Name: Souris - et anthropique de Culture monocouche épithéliales gastriques primaire pour l’étude de la régénération (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Apprenez à établir des monocouches épithéliales gastriques primaires à partir d'organoides humains et murins pour étudier la régénération et la cicatrisation des plaies. Cette méthode permet d'analyser la migration cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par le NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 accorder (YZ).

Pour éviter toute contamination, effectuer le protocole dans son intégralité dans une hotte de vitroplants stérile. Les tissus humains fundus ont été recueillies auprès de patients subissant une gastrectomie selon le protocole approuvé de la CISR de l’Université de Cincinnati (numéro de protocole de la CISR : 2015-4869). Toutes les études sur les souris ont été approuvés par l’Université de Cincinnati Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) qui maintient une installation Association américaine d’évaluation et d’accréditation de laboratoire Animal Care (AAALAC).
1. établissement d’origine humaine 3D organoïdes fundus gastrique
Remarque : Ce protocole repose sur les recherches publiées antérieurement dans ce laboratoire8.
<ol><li>Préparer les médias organoïde 3D qui se compose de 50 % conditionnée Wnt et 20 % R-spondin conditionné médias.<ol>
<li>Préparer les milieux Wnt conditionné, culture les cellules L de milieu de croissance Wnt (Dulbecco modifiée milieu Eagle (DMEM), 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % pénicilline/streptomycine) pendant 7 jours, récolter le milieu et filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 µm.</li>
		<li>Préparer les médias R-spondin conditionné. Cultiver une lignée de cellules sécrétrices de HEK-293 t R-spondin modifiée dans le milieu R-spondin (Dulbecco modifiée milieu Eagle (DMEM), 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % pénicilline/streptomycine). Sur la pièce jointe après 2 h, changer le support de ces cellules à croissance OPTIMEM moyennes, 1 % pénicilline/streptomycine. Les cellules de la culture pendant 7 jours. Récolter les médias R-spondin conditionné, puis filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 µm. Remarque : Ce protocole a été publié précédemment et pour un protocole plus détaillé voir 6,7,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Décongeler la facteur de croissance réduite et sans rouge de phénol membrane basale matrice pendant 16 h sur la glace à 4 ° C. Recueillir le tissu dans le Ca de glace froide2 +/Mg2 +-libre SPD dans un grand récipient en plastique. Conserver sur la glace jusqu'à l’étape de début 1.4. NOTE : Le tissu est récolté dans les patients subissant une gastrectomie.</li>
	<li>À l’aide de pinces, laver le tissu vigoureusement dans un bécher stérile contenant 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libre Phosphate Buffered Saline (SPD de Dulbecco). Laver pendant environ 30 s ou jusqu'à ce que les débris et le sang a été supprimé. Ensuite, à l’aide de gaze stérile, essuyer la couche muqueuse de l’épithélium.</li>
	<li>À l’aide de grandes pinces, fermement saisir la couche musculaire des tissus et avec force, grattez l’épithélium à l’aide de la grande pince hémostatique incurvée. Recueillir les fragments épithéliales grattées dans une boîte de Pétri stérile, en polystyrène.</li>
	<li>Émincer le tissu épithélial en environ les fragments de2 taille 2.0 x 2.0 mm à l’aide de rasoirs pour optimiser la digestion des tissus. Laver les fragments tissulaires avec Ca2 +/Mg2 + -libre SPD additionné d’antibiotiques (Ca2 +/Mg2 + -libre SPD, 1 % pénicilline/streptomycine, 0,25 mg/mL amphotéricine B 10 mg/mL de gentamicine, kanamycine de 50 mg/mL), jusqu'à ce que le lavage est exempt de sang. Effectuer plusieurs lavages si nécessaire. Jeter hors du lavage en filtrant soigneusement le lavage à travers une gaze stérile dans un bécher de déchets.</li>
