Évaluation de collagène et élastine Microarchitectures dépendant de la pression dans les artères de résistance vivants, humains en microscopie par Fluorescence Label-free

L’objectif général de cette méthodologie est de fournir une procédure standardisée pour obtenir des images d’artères de résistance humaines vivantes pour l’analyse de la relation entre la microarchitecture de la matrice extracellulaire et la mécanique de la paroi artérielle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie vasculaire et en mécanique, telles que la façon dont la pression induit des changements dans la géométrie globale ainsi que dans la microarchitecture de la paroi vasculaire. Le principal avantage de la technique est que vous n’avez pas besoin d’étiqueter votre échantillon pour l’imagerie.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la mécanique des artères de résistance, une version modifiée du protocole peut être appliquée à d’autres organes ressemblant à des tubes comme les bronches ou à des bandelettes de la vessie humaine ou de la paroi intestinale. Pour commencer, prélevez des échantillons de tissus d’intérêt immédiatement après leur excision pendant la chirurgie et préparez les vaisseaux comme décrit dans le protocole textuel ci-joint. Pressuriser une artère canulée à cinq millimètres de mercure.

Ensuite, configurez le chemin optique pour l’imagerie en activant le laser à deux photons et en réglant la longueur d’onde d’excitation à 820 nanomètres. Insérez un miroir dichroïque passe-long de 460 nanomètres pour répartir la lumière d’émission entre les photomultiplicateurs et collecter l’émission simultanément dans deux canaux. Utilisez des filtres passe-bande de 30 à 60 nanomètres de large centrés à 520 nanomètres pour collecter l’autofluorescence de l’élastine et un autre centré à 410 nanomètres pour collecter le signal de génération de seconde harmonique de collagène.

Réglez maintenant le temps de séjour du laser et le pixel sur 10 microsecondes. Réglez la résolution sur 512 x 512 pixels pour un champ de vision de 100 %. Activez le balayage continu et utilisez une puissance lumineuse et un temps de séjour des pixels aussi faibles que possible pour éviter que la photo n’endommage l’artère en direct.

Ensuite, balayez manuellement l’artère pour trouver le plan avec le diamètre maximum. Ensuite, choisissez une tranche rectangulaire couvrant le diamètre le plus large de l’artère et scannez une seule image avec une taille de pixel de 300 nanomètres par pixel ou moins. Enregistrez cette image pour l’analyser ultérieurement.

Pour déterminer le diamètre de la lumière et l’épaisseur de la paroi au diamètre maximal de l’artère, chargez d’abord l’image aux Fidji. Réglez l’échelle en cliquant sur le menu principal, puis allez dans analyser puis définir l’échelle. Entrez ici le micromètre par pixel et le rapport de pixels.

Ensuite, choisissez l’outil Ligne de Fidji et tracez une ligne entre les deux lames élastiques internes de chaque côté de la lumière artérielle. Cliquez ensuite sur Ctrl M pour indiquer la longueur dans le tableau des résultats. Continuez à tracer d’autres lignes pour mesurer l’épaisseur de chaque paroi et enregistrez la mesure finale.

Passez à un objectif 60X avec une ouverture numérique de un ou plus. Imagez la microarchitecture du collagène et de l’élastine à cinq millimètres de mercure en balayant toute l’épaisseur de la paroi artérielle. Ensuite, définissez la profondeur de début et de fin de la pile Z, ainsi que l’espacement des pas Z et la densité de pixels.

Lorsque vous concevez vos piles Z, assurez-vous que votre région d’intérêt est suffisamment petite pour éviter toute inférence de courbure lors de votre analyse ultérieure. Une fois l’opération terminée, configurez chaque canal pour qu’il soit enregistré séparément. Enfin, trouvez une à trois régions d’intérêt différentes et obtenez des piles d’images 3D de bonne qualité.

Si votre autofluorescence d’élastine blanchit, vous utilisez une puissance lumineuse d’excitation trop élevée. Cela doit être évité. Afin de terminer votre expérience en cours, vous pouvez ajouter une concentration diluée d’éosine pour améliorer l’autofluorescence de l’élastine.

