Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes In Situ la technologie de détection

L’objectif global de ce nouveau test d’hybridation in situ de l’ARN est de visualiser des molécules d’ARN uniques dans une zone spécifique du cerveau qui sont essentielles pour clarifier le dysfonctionnement dopaminergique au cours d’une maladie du système nerveux central. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les anomalies dopaminergiques, les réponses comportementales et la modulation de la fonction de la mémoire de travail. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle fournit une nouvelle technique d’hybridation in situ pour étudier le dysfonctionnement du système dopaminergique au cours de la progression des maladies du système nerveux central.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des niveaux d’expression globaux d’un ARNm cible dans une région cérébrale donnée, elle peut également être appliquée pour déterminer comment les transcrits de l’ARNm sont distribués dans les cellules d’une région donnée. Pour commencer cette procédure, dans les cinq minutes suivant le prélèvement d’un cerveau de rat adulte, immergez-le dans de l’azote liquide pendant 15 secondes. Ensuite, équilibrez le cerveau à moins 20 degrés Celsius dans un cryostat pendant une heure.

Au bout d’une heure, coupez des sections de 30 microns contenant le noyau accumbens de 2,76 millimètres à 2,28 millimètres en avant du bregma et montez-les sur les lames. Ensuite, séchez les sections à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, immergez les lames dans du paraformaldéhyde à 4 % pré-refroidi pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Ensuite, placez les lames dans un gradient croissant d’éthanol à température ambiante, puis transférez les lames dans de l’éthanol frais à 100 % pendant cinq minutes supplémentaires. Ensuite, placez les lames sur le papier absorbant pour permettre un séchage à l’air. Tracez une barrière autour de chaque section à l’aide d’un stylo barrière.

Laissez la barrière sécher complètement pendant une minute. Pour prétraiter les sections cérébrales, allumez le four et réglez la température à 40 degrés Celsius. Ajoutez trois gouttes de réactif de prétraitement sur chaque section du cerveau.

Ensuite, incubez les sections pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, immergez les lames dans 1X PBS pendant une minute à température ambiante et transférez les lames dans 1X PBS frais pendant une autre minute. Les diapositives ne doivent pas rester dans 1X PBS pendant plus de 15 minutes.

Pour exécuter le test multiplex, réchauffez la sonde cible pendant 10 minutes à 40 degrés Celsius dans un bain-marie, puis refroidissez-la à température ambiante. Placez le réactif d’ARN à température ambiante. Retirez l’excès de liquide des lames avec du papier absorbant et remettez-les sur le support des diapositives.

Ajoutez ensuite trois gouttes de Drd1alpha comme sonde sur chaque tranche d’échantillon et incubez les échantillons pendant deux heures à 40 degrés Celsius. Ensuite, lavez les lames dans 1X tampon de lavage pendant deux minutes à température ambiante deux fois. Ensuite, retirez l’excès de liquide des lames avec du papier absorbant et remettez-les sur le support des diapositives.

Ne laissez pas les sections du cerveau se dessécher entre les étapes d’incubation. Ajoutez trois gouttes d’AMP 1FL sur chaque tranche d’échantillon et incubez les échantillons pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius. Ensuite, lavez les lames deux fois dans 1 tampon de lavage pendant deux minutes, à chaque fois à température ambiante.

Ensuite, retirez l’excès de liquide des lames avec du papier absorbant et remettez-les sur le support des diapositives. Par la suite, ajoutez trois gouttes d’AMP 2FL sur chaque tranche d’échantillon. Incuber les échantillons pendant 15 minutes à 40 degrés Celsius.

Ensuite, immergez les lames dans 1X tampon de lavage pendant deux minutes à température ambiante deux fois. Retirez l’excès de liquide des lames avec du papier absorbant et remettez-les sur le support des diapositives. Ajoutez trois gouttes d’AMP 3FL sur chaque tranche d’échantillon et incubez les échantillons pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius.

Ensuite, lavez les lames dans 1X tampon de lavage pendant deux minutes à température ambiante deux fois. Retirez l’excès de liquide des lames avec du papier absorbant et remettez-les sur le support des diapositives. Ajoutez ensuite trois gouttes d’AMP 4FL ALT A sur chaque tranche d’échantillon et incubez les échantillons pendant 15 minutes à 40 degrés Celsius.

Lavez la diapositive dans 1X tampon de lavage pendant deux minutes à température ambiante deux fois. Retirez l’excès de liquide des lames et placez immédiatement deux gouttes de réactif de montage sur chaque section. Ensuite, placez une lamelle de 22 millimètres sur 22 millimètres sur chaque section du cerveau.

Rangez ensuite les lames dans l’obscurité à une température de deux à huit degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient sèches. Pour l’imagerie, allumez le microscope confocal et passez à un objectif 60X. Obtenez des images de la pile Z et acquérez des images de cellules marquées Drd1alpha dans la région du noyau accumbens.

Pour les images du noyau accumbens qui présentaient le motif de coloration des points discrets, la plage dynamique d’expression a été évaluée à l’aide d’une analyse semi-quantitative. Chaque cellule a été notée de zéro à neuf en fonction du nombre de points par cellule. Cette méthode de score de signal hybride peut ainsi évaluer l’étendue et la variabilité de l’expression de Drd1alpha dans les cellules individuelles.

Voici les images confocales représentatives de l’expression de Drd1alpha chez les rats mâles et femelles qui ont le motif de coloration des points discrets. Pour tenir compte de la structure de données imbriquées, des valeurs moyennes de comptage ont été calculées pour chaque catégorie et utilisées pour l’analyse statistique. Un test U de Mann-Whitney a été effectué pour évaluer les différences dans le nombre médian de cellules chez les rats mâles et femelles.

La fréquence des cellules de chaque catégorie est analysée à l’aide de la fréquence relative et de la fréquence cumulative. Les animaux femelles ont montré un changement significatif dans la distribution, avec une plus grande fréquence de cellules dans des catégories d’ordre inférieur par rapport aux animaux mâles. Dans l’ensemble, les résultats suggèrent des différences sexuelles claires dans l’expression de Drd1alpha dans le noyau accumbens.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler rapidement, car les changements de température ou le dessèchement des tissus peuvent endommager l’ARNm et entraver notre capacité à obtenir un signal fiable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la technique d’hybridation in situ dans les tissus corticaux, d’imager par fluorescence les transcrits d’ARNm de signal dans des régions cérébrales choisies et de caractériser la distribution des transcrits d’ARNm pour l’analyse statistique.