	<li>Lavé recueillir des fragments dans un verre de 125 mL avec 25 mm remuer bar et milieu d’incubation préchauffé ballon à fond rond (milieu de base additionné de 2 mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine, 10 mM un tampon HEPES, 1 mg/mL collagénase de Type 1, culture de cellules de 2 mg/mL qualite de l’albumine sérique Bovine). Sceller le ballon à fond rond avec septa caoutchouc.</li>
	<li>Insérer une aiguille spinale de 20 G dans le septum et connectez-le à un réservoir d’oxygène avec tuyau en caoutchouc. Pour filtrer les contaminants, insérer le tube pour créer un filtre papier de soie. Allumez l’écoulement de l’oxygène à faible température. Emmancher 10-15 sorties dans les septums pour éviter la rupture des septums.</li>
	<li>Fixer le jeu vers le haut à un support de bague à l’aide de pinces et placez-le dans un bain-marie étalonné par rapport à 37 ° C avec une plaque de remuer pendant 30-45 min. Après que le tissu a été incubant pendant 15 min, retirer 50 µL de milieu d’incubation et vérifier visuellement les glandes dissociées. Si les glandes ne sont pas denses ou n’ont pas séparés du tissu, laisser pendant un 5-10 min supplémentaire.</li>
	<li>Immédiatement après l’incubation, ajouter 50 mL préchauffé DMEM/F12 au milieu d’incubation à l’aide d’une pipette stérile sérologique ou en versant directement dans le milieu d’incubation.</li>
	<li>Filtrer le mélange de la glande à travers une gaze stérile dans quatre tubes conique de 50 mL. Conserver le filtrat sur la glace pendant 15 minutes afin de permettre des extraits de glandes se déposer au fond du tube conique. Veillez à ne pas déranger les glandes sédentarisés, enlever et jeter du haut 40 mL du surnageant à l’aide d’une pipette sérologique. Remettre en suspension les restants de 10 mL dans 10 mL de SPD additionné d’antibiotiques.</li>
	<li>Répartir le mélange dans 5 mL cell culture des éprouvettes. Centrifuger pendant 5 min à 65 x g à 4 ° C et retirer le surnageant soigneusement à l’aide d’une pipette. Resuspendre le culot de glande dans la matrice décongelés membrane basale en utilisant une pipette ou un 200 µL large de pipette. Mélanger jusqu'à homogénéité. Remarque : Il est crucial d’effectuer cette étape sur la glace et éviter la polymérisation de la matrice de la membrane basale tout en mélangeant. En outre, il est important d’inspecter visuellement la densité de la glande par échantillonnage pour 50 µL. La densité optimale est confluence d’environ 70 %.</li>
	<li>Ensuite, plaque les glandes dans 50 µL de la membrane basale de matrice à l’aide d’une pipette à embout large. Éviter les éventuelles bulles tout en placage.</li>
	<li>Pour permettre la matrice de la membrane basale à polymériser, incuber pendant 10-15 min à 37 ° C. Si électrodéposition dans une plaque de culture de 12 puits, ajouter 1 mL de médias hFGO (milieu de moyenne/F12 Eagle modifié de Dulbecco Advanced additionné de 2mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine, 0,25 mg/mL amphotéricine B 10 mg/mL de gentamicine, 50 mg/mL kanamycine, 10 mM HEPES Tampon, n-Acteylcystine de 1 mM, 1 x N2, 1 x B27, moyen de Wnt-conditionné 50 %, 20 % R-spondin-conditionné additionné à 100 ng/mL d’os inhibiteur de la protéine morphogénétique 1 facteur de croissance fibroblastique 200 ng/mL 10, 10, 50 ng/mL de facteur de croissance épidermique, gastrine nM mM Nicotinamide et 10 µM Y-27632 ROCK inhibiteur) / puits. Si ce n’est pas le cas, à l’aide d’une plaque de culture de 12 puits ajouter assez médias de submerger la bulle de matrice de membrane basale.</li>
	<li>Les cellules à 37 ° C dans une étuve 5 % CO2 humidifié cell culture la culture. Modifier les médias tous les 4-5 jours.</li>
</ol>2. dégager les dérivés de souris 3D organoïdes fundus gastrique
Remarque : Ce protocole a été publiée précédemment 6. Décongeler la matrice de la membrane basale sur la glace et de préparer tous les réactifs avant de commencer.
