Balayage automatique pour lames et Segmentation en tissus fluorescent marqué à l’aide d’un système d’analyse Widefield haute teneur
3 mai 2018
Nous décrivons ici un protocole pour la segmentation automatique des tissus fluorescent étiquetés sur les diapositives à l’aide d’un système d’analyse de haute teneur widefield (WHCAS). Ce protocole a de nombreuses applications dans n’importe quel domaine qui implique la quantification de marqueurs fluorescents dans les tissus biologiques, y compris les sciences biologiques, ingénierie médicale et sciences de la santé.
L’objectif global de cette méthode d’imagerie et d’analyse est de générer un flux de travail facile à configurer pour la segmentation automatique de tout échantillon de tissu monté sur lame marqué par fluorescence. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des sciences biologiques sur la quantité d’une protéine donnée trouvée dans une zone spécifique d’un échantillon de tissu d’intérêt. Les principaux avantages de cette technique sont qu’il est possible d’économiser du temps et d’économiser des protocoles d’optimisation de la segmentation automatisée, ce qui permet d’appliquer cette méthode à des échantillons de tissus ultérieurs montés sur lames marqués par fluorescence.
Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons eu besoin de quantifier de nouvelles cellules dans le tissu cérébral à un fort grossissement. Après avoir importé les journaux, ouvrez la boîte de dialogue Configuration de l’acquisition de plaques, puis ouvrez l’onglet Objectif et caméra. Réglez le grossissement sur quatre fois, le binning de l’appareil photo sur un et le gain sur deux.
Ouvrez l’onglet Balayage des lames de plaque et saisissez les paramètres expérimentaux appropriés. Sous l’onglet Sites à visiter, remplissez les puits uniformément avec les sites et ouvrez l’onglet Modifier les paramètres de fond de plaque pour entrer les valeurs expérimentales appropriées. Après avoir enregistré ces paramètres en tant que réglage A, ouvrez l’onglet Objectif et appareil photo et réglez le grossissement sur 40 fois, le regroupement de l’appareil photo sur un et le gain sur deux.
Vérifiez que tous les paramètres des onglets Balayage des lames de plaque et Modifier les paramètres de fond de plaque sont les mêmes que ceux entrés pour le réglage A. Ouvrez l’onglet Boucle d’acquisition. Entrez le nombre de longueurs d’onde présentes dans l’échantillon et cochez les options Activer la mise au point basée sur le laser et Activer la mise au point basée sur l’image. Enregistrez ensuite ces paramètres en tant que réglage B.Ensuite, placez jusqu’à trois diapositives, la lamelle de recouvrement vers le bas avec l’étiquette sur le côté de l’encoche dans l’adaptateur de glissière.
Et appuyez sur F4 pour ouvrir le menu principal. Sélectionnez Balayage de diapositives et cliquez sur Ouvrir la porte pour éjecter la glissière pour insérer l’adaptateur de diapositive dans le système d’analyse à haut contenu à champ large. Cliquez ensuite sur Fermer la glissière de chargement de la porte.
Pour commencer, assurez-vous que la longueur d’onde appropriée est sélectionnée. Déplacez-vous vers différents sites dans l’image en direct jusqu’à ce que la région d’intérêt soit localisée. Focus sur la région.
S’il n’est pas net, utilisez le bouton Autofocus ou ajustez la taille du pas jusqu’à ce qu’il le soit. Utilisez Snap pour capturer l’image, si vous ajustez manuellement la mise au point en modifiant la taille du pas. Pour configurer une analyse précédente, chargez d’abord le paramètre A et sélectionnez Aperçu des diapositives.
Indiquez le nombre de diapositives et sélectionnez OK. Choisissez quatre fois le grossissement. Sélectionnez ensuite Coverslip down et continuez à sélectionner vos paramètres de base pour la numérisation précédente. Assurez-vous que les paramètres d’acquisition et les étalonnages sont vérifiés avant de sélectionner Annuler et d’appuyer sur Continuer.
Sous l’onglet W1 :DAPI, cliquez sur En direct, puis sur Exposition automatique, puis sur Snap. Après cela, appuyez sur Fermer. Sélectionnez le répertoire et entrez un nom d’analyse précédent.
La boîte de dialogue Dessiner la région s’affiche automatiquement. Utilisez l’outil de région rectangulaire pour sélectionner l’ensemble de la zone de numérisation précédente et cliquez sur Continuer. À la fin de l’analyse précédente, chargez le paramètre B et ouvrez l’onglet Sites à visiter.
Pour commencer, assurez-vous que la longueur d’onde appropriée est sélectionnée. Déplacez-vous vers différents sites dans l’image en direct jusqu’à ce que la région d’intérêt soit localisée. Focus sur la région.
S’il n’est pas net, utilisez le bouton Autofocus ou ajustez la taille du pas jusqu’à ce qu’il le soit. Utilisez Snap pour capturer l’image, si vous ajustez manuellement la mise au point en modifiant la taille du pas. Ensuite, sous l’onglet DAPI W1, cliquez sur Exposition automatique et vérifiez que l’image DAPI Plate Acquisitions Snap est nette.
