Name: De Novo Génération de cellules souches somatiques par YAP/TAZ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Découvrez la reprogrammation cellulaire par YAP pour générer des cellules souches somatiques à partir de cellules différenciées de glandes mammaires murines. Cette méthode innovante ouvre de nouvelles perspectives pour la médecine régénérative.

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Nous remercions le don de tetO-YAPS127A souris; F. Camargo R26-rtTAM2 souris (stock #006965) ont été achetés chez le laboratoire Jackson. Nous remercions Chiara Frasson et Giuseppe Basso pour obtenir de l’aide des procédures de FACS. Ce travail est soutenu par l’AIRC spécial programme moléculaire Clinical Oncology '' 5 pour mille'' et un PI-Grant AIRC S.P et par le projet phare de l’épigénétique CNR-Miur accorde aux S.P. Ce projet est financé depuis le Conseil européen de recherche (CER) sous recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et le programme pour l’innovation (Convention DENOVOSTEM no 670126 de subvention).

<ol><li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
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<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
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<li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li>
<li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li>
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<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+of+mutant+KRAS%2C+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42(2014).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+Roots+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li>
<li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li>
<li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li>
<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
<li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Lentiviral production and infection. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf">http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Ici, nous présentons des protocoles pour reprogrammer les ex vivo terminalement différenciées des cellules épithéliales des tissus différents dans leurs cellules progénitrices spécifiques des tissus correspondantes (ou CJS) par une expression transitoire de YAP, tel que rapporté précédemment1. Nous avons détaillé les deux procédures : une permettant la reprogrammation de cellules FACS purifié par le biais de vecteurs LENTIVIRAUX et une seconde qui évite l’infection virale et tire profit de l’expression de YAP transgénique. Chaque protocole présente une stratégie efficace pour isoler et cellules différenciées principal de culture et d’une stratégie pour forcer exogène YAP l’expression des gènes dans les cellules différenciées, générant de novo spécifique aux tissus extensibles les cellules souches somatiques (voir schémas dans les Figures 1 a et 2 a).
Nous avons démontré que les stratégies d’isolement présentés ici effectivement isoler une population pure de cellules différenciées, comme en témoigne le fait que nous avons jamais détecté toute excroissance provenant d’échantillons de contrôle négatif (Figures 1 et 2 C).
Les vecteurs LENTIVIRAUX utilisés dans cette étude pour la reprogrammation des cellules mammaires primaires de LD sont doxycycline inductible, offrant la possibilité d’un contrôle strict de l’expression du transgène ; Cela permet de mettre en marche et arrêt YAP exogène expression à volonté. Une attention particulière doit être placée en évitant l’utilisation d’un titre viral excessive, comme cela peut être néfaste en termes d’efficacité de reprogrammation. Dans le cas des cellules acineuses primaires, nous sommes passés à une approche entièrement transgénique afin d’obtenir une reprogrammation de YAP-dépendante avec les manipulations minimes. Cette dernière stratégie est aussi particulièrement indiquée pour les acini pancréatiques primaires, comme groupes acineuses isolés sont guère propices à l’infection des gènes et très fragile. La stratégie transgénique employée offre l’avantage même des vecteurs LENTIVIRAUX doxycycline-dépendante pour le contrôle strict de l’expression génique. En outre, la stratégie transgénique exploitée avec les acini pancréatiques primaires porte l’avantage supplémentaire d’un rendement beaucoup plus élevé reprogrammation par rapport à l’origine virale de reprogrammation des cellules mammaires de LD. Au-delà de la plasticité intrinsèque différente associée aux cellules provenant de tissus différents, le taux supérieur de reprogrammation du pancréas pourrait provenir de l’efficacité supérieure d’expression liée à l’expression de YAP uniforme et autonome dans tous les cellules explantées. Notamment, nous avons démontré que YAP exogène n’est plus nécessaire après la génération du CJS (colonies d’yMaSC et yDucts), sans affecter leur capacité d’autorenouvellement. C’est parce que le CJS réactivation endogène YAP/TAZ et utilisent pour autorenouvellement lorsque YAP exogène est éteint1.
Nous avons validé la notion que les CJS sortent en effet des cellules différenciées en contrôlant la cellule d’origine de nos expériences de reprogrammation génétique lineage-traçage validations1.
Caractérisation desde CJS montre qu’induite par YAP reprogrammation génère normal somatique SCs1 comme je l’ai) niveau transcriptomique, CJS affichent massive chevauche SCs natifs ; II) CJS potentiel de différenciation d’affichage et peuvent générer une descendance multilignée toujours limitée à l’identité de leur tissu d’origine ; III) CJS sont non transformées et non-tumorigènes quand transplanté en vivo.
Ici on décrit aussi les procédures visant à maintenir et à développer dans la culture fois yMaSCs et yDucts comme organoïdes incorporé dans la membrane basale 100 % matrice hydrogels. Ces conditions permettent l’auto-organisation du CJS en organoïdes en trois dimensions qui assurent le maintien des propriétés stemness à long terme dans la culture, ce qui permet d’étendre ces tige les populations à volonté pour les applications et les analyses en aval. Pour des raisons inconnues, nous avons échoué à obtenir yMaSC organoïdes en plaçant infecté les cellules directement dans les conditions de culture organoïde LD 7 jours après le traitement doxycycline en plaque de culture de tissu en plastique ; en d’autres termes, l’étape intermédiaire de la croissance dans des conditions de colonie mammaire est indispensable. Dans nos mains, MaSCs même natifs exigent des conditions colonie mammaires avant passage en culture organoïde. En outre, l’excroissance organoïde plus efficace est obtenue quand nous éviter dissociant les colonies primaires dans des cellules isolées, mais plutôt transférer les colonies intactes dans des conditions de culture organoïde.
Conditions de culture organoïde portent également l’avantage de donner la possibilité à cryoconservé CJS, pourvu que les organoïdes sont récupérés à partir de leurs matrices, évitant la dissociation cellulaire avant cryoconservation dans bain d’azote.
Le YAP reprogrammation procédure présentée permet de convertir des types distincts de cellules différenciées provenant de différents tissus adultes dans les cellules correspondantes de souches de tissu-spécifique (nous avons testé à l’aide de cellules mammaires, du pancréas et neuronales)1. À la différence du CISP ou d’autres efforts de reprogrammation, SCs YAP/induite peuvent conserver les souvenirs de leur tissu d’origine. À noter la dédifférenciation des cellules somatiques dans les cellules dotée d’une tige-comme des propriétés est la seule forme de plasticité destin cellulaire et reprogrammation observée in vivo, par exemple après des lésions tissulaires et de soutenir la guérison5,17 , 18 , 19 , 20. il est intéressant de noter que YAP et TAZ sont largement dispensable pour l’homéostasie normale mais fondamental pour la réparation des tissus dans plusieurs tissus11,21. Toujours avec une fonction physiologique des reprogrammation décrites ici, YAP/TAZ a été récemment démontré nécessaires en régénération intestinale chez les modèles murins de patients de la colite ulcéreuse en provoquant une conversion des cellules de l’intestin adultes en un épithélium réparation qui affiche les caractéristiques du tube digestif foetal19. Reprogrammation de YAP élargit ainsi les stratégies actuelles de plasticité cellulaire induite en fournissant un moyen de générer des cellules souches somatiques, un État qui a été jusqu'à présent difficile de capturer in vitro. Cette approche, si étendu aussi