<ol><li>Sacrifier la souris à l’aide d’une méthode approuvée par l’institution de recherche où la recherche est effectuée. Retirer l’estomac de la souris et disséquer selon les protocoles publiés précédemment 6. Laver à 20 mL glace froid Ca2 +/Mg2 +-libre SPD. Remarque : Souris C57BL/6, âgés de 8 à 10 semaines, sont utilisés pour les cultures de fundus gastrique organoïde. Souris ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone, suivie d’une dislocation cervicale manuelle avant l’enlèvement de l’estomac.</li>
	<li>Enlever la couche musculaire de l’estomac et les vaisseaux sanguins visibles comme précédemment publié 6.</li>
	<li>Séparer le fond de l’antre et du préestomac à l’aide d’une lame de rasoir stérile. Fond de œil coupée à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux en fragments environ 2,0 x 2,0 mm. à l’aide forceps, recueillir les fragments dans un tube conique 15 mL contenant du tampon d’incubation EDTA (Ca2 +/Mg2 +-libres SPD, 5 mM EDTA) et incuber à 4 ° C pendant 2 h avec agitation douce.</li>
	<li>Sous une hotte stérile, laisser le tube à fond conique et fragments sur la glace pendant environ 5 min. utilisent une pipette pour enlever autant tampon d’incubation que possible, laissant des fragments intact. Ajouter 5 mL de secouer le tampon (1 g D-Sorbitol, saccharose 1,47 g dans 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libre SPD) et agiter à la main avec une force de 2 min. laisser les grands fragments de s’installer et avec précipitation, à l’aide d’une pipette de 1000P, enlever les petits fragments qui restent à régler dans la couche supérieure.</li>
	<li>Faites tourner les fragments enlevés pendant 5 min à 4 ° C à 65 x g.</li>
	<li>Tout en évitant les bulles d’air, retirer le surnageant, resuspendre dans la matrice de la membrane basale et mélanger jusqu'à ce qu’elle soit homogène.</li>
	<li>Utiliser une pipette de pointe large pour la matrice de la membrane basale à 50 µL / puits de la plaque et puis incuber à 37 ° C pendant 20 min.</li>
	<li>Ajouter suffisamment milieux de croissance mFGO (Advanced Dulbecco modification Eagle moyen/F12 additionné à 2mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine, 10 mM un tampon HEPES, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, moyen de Wnt-conditionné 50 %, 20 % R-spondin-conditionné un milieu additionné de 100 inhibiteur de protéine morphogénétique osseuse ng/mL, 10 nM gastrine, 50 ng/mL de facteur de croissance épidermique, facteur de croissance fibroblastique 10 ng/mL 10 et inhibiteur de Y-27632 ROCK 10 µM) pour submerger la bulle.</li>
	<li>La culture des cellules à 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de2 cellules humidifié. Modifier les médias tous les 4-5 jours.</li>
</ol>3. collagène revêtement pour transfert 2D
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans une hotte de vitroplants stérile sauf indication contraire. Commencer le collagène revêtement 24h avant le transfert du organoïdes 3D à la monocouche. Garder le collagène de queue de rat sur la glace et protégés de la lumière. Plaques de collagène enduit sont bonnes pendant 2 semaines. Si ne pas immédiatement d’utiliser les plaques revêtues, enrouler la plaque parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
<ol><li>Diluer le collagène de queue de rat à 50 µg/mL à l’aide de l’acide acétique 20 mM.</li>
	<li>Suffisamment compte de la surface du puits avec collagène dilué. Pour un puits dans une plaque de 12 puits standard, enduisez d’environ 1 mL de collagène. Laisser une nuit à température ambiante dans une hotte stérile.</li>
	<li>Laver deux fois avec 1 mL Ca2 +/Mg2 +-libre SPD / puits et laisser à découvert pendant 2 h à température ambiante dans une hotte stérile.</li>
</ol>4. Membrane basale matrice revêtement pour transfert 2D
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans une hotte de vitroplants stérile sauf indication contraire. Commencer la matrice de la membrane basale revêtement 2 h avant de les transférer organoïdes 3D à la monocouche. Garder la matrice de la membrane basale sur glace. Plaques de revêtement doivent être utilisés immédiatement et ne peuvent être stockés pendant une période prolongée de temps.