Une fois terminé, répétez l’ensemble du processus à des pressions variant jusqu’à 100 millimètres de mercure, en remplaçant le tampon dans la chambre myographe par un HBS frais à 37 degrés Celsius après chaque pas de pression. Pour commencer l’analyse d’image, ouvrez la pile d’images d’élastine aux Fidji. Ensuite, allez dans l’image, cliquez sur les piles et sélectionnez Projet Z pour choisir les images avec lesquelles travailler et choisissez l’intensité maximale pour le type de projection.

Enregistrez la projection d’intensité maximale en tant qu’image TIFF. Choisissez ensuite autant de points de ramification internes que possible de fibres de laminage élastiques internes et mesurez-les à l’aide de l’outil d’angle. Travaillez systématiquement sur chaque image et, une fois terminé, enregistrez la feuille de résultats des Fidji.

Pour mesurer l’ondulation du collagène adventice, ouvrez la pile d’images de collagène aux Fidji. Ensuite, allez dans l’image jusqu’aux piles et sélectionnez Projet Z pour choisir les images avec lesquelles travailler et pour définir la projection d’intensité maximale. Remplacez maintenant le type d’image par une image TIFF huit bits en cliquant sur image, tapez puis sur huit bits.

Enregistrez la projection d’intensité maximale en tant qu’image TIFF. Ouvrez le plugin Neuron J en cliquant sur Fiji et en sélectionnant Neuron J sous plugins. Ouvrez ensuite le fichier TIFF huit bits dans Neuron J.Une fois ouvert, cliquez sur ajouter des tracés et sélectionnez les fibres à analyser en cliquant sur le début et la fin de chaque fibre.

Ensuite, allez dans Mesurer les tracés et choisissez Afficher les mesures de tracé et de sommet dans la boîte de dialogue. Pour calculer la rectitude de la fibre de collage, copiez d’abord les valeurs de la fenêtre de traçage Fidji dans Excel. Les valeurs de longueur dans la fenêtre de traçage sont des mesures de la longueur totale des fibres de collagène analysées Lf.Deuxièmement, copiez pour chaque faisceau de fibres de collagène analysé les première et dernière coordonnées XY de la fenêtre des sommets Fidji vers Excel.

Calculez ensuite la longueur de la droite reliant chaque extrémité de la fibre de collagène L0 analysée à l’aide du théorème de Pythagore. La rectitude des fibres de collagène est finalement calculée comme L0/Lf. En suivant le protocole qui vient d’être montré, la partie la plus large de l’artère a été identifiée et à ce stade, l’artère a été scannée à l’aide d’une microscopie à fluorescence sans marquage pour mesurer le diamètre maximal du vaisseau et l’épaisseur de la paroi du vaisseau.

En utilisant un grossissement plus élevé à un objectif à grande ouverture numérique, non seulement le diamètre du récipient et l’épaisseur de la paroi peuvent être mesurés, mais également les microarchitectures du collagène et de l’élastine. Les microarchitectures des angles de ramification des fibres d’élastine et de la rectitude du collagène peuvent être déterminées en sections d’images consécutives à l’aide du logiciel d’analyse d’images approprié. Cela permet une analyse directe de la relation entre les changements induits par la pression dans les microarchitectures du collagène et de l’élastine et le module d’élasticité incrémentiel à différentes pressions.

Suite à cette procédure, d’autres informations peuvent également être extraites des images. Il pourrait s’agir des anges d’orientation du collagène adventice le long de l’axe longitudinal du vaisseau ou de la microarchitecture de la matrice extracellulaire dans la tunique moyenne. Les mesures quantitatives extraites des images à l’aide de cette méthode peuvent être intégrées dans des modèles mathématiques afin d’élucider comment la circulation humaine saine et décédée réagit à différentes conditions.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension approfondie de la façon de concevoir vos expériences d’imagerie et l’analyse d’image ultérieure afin d’extraire des informations sur la façon dont la pression induit des changements dans la microarchitecture de la paroi de l’artère de résistance. N’oubliez pas que vous devez éviter toute exposition à la lumière visible et invisible lorsque vous travaillez avec la microscopie à fluorescence à excitation à deux photons.