Dans le menu principal, cliquez sur Journal et sélectionnez Exécuter le journal dans le menu déroulant. Double-cliquez sur le journal de configuration de l’acquisition de la zone de diapositive pour le lancer et cliquez sur Continuer lorsque la boîte de dialogue Acquisition de la zone de configuration de la diapositive s’affiche. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez l’analyse DAPI pour sélectionner l’image de la diapositive à faible grossissement, puis cliquez sur OK. Lorsque vous êtes invité à indiquer le Snap d’acquisition de plaque, mettez en surbrillance le Snap d’acquisition de plaque-DAPI et cliquez sur OK. Lorsque la zone Créer ou charger des régions s’affiche, utilisez l’outil Région rectangulaire pour sélectionner les régions d’intérêt dans l’analyse DAPI, puis cliquez sur Continuer.
À l’aide de l’outil de localisation, mettez en surbrillance la région qui vous intéresse et cliquez sur Continuer, dans la boîte de dialogue Sélectionner une région. Lorsque la boîte de dialogue Confirmer les régions s’affiche, cliquez sur Continuer et décidez si la région doit être enregistrée lorsque la boîte de dialogue Enregistrer les régions s’affiche. Trois boîtes de dialogue apparaîtront.
Cliquez sur Continuer pour fermer la case Configuration terminée. Pour éviter toute approximation de recherche de site d’échantillonnage, assurez-vous que l’option Afficher les images lors de l’acquisition sous l’onglet Paramètres d’affichage est cochée et ouvrez l’onglet Résumé pour cliquer sur Acquérir la plaque pour positionner l’étage de la région d’intérêt présélectionnée. Lorsque la caméra effectue un panoramique sur un site contenant les cellules d’intérêt, cliquez sur Annuler pour arrêter l’acquisition de l’image.
Ne vous inquiétez pas si l’image est floue. Cette étape consiste uniquement à positionner l’étape du premier site dans la région d’intérêt que vous avez sélectionnée. Vérifiez que l’étape se trouve au-dessus de l’échantillon et que vous avez correctement entré le nombre de sites.
Optimisez les paramètres de longueur d’onde pour vous assurer que la mise au point dans une image à plage dynamique élevée est obtenue. Ensuite, ouvrez à nouveau l’onglet Résumé, puis cliquez sur Acquérir la plaque. À la fin de l’analyse, sélectionnez l’onglet Affichage.
Dans le menu déroulant Superposition d’images, sélectionnez Afficher les informations sur le puits pour afficher les numéros de site dans le coin supérieur gauche. Faites défiler les sites et excluez tous les sites qui sont hors foyer et/ou qui contiennent des plis tissulaires ou des bulles et des déchirures dans les tissus. Dans cette image représentative, des vignettes à fort grossissement de tous les sites dans la région d’intérêt définie sont affichées.
Chaque site devrait être examiné afin de déterminer ceux qui devraient être exclus de l’analyse. Par exemple, dans cette expérience, le site 149 était hors foyer, le site 219 avait des bulles et le site 54 contenait un pli. Ces trois sites ont été exclus de l’analyse.
Ici, les superpositions correspondantes générées par le module de notation de cellules multi-longueurs d’onde démontrent les résultats de la segmentation automatisée effectuée sur le site 59 tels que personnalisés selon les spécifications expérimentales. Suite à la segmentation, les données quantitatives de la proportion de cellules colorées positives pour chaque marqueur, les deux marqueurs, l’absence de marqueurs, la surface colorée moyenne et l’intensité moyenne de fluorescence peuvent être obtenues. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la configuration de votre système d’analyse à haut contenu à champ large pour créer un flux de travail automatisé pour l’imagerie et la segmentation d’un échantillon de tissu monté sur lame.
Aperçu
Cet article présente un protocole pour la segmentation automatisée de tissus marqués par fluorescence à l'aide d'un système d'analyse automatisée à large champ (WHCAS). Cette méthode simplifie la quantification de marqueurs fluorescents dans des tissus biologiques, ce qui profite à divers domaines, notamment les sciences biologiques et le génie médical.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Sciences biologiques
- Génie médical
- Sciences de la santé
Contexte
- La segmentation automatisée améliore l'analyse des tissus marqués par fluorescence.
- Les systèmes d'analyse à haut contenu facilitent l'imagerie détaillée des échantillons biologiques.
- La quantification des protéines dans les échantillons de tissus est essentielle pour comprendre les processus biologiques.
- Cette méthode a été développée pour répondre aux défis liés à la quantification des nouvelles cellules dans le tissu cérébral.
Objectif de l'étude
- Créer un flux de travail efficace pour la segmentation automatique des échantillons de tissus.
- Améliorer la précision et la rapidité de la quantification des marqueurs fluorescents.
- Fournir un protocole standardisé applicable à différents types de tissus.