<ol><li>Diluer la matrice de la membrane basale dans un tube conique de 15 mL avec une eau de qualité de culture cellulaire à un 01:10 ratio. Diluer sur la glace.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette ajouter 100 µL de matrice de membrane de sous-sol dilué dans chaque puits d’une plaque de 12 puits standard. À l’aide d’un grattoir de cellules, répartir uniformément la matrice dilué membrane basale dans le puits pour une couche uniforme.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C pendant 1 h.</li>
	<li>Enlever l’eau résiduelle à l’aide d’une pipette et sécher à température ambiante pendant 1 h avant le transfert du organoïdes 3D.</li>
</ol>5. transfert de m/hFGOs 3D à 2D monocouches de cellules épithéliales gastriques
<ol><li>Après 3D souris - ou anthropique FGOs ont été cultivées pendant 6 à 7 jours, commencer le transfert d’organoïdes 3D à la 2D monocouche. NOTE : Pour chaque puits d’une monocouche requise, il est recommandé d’utiliser 300 organoïdes intacts ou cellules individuelles provenant de 300 organoïdes. Dans une solide culture, il est prévu d’obtenir environ 150 organoïde/puits dans une plaque de culture bien 12.</li>
	<li>Assurez-vous que les plaques sont enduites avant le transfert. Remarque : Les plaques de matrice enduite de membrane basale ont une couche de gel translucide, cependant, plaques de collagène enduit n’aura pas une indication évidente de l’enduit.</li>
	<li>Déloger la bulle de matrice 3D membrane basale de la plaque en pipettant également, directement 1 mL stérile Ca2 +/Mg2 +-libre SPD sur le centre de la bulle.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette, prélever le mélange de matrix et organoïde membrane basale dans cell culture tubes à essai. Recueillir à un ratio de 2 bulles de matrice de membrane basale par tube. Centrifuger pendant 5 min à 40 x g et 4 ° C.</li>
	<li>À l’aide d’un système de vide, retirez le surnageant et comme beaucoup matrice de membrane basale que possible. Resuspendre dans 4 mL de Ca2 +/Mg2 +-libérer SPD, éliminer le surnageant et répéter 2 - 3 fois. Pour le protocole de transfert organoïde ensemble, passez à l’étape 5.10. Passez à l’étape 5,7 pour le protocole de suspension monocellulaire.</li>
	<li>Réchauffez la solution détachement cellulaire à 37 ° C et ajouter 1 mL dans chaque tube à essai. Mélanger doucement en retournant les tubes ou pipetage de haut en bas avec une pipette. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de Ca2 +/Mg2 +-libre SPD directement dans chaque éprouvette.</li>
	<li>Utiliser une aiguille 26 G et injecter le mélange 2 ou 3 fois. Examinez-le pour les cellules individuelles. Seringue de 1-2 fois plus s’il y a toujours des organoïdes ou des amas de cellules.</li>
	<li>Centrifuger à 40 x g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans média FGO 2D (milieu de croissance FGO souris 2D : milieu de moyenne/F12 Eagle modifié de Dulbecco Advanced additionné de 2mM de L-glutamine, 10 mM la pénicilline/streptomycine, 10 % de sérum de veau foetal, 10 mM un tampon HEPES, 1 x N2, 1 x B27, additionné de 10 gastrine nM, 50 ng/mL de facteur de croissance épidermique, inhibiteur de TGF-β 1 µM et 10 µM Y-27632 ROCK inhibiteur. 2D milieu humain FGO : Milieu de moyenne/F12 Eagle modifié de Dulbecco avancée additionné de 2mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine, 10 mM un tampon HEPES, 10 % de sérum de veau foetal, 10 mM, Nicotinamide, 1 x N2, 1 x B27, additionné de 50 mg/mL, kanamycine, 50 ng/mL de croissance épidermique Facteur et 10 µM Y-27632 ROCK inhibiteur, 1µm TGF-β inhibiteur).</li>
	<li>La remise en suspension sur des plaques de revêtement de la plaque. Incuber les plaques à 37 ° C. Remplacer le support tous les 4 jours ou plus tôt si les médias se colore en jaune. Monocouche nécessite environ 4 jours à se former.</li>
</ol>6. Si vous grattez aide monocouches de cellules épithéliales gastriques 2D sur des plaies
<ol><li>À l’aide d’une lame de rasoir, gratter la couche lorsque la culture a atteint 100 % confluence.</li>
	<li>Difficulté monocouches utilisant 3,7 % de formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante. Permeabilize avec 0,5 % de détergent non ionique/PBS pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Bloquer ensuite monocouches avec sérum âne 2 % pendant 1 h à température ambiante et incuber avec dilution de 1/1000 de H+, K+-ATPase anticorps primaire pendant la nuit à 4 ° C, laver avec 0,1 % de détergent non ionique/PBS et incuber avec dilution au 1/100 d’âne anticorps secondaire anti-souris 488 et 10 μg/mL de noyaux de cellules de Hoechst tachent pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Pour identifier les cellules de surface fosse muqueuses dans les cultures 2D anthropique gastrique monocouche, tacher les cellules avec 20 μg/ml de conjugué FITC Ulex europaeus (UEAI). Monocouches d’image sur un microscope confocal.</li>
	<li>Prendre des photos de plaie chaque h. quelques rayures seront ré-epithelialize entre 24 à 48 h selon la qualité de la monocouche et la variation entre les patients.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole actuel détaille la mise en place de monocouches gastrique épithéliales-anthropique et souris qui peut être utilisé pour des dosages de zéro-plaie. Le protocole repose sur le concept des tissus d’isolement primaire humain (ou souris) résident de cellules souches et est un protocole modifié publié par Schlaermann et al.7. En particulier, nous avons optimisé le protocole ici pour établir un confluent et polarisé gastrique monocouche épithélial qui exprime les grandes cellules li...

