non spécifique d’un anticorps secondaire à la microglie et un troisième comme test. À tous les tubes, ajoutez un pour cent d’azoture à faible teneur en endotoxines ou une feuille pour bloquer les interactions CD16, CD32 avec le domaine FC des immunoglobulines. Ensuite, incubez les cellules pendant 10 minutes avec une légère agitation toutes les cinq minutes.Ensuite, dans le troisième tube, ajoutez l’anticorps 4C4 et incubez-le pendant 30 minutes avec une légère agitation toutes les 10 minutes. Ensuite, faites tourner les tubes à 300 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir jeté le surnageant, lavez la pastille une fois avec zéro virgule cinq ml de média A plus deux pour cent de NGS avant de faire tourner à nouveau les tubes.Remettez la pastille en suspension avec zéro virgule cinq ml de milieu A plus deux pour cent de NGS, puis ajoutez un pour cent de feuille et incubez les cellules pendant 10 minutes en agitant doucement toutes les cinq minutes. Aux tubes deux et trois, ajoutez des anticorps secondaires et placez les tubes dans l’obscurité. Après avoir fait tourner les tubes et jeté le surnageant, utilisez zéro virgule cinq ml de milieu A plus deux pour cent de NGS pour laver les échantillons deux fois, puis remettez les pastilles en suspension avec un ml de milieu A plus deux pour cent de NGS.Faites passer la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine de 35 microns et transférez-la dans des tubes FACS froids de cinq ml sur de la glace à l’abri de la lumière. Enfin, effectuez le tri FACS et l’extraction de l’ARN selon le protocole texte. Dans cette étude, des neurones et des macrophages ainsi que des microglies ont été isolés chez huit larves dpf mpeg1 EGFP-positive NBT dsRED-positive.Le FACS a été utilisé pour séparer les cellules des débris en fonction de leur taille et de leur granularité. Les cellules simples ont ensuite été séparées des doublets ou des agglomérats cellulaires. À partir de la population de cellules uniques, une porte a été dessinée pour éliminer les cellules mortes.Le graphique à points correspondant a révélé que ce protocole expérimental préserve l’intégrité de la membrane plasmique cellulaire, car le taux de cellules mortes n’est que de 26,7 %. Comme montré ici, les neurones et les macrophages ainsi que la microglie ont été facilement séparés des portes de la population de cellules vivantes. Dans le cerveau, la population de neurones semblait être plus importante que la population de macrophages et de microglies.Dans une deuxième étude, le tri FACS a été utilisé pour isoler des microglies vivantes du cerveau des larves avec 4C4, un anticorps qui marque spécifiquement les microglies. Comme le résume ce tableau des données d’isolement de la microglie et d’extraction de l’ARN, le nombre de microglies dans le cerveau des larves de poisson-zèbre varie et est très faible à trois dpf. Enfin, les résultats d’extraction d’ARN obtenus avec une expérience à partir de la microglie de cinq cerveaux de poisson-zèbre larvaire dpf sont montrés dans cette trace d’électrophorèse avec une visualisation claire de l’ARN ribosomique.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures selon le nombre de têtes nécessaires par condition. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de tout garder froid et les surfaces propres pour éviter la dégradation de l’ARN. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences en utilisant le poisson zèbre comme modèle pour explorer les profils d’expression génique de différentes cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques.Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les neurones, les macrophages et la microglie du cerveau des larves de poisson-zèbre, et comment extraire de l’ARN de haute qualité pour effectuer une analyse en aval comme la qPCR et la transcriptomique.

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Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

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