Méthodes utilisées
- Installation d'un système d'analyse à haut contenu en microscopie grand champ pour l'acquisition d'images.
- Configuration des paramètres expérimentaux pour une imagerie optimale.
- Utilisation d'outils logiciels pour l'acquisition et l'analyse d'images.
- Mise en œuvre de techniques de mise au point automatique et d'ajustement fondées sur l'image.
Résultats principaux
- Une segmentation réussie des tissus marqués par fluorescence a été réalisée.
- L'imagerie à fort grossissement a fourni des vues détaillées des échantillons de tissus.
- Les régions d'intérêt ont été correctement identifiées et analysées.
- Des critères d'exclusion pour les images floues ou endommagées ont été établis.
Conclusions
- Le protocole de segmentation automatisé réduit considérablement le temps d'analyse.
- Cette méthode peut être appliquée à un large éventail de tissus biologiques.
- Des applications futures pourraient améliorer la recherche dans divers domaines scientifiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'analyse automatisée par numérisation de lames et segmentation à l'aide d'un système d'analyse cellulaire à champ large (WHCAS) permet de surmonter l'obstacle que représente la quantification de marqueurs fluorescents sur de grandes sections tissulaires, rendant ainsi possible une analyse reproductible et à haut débit pour la validation de cibles et le développement de tests. En standardisant les protocoles d'acquisition d'images et de segmentation, cette méthode réduit la variabilité et accélère l'évaluation préclinique de biomarqueurs tissulaires, soutenant des décisions fondées sur les données en phase initiale de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant les profils d'expression protéique dans des tissus pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Réduit le temps consacré à l'optimisation des protocoles pour chaque expérience, permettant une application rapide à plusieurs cibles marquées de manière fluorescente.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques grâce à des lectures quantitatives cohérentes de la localisation des marqueurs et des niveaux d'expression.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des criblages ultérieurs en générant des images tissulaires standardisées et segmentées, adaptées à des tests à haut contenu.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à une sélection automatisée des régions et à l'exclusion des sites altérés (par exemple, tissus hors foyer, pliés ou présentant des bulles).
- Extensibilité : Permet la réutilisation de la plateforme sur divers marqueurs et types de tissus grâce à des modules logiciels préexistants dédiés à la localisation protéique, à la prolifération, à la viabilité, à l'apoptose et à l'angiogenèse.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Assure une cohérence constante du stade de découverte à celui de la validation préclinique en fournissant des données quantitatives sur les proportions de cellules positives pour les marqueurs, la surface moyenne colorée et l'intensité de fluorescence.
- Progression ajustée au risque : Soutient la prise de décision en phase préclinique en fournissant des jeux de données fiables, filtrés par exclusion, reflétant un signal biologique réel.
- Système pertinent pour la maladie : Applicabilité démontrée dans l'analyse de tissus de tumeurs cérébrales, avec possibilité d'extension à tout marqueur nucléaire ou cytoplasmique marqué par fluorescence sur des échantillons montés sur lame.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la phase de découverte précoce jusqu'à l'identification de candidats puis à la recherche préclinique, permettant une analyse tissulaire standardisée à chaque étape.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en quantifiant l'expression des marqueurs dans des régions tissulaires spécifiques d'intérêt.
- Triage : Assure la préparation des tests grâce à une segmentation automatisée et à des résultats quantitatifs permettant une évaluation fiable des composés sur différents sites.
- Analyse : Produit des mesures objectives telles que la proportion de cellules positives, la surface moyenne marquée et l'intensité moyenne de fluorescence, permettant des comparaisons entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en fournissant des données tissulaires quantitatives alignées sur des biomarqueurs, adaptées aux études de validation.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité réutilisable dans divers projets, en exploitant des modules logiciels préexistants et des paramètres sauvegardés (paramètres A et B) pour un balayage de lames et une segmentation cohérents.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique dans les tests basés sur les tissus.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité des flux de travail d'imagerie et d'analyse des tissus.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital grâce à une réduction du temps d'optimisation des protocoles, et risque biologique moindre en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation et prise de décisions d'avancement ajustées au risque, fondées sur des données tissulaires quantitatives validées par exclusion.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans l'utilisation des systèmes d'analyse en imagerie à grand champ et à haut contenu, ainsi que dans la navigation des logiciels associés.
- Dépend d'un instrument capable de numériser des lames, d'acquérir des signaux à plusieurs longueurs d'onde, et de réaliser une mise au point basée sur laser et sur image.
- Implique une standardisation entre équipes des paramètres d'acquisition (par exemple, grossissement, binning, gain) et des protocoles de définition des régions d'intérêt.
- Requiert des adaptations lors de l'application de la méthode à différents types de tissus, expressions de marqueurs ou épaisseurs de lames.
- Comprend des limites pratiques, telles que la nécessité d'exclure manuellement les sites présentant des artefacts (par exemple, images floues, plis du tissu, bulles), malgré une acquisition automatisée.