L’utilisation des dosages de zéro-plaie est une méthode populaire pour étudier la réparation et la régénération1,2,3,4,5,6. La méthodologie proposée peut servir à étudier spécifiquement la régénération gastrique et la colonisation de l’Helicobacter pylori . Dans le passé, lignées cellulaires de cancer de l’estomac ont été utilisées comme un moyen d’étudier l' Helicobacter pylori (H. pylori) infection1,2 et jusqu'à cancer gastrique récemment lignées cellulaires comme les cellules AGS étaient favorisés1 ,2,3,4. Une des limites des cultures de cellules de cancer gastrique est leur incapacité à récapituler la diversité cellulaire de l’épithélium gastrique. Pour tenter de combler cette lacune, démontré qu'ici, c’est la création et le transfert de primaire-origine humaine et souris 3-dimensional fundus gastrique organoïdes (FGOs) à une monocouche épithéliale gastrique pour blessure des dosages guérison basée sur une méthode modifiée tout d’abord décrite par Schlaermann et al. 7 nous démontrons que des monocouches épithéliales gastriques dérivés cisaillement 3D FGOs gastriques ou FGO-dérivés des cellules individuelles conservent une composition cellulaire polarisée qui représente fidèlement celle de l’épithélium gastrique in vivo. Étant donné que les lignées cellulaires de cancer de l’estomac ne démontrent pas la composition de la cellule qu'affiche cette technique, le protocole actuel a un avantage sur les méthodes alternatives zéro-plaie. Cette méthodologie a été optimisée par lequel monocouches peuvent être établie à partir d’organoïdes entier ou d’une suspension monocellulaire d’organoïdes dissocié et plaqué à l’aide d’une matrice de la membrane basale ou collagène-revêtement. L’objectif général du présent protocole est d’établir qu'un organoïde provenant des cultures monocouches épithéliales gastriques pour un dosage de guérison de blessure de roman.

