Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux

Ce message peut aider à répondre à des questions clés dans immunophéotypage dans les modèles Murine, tels que les marqueurs utilisés pour identifier les différentes lignées immunitaires et les stratégies de vieillissement. Le principal avantage de cette technique est que le marqueur et les stategies vieillissantes, lors de l’immunophéotypage, peuvent être appliqués à une variété de modèles murins. Surveillez le poids corporel des souris C57 Black 6 à l’aide d’un équilibre.

En outre, surveillez le volume de tumeur des souris variables de donneur de tumeur par mesure de calibre. Après l’euthanasie de l’animal dans une hotte biohazard selon le protocole, stériliser la peau autour de la tumeur à l’aide d’écouvillons Iodophor. Après l’ablation chirurgicale de la tumeur comme indiqué dans le protocole de texte, placez la tumeur dans une boîte de Pétri contenant 20 millilitres de PBS qui a été pré-refroidi à 4 degrés Celsius.

S’il y a contamination du sang, transférer la tumeur dans une autre boîte de Pétri et laver la tumeur avec PBS. Couper la tumeur en deux. Enlevez toute peau supplémentaire, les vaisseaux, la calcification et la nécrose.

Choisissez seulement des morceaux intacts de tumeur et placez-les dans un tube stérile de centrifugeuse de 50 millilitres. Ajouter 20 millilitres de PBS avant de transporter le tube dans une pièce séparée pour les études en pharmacologie. Pour se préparer à l’implantation orthotopique, fixez une souris entièrement anesthésiée sur un tableau d’expérimentation en position latérale droite.

Désinfecter la peau autour de la rate avec de l’idodine, puis dés’ioder avec 75% d’alcool éthylique. Trouvez le point médian de la rate et faites une incision verticale de 1 centimètre sur l’abdomen pour exposer la rate. Retirer délicatement une partie du tissu pancréatique sous la rate à l’aide d’une pince à pointe plate.

Et sutro souris homograft morceau de tumeur de la souris C sur le pancréas de la souris destinataire par 9-O suture chirurgicale bsorbable. Fermez l’abdomen avec une suture en soie 6-O par double couture. Atteindre l’homéostasie par compression.

Après avoir terminé l’implantation de tumeur, gardez l’animal dans une cage chaude tant qu’aucune fuite de saignement ou de tissu tumoral ne se produit. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne suffisamment conscience pour maintenir sa récumbence sternale. Retournez l’animal dans la chambre des animaux après un rétablissement complet après l’anesthésie.

Surveillez la tumeur différentes souris en palpant l’abdomen près de la rate et sélectionnez les souris portant des tumeurs orthotopiques. Pour chaque tumeur, préparez un tube C avec tampon de digestion tumorale. Utilisez 3 millilitres de tampon de digestion pour les fragments tumoraux de moins de 0,8 grammes pour s’assurer que la tumeur est entièrement digérée.

Étiquetez la tumeur avec le code d’étude, la tumeur, l’identification de souris, le groupe de traitement, et le poids de tumeur. Recueillir la tumeur de la souris. Lavez la tumeur dans le PBS froid et nettoyez le tissu attaché sur la tumeur.

Placez la tumeur dans les supports de digestion dans un puits d’une plaque stérile de 6 puits. Maintenez la tumeur en place avec des pinces stériles ou des pinces et tranchez avec un scalpel. Trancher la tumeur assez bien pour se briser en petits morceaux.

Maintenant, placez les morceaux de tumeur de nouveau dans le tube C et utilisez le tampon de digestion restant pour laver la plaque. Transférer le liquide dans le tube C et le placer sur la glace jusqu’à la digestion. Ensuite, allumez le dissociateur avec des appareils de chauffage.

Placez la dissociation tumorale C-tube à l’envers dans la manche de la position vacante. Ajustez l’état de la position du tube de Free à Selected. Choisissez un programme de dissociation suivi de la sélection du dossier requis où la liste du programme est affichée.

Après la fin du programme, enlever le tube C du dissociateur et tourner brièvement pour paletter l’échantillon. Maintenant, suspendez les échantillons et mettez-les dans une passoire cellulaire au-dessus d’un tube de 50 millilitres. Lavez la cellule à travers la passoire cellulaire avec 10 millilitres de tampon de lavage pour fournir une suspension à cellule unique.

Après avoir centrifugé le tube à 300 G pendant 5 minutes, jetez le supernatant et suspendez les cellules avec 5 millilitres de tampon de lavage. Comptez les cellules viables et ajustez la concentration cellulaire à 1 million de cellules par tube ou par échantillon. Effectuez la conception du panneau immunitaire, l’immunostaining et la fluorescence moins un contrôle comme détail dans le protocole de texte.

Préparez des perles UltraComp pendant que les instruments d’écoulement se réchauffent en les vortexant soigneusement avant utilisation. Étiquetez un tube d’échantillon distinct de 12 x 75 millimètres pour chaque anticorps conjugué fluorochromes. Ajouter 100 microlitres de tampon de coloration à chaque tube suivre par une goutte complète des perles.

Ajouter des anticorps et effectuer la procédure de coloration telle que décrite dans le protocole de texte. Ajouter ensuite 0,5 millilitre de tampon de coloration à chaque boule de perles et re-suspendre complètement par vortex. Maintenant, réglez la tension de cytométrie de flux PMT par tissu cible pour l’expérience donnée.

Exécutez l’échantillon à travers l’échantillon à travers la cytométrie Flow pour l’acquisition de données en gagnant sur la population de perles singlet par dispersion vers l’avant et les lectures de dispersion latérale. Réglez le débit autour de 200 à 300 événements par seconde. Définissez la compensation appropriée pour un anticorps de conjugaison fitc de fluorescéine donné utilisant une parcelle de point FL1 contre FL1.

Placez une porte quadrant de sorte que les perles négatives se trouvent dans le quadrant inférieur gauche et que les perles positives se trouvent dans le quadrant supérieur ou inférieur droit. Ajuster les valeurs de compensation jusqu’à ce que l’intensité médiane de fluorescéine de chaque population soit à peu près égale. Répétez ces étapes pour tous les tubes.

Maintenant, procéder à l’acquisition d’échantillons de taches réelles. Exécutez l’assistant de compensation et enregistrez le paramètre avec le format : date, expérience et vos initiales. L’implantation orthotopique de l’adénocarcinome ductal pancréatique a eu comme conséquence la croissance rapide de tumeur semblable à celle vue dans l’implantation sous-cutanée.

Des images de coloration représentatives de l’hématoxyline et de l’éosine sont montrées et démontrent une croissance similaire des implants sous-cutanés et orthotopiques. Des rendements raisonnablement élevés de cellules viables ont été obtenu de l’échantillon de tumeur des deux types d’implantation. La splat représentative de FACS montre des cellules viables de la tumeur séparées des cellules mortes et des débris cellulaires.

Montré ici, est une tumeur infiltrant une comparaison de profil immunitaire de la population cellulaire majeure et numérique de plusieurs sous-ensembles clés de cellules immunitaires tumorales. L’homogreffe sous-cutanée contre orthotopique du cancer pancréatique sont montrées. Les données montrent clairement que la tumeur ont augmenté de manière significative l’infiltration des cellules immunitaires par rapport au pancréas de souris en bonne santé.

En outre, différents pourcentages des sous-ensembles immunisés d’infiltration de tumeur ont été trouvés dans les homogreffes orthotopiques contre sous-cutanées. Par exemple, il y a beaucoup plus de cellules B en orthotopique que sous-cutanée. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de préparer tous les matériaux associés et les reagents à l’avance.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’analyse FACS pour les modèles murins.