<table><tbody><tr><td>Milieu avancé Dulbecco’s modifié Eagle/F12 (milieu basal)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-glutamine)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B/Gentamicine</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>n-Acétylcystine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de BMP (Noggin)</td><td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Inhibiteur de ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta ; Inhibiteur</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+ -sans DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22&micro ; Filtre M</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C Bain-marie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type 1</td><td>Worthington&nbsp ;</td><td></td><td></td>LS004214</tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (papier de soie)</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td>Fischer Scientific</tr><tr><td>125 mL flacon à fond</td><td></td><td></td><td></td>rond</tr> 1 <tr><td>po (25 mm) barre</td><td></td><td></td><td></td>d’agitation</tr><tr><td>Septa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>en caoutchouc Gaze stérile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>Pétri</td><td></td><td></td><td></td>stérile</tr><tr><td>Aiguilles de 18 g de 1,5 po de longueur</td><td>Thermo Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20 G Aiguilles rachidiennes de 3,5 po de longueur</td><td>Thermo Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>12 puits</td><td>Midwest Scientific</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance réduit, sans rouge de phénol MatrigelTM (Matrice de membrane basale)</td><td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir stériles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td></td><td></td><td></td>à pointe large</tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td>hémostatique incurvée</tr><tr><td>200 &micro ; L pointes de pipette larges</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubes à essai de culture cellulaire</td><td>Fisher</td><td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir d’oxygène avec tuyau</td><td></td><td></td><td></td>en caoutchouc</tr><tr><td>1 g D-Sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td>de</tr><tr><td>dissection Plateau</td> <td>de dissection</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table</td><td></td><td></td><td></td>à bascule</tr><tr><td>Queue de rat Collagène Type 1</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial de qualité culture cellulaire</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Lame de chambre à 2 puits</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>12 puits Transwell (inserts à membrane polyester)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Racleur</td> cellulaire <td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (solution de détachement cellulaire)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>263/8 Seringue G</td><td>Thermo Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr>Lame <td></td><td></td><td></td><td>de rasoir</td></tr><tr><td>L Cellules</td><td>Les cellules L, une lignée cellulaire productrice de Wnt3a, ont été reçues en cadeau du Dr Hans Clevers (Institut Hubrecht pour la biologie du développement et la recherche sur les cellules souches, Pays-Bas). &nbsp ;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T Cellules sécrétant de la rsrépondine</td><td>Une lignée cellulaire modifiée de la R-spondine HEK-293T a été obtenue auprès du Dr Jeff Whitsett (Section de néonatologie, de biologie périnatale et pulmonaire, Centre médical de l’hôpital pour enfants de Cincinnati et Collège de médecine de l’Université de Cincinnati, Cincinnati, États-Unis). &nbsp ; &nbsp ;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATPase Anticorps primaire</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherinn</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488 Anticorps secondaire (Âne anti-souris 488 Anticorps secondaire)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

souris - et anthropique de culture monocouche épithéliales gastriques primaire pour l’étude de la régénération

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Des études in vitro de cicatrisation gastrique implique généralement l’utilisation de lignées cellulaires de cancer de l’estomac lors d’un essai de zéro-plaie de la prolifération cellulaire et migration. Une restriction critique de ces tests, cependant, est leur assortiment homogène des types cellulaires. La réparation est un processus complexe qui exige de l’interaction de plusieurs types de cellules. Par conséquent, afin d’étudier une culture dépourvue de sous-types cellulaires, est une préoccupation qui doit être surmontée si l'on veut comprendre le processus de réparation. Le modèle organoïde gastrique peut atténuer ce problème, auquel cas la collection hétérogène de types cellulaires reflète fidèlement celle de l’épithélium gastrique ou d’autres tissus natifs in vivo. Montré ici est un roman, un essai in vitro zéro-plaie avec dérivée de l’homme ou la souris organoïdes 3 dimensions qui peuvent ensuite être transférées à une monocouche épithélium gastrique soit organoïdes intact ou comme une suspension monocellulaire de dissocié organoïdes. L’objectif du protocole est d’établir des monocouches gastriques épithéliales dérivées organoïde qui peuvent être utilisés dans un système nouveau dosage zéro-plaie pour étudier la régénération gastrique.

Organoïdes provenaient de corpus/corps de l’homme ou du fond de œil des tissus souris estomac (Figure 1 a). Après digestion d’EDTA de dérivés de l’homme ou de la souris le tissu stomacal ou collagénase respectivement, glandes sont incorporés dans la matrice de la membrane basale et cultivées pendant 6 à 7 jours (Figure 1 a). Figure 1 b montre la formation d’origine humaine gastrique organoïdes (huFGO...

Nous décrivons ici un protocole pour l’établissement et la mise en culture-anthropique et souris 3 Dimensions (3D) organoïdes gastrique et la méthode de transfert d’organoïdes 3D à une monocouche 2 dimensions. L’utilisation de la couche épithéliale gastrique comme un nouveau dosage zéro-plaie pour études de régénération est également décrite.

Souris - et anthropique de Culture monocouche épithéliales gastriques primaire pour l’étude de la régénération

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

L’objectif global de ce système de culture est de générer une monocouche gastrique primaire de souris ou d’origine humaine pour l’étude de la régénération dans un essai de cicatrisation des plaies. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine gastrique, telles que le mécanisme de régénération des cellules épithéliales gastriques en réponse à une lésion. Le principal avantage de cette technique est d’abord l’étude de la migration et de la régénération cellulaires dans un test de cicatrisation des plaies, généré à partir de cellules gastriques primaires de souris ou dérivées de l’homme, et de deuxième génération d’organoïdes gastriques dérivés de l’homme pour des expériences à grande échelle.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la régénération de l’épithélium gastrique, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que l’infection à Helicobacter pylori et les co-cultures de cellules immunitaires épithéliales. La démonstration de la procédure sera assurée par Emma Teal, une étudiante diplômée de mon laboratoire. Pour commencer, recueillez le tissu préparé dans un grand récipient en plastique rempli de DPBS sans calcium et magnésium.Laissez le récipient en plastique sur de la glace jusqu’à utilisation. Ensuite, à l’aide d’une pince, lavez vigoureusement le tissu dans un bécher stérile contenant 100 millilitres de DPBS sans calcium et magnésium pendant environ 30 secondes. Utilisez ensuite une gaze stérile pour essuyer la couche de mucus de l’épithélium.Ensuite, utilisez de grandes pinces pour maintenir fermement la couche musculaire du tissu, puis utilisez de grandes pinces hémostatiques incurvées et grattez l’épithélium avec force. Conservez l’épithélium gratté dans une boîte de Pétri en polystyrène steril. Pour optimiser la digestion des tissus, coupez le tissu épithélial en fragments.Ensuite, lavez le tissu avec du DPBS sans calcium et magnésium complété par des antibiotiques. Lavez plusieurs fois pour enlever le sang. Jetez le linge dans un bécher à déchets.Ensuite, recueillez les fragments épithéliaux lavés dans une fiole en verre à fond rond de 125 millilitres avec une barre d’agitation de 25 millimètres et un milieu d’incubation préchauffé. Après avoir recueilli les fragments de tissu, scellez le ballon à fond rond avec un septa. Ensuite, utilisez des pinces pour fixer la configuration à un support d’anneau.Insérez ensuite une aiguille spinale de calibre 20 dans les septa. Connectez les septa à une bouteille d’oxygène avec un tuyau en caoutchouc. Insérez 10 à 15 aiguilles de sortie dans le septa pour éviter sa rupture, l’interrupteur sur le flux sortant d’oxygène à basse température.Après cela, calibrez le bain-marie à 37 degrés Celsius sur une plaque d’agitation pendant 30 à 45 minutes. Une fois calibré, placez l’installation dans le bain-marie. Après 15 minutes d’incubation, vérifiez la présence de glandes dissociées.Après le temps d’incubation souhaité, ajoutez 15 millilitres de DMEMF12 préchauffé dans le milieu d’incubation à l’aide d’une pipette sérologique. Ensuite, filtrez le mélange de glandes obtenu à travers une gaze stérile dans quatre tubes coniques de 15 millilitres. Ensuite, incubez le filtrat sur de la glace pendant 15 minutes.Cela permettra à la glande de se déposer au fond du tube conique. À l’aide d’une pipette sérologique, j’ai déversé 40 millilitres de surnageant par le haut de la suspension de la glande. Remettez en suspension les 10 millilitres restants du mélange glad dans 10 millilitres de DPBS complétés par des antibiotiques.Répartissez ensuite le tout le mélange dans des tubes à essai de culture cellulaire de cinq millilitres. Centrifugez les tubes à 65 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant.Dissoudre la pastille glandulaire obtenue avec la matrice de membrane basale pensée à l’aide d’une large pointe de pipette de 200 microlitres. Mélangez la suspension jusqu’à ce qu’elle soit homogène. Ensuite, plaquez les glandes dans 15 microlitres de la matrice de la membrane basale à l’aide d’une pipette à pointe large.Pour que la matrice de la membrane basale polymérise, incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu hFGO dans chaque puits s’il est cultivé dans une plaque de culture à 12 puits. Ensuite, cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire humidifié.Changez de support tous les 45 jours. Après six à sept jours de culture FGO 3D dérivée de souris ou d’homme, commencez à transférer les organoïdes 3D sur la monocouche 2D. Pour ce faire, ajoutez un millilitre de DPBS sans calcium et magnésium au centre de la bulle pour déloger la bulle de la membrane basale 3D de la plaque.Ensuite, collectez la matrice de la membrane basale et le mélange d’organoïdes dans le tube de culture cellulaire. Ensuite, centrifugez à 40 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, utilisez un système de vide pour éliminer le surnageant et autant de matrice de membrane basale que possible.Ensuite, dissolvez la pastille dans quatre millilitres de DPBS sans calcium et magnésium. Assurez-vous d’enlever autant que possible la matrice du socle après avoir récolté les organoïdes en préparation de la monocouche. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de détachement de cellules préchauffée à 37 degrés Celsius dans chaque tube à essai.Mélangez ensuite le contenu du tube en le retournant plusieurs fois. Enfin, incubez le tube à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour obtenir une suspension à cellule unique, ajoutez les deux millilitres de DPBS sans calcium et magnésium directement dans chacun des tubes à essai.Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 26 pour mélanger la suspension deux à trois fois. Après le mélange, centrifugez la suspension cellulaire, puis dissolvez la pastille cellulaire dans un milieu FGO 2D. Pour obtenir l’organoïde entier, plaquez la suspension cellulaire sur des plaques revêtues.Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant environ quatre jours. Changez de support si la couleur devient jaune. Dès que la culture atteint 100 % de confluence, grattez la monocouche à l’aide d’une lame de rasoir.Fixez ensuite les monocouches à l’aide de 3,7 % de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, perméabilisez les monocouches avec du Triton X-100 pendant 20 minutes à température ambiante. Après la perméablation, bloquez les monocouches avec deux pour cent de sérum d’âne pendant une heure.Après une heure de blocage, incubez la monocouche avec une solution d’anticorps primaires à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Enveloppez la monocouche dans du parafilm pour éviter l’évaporation et le dessèchement de la culture pendant la nuit. Le lendemain, lavez avec 0,1 % de détergent non ionique dans du PBS.Ensuite, incubez avec l’anticorps secondaire et 10 microgrammes par millilitre de coloration des noyaux de la cellule hôte pendant une heure à température ambiante. Ensuite, colorez les cellules. Ensuite, identifiez les cellules muqueuses de surface dans la culture monocouche gastrique 2D dérivée de l’homme au microscope confocal.Enfin, capturez des images de la plaie toutes les quelques heures. Ces images issues de l’analyse en accéléré montrent la formation d’OGG humains. Ces organoïdes sont transférés dans une monocouche épithéliale gastrique sur des lames de chambre codées à la matrice de la membrane basale.La monocouche épithéliale gastrale est analysée toutes les huit heures pendant une journée. L’image montre que la zone de la plaie ne cesse de diminuer et disparaît complètement dans la culture en une seule journée. Cette coloration par fluorescence immunologique montre la présence d’une monocouche positive à l’E-cadhérine qui se compose des cellules muqueuses de surface.Cela indique la régénération de la monocouche épithéliale gastrique. Les noyaux présents sont colorés au hoechst. Ensuite, l’analyse RTPCR est effectuée à l’aide d’ARN extrait de la monocouche épithéliale gastrique humaine pour confirmer l’expression des cellules muqueuses de la surface pariétale, du chef et du mucus du cou.La présence d’ATPa et de PgC montre la présence de cellules pariétales et principales respectivement. La présence de MUC5AC et MUC6 montre la présence de cellules muqueuses de surface et de cellules muqueuses du cou, respectivement. Dans cette image de fluorescence immunitaire, la prolifération des cellules dans la culture monocouche épithéliale gastrique humaine est montrée par l’absorption immédiate d’EdU.Ces images de fluorescence immunitaire montrent la régénération de l’épithélium gastrique et l’expression des cellules muqueuses et pariétales de surface à zéro, huit, 16 et 24 heures après la blessure par égratignure. Une fois maîtrisé, le transfert 3D vers 2D peut être effectué en une heure s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de laver autant de matrice de membrane basale que possible des organoïdes récoltés avant le transfert 2D.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’infection à Helicobacter pylori dans les monocouches et les co-cultures de cellules immunitaires monocouches peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les interactions hôte-pathogène. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la gastro-entérologie pour explorer les maladies et la régénération de l’estomac. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la technique stérile et les mesures de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Souris - et anthropique de Culture monocouche épithéliales gastriques primaire pour l’étude de la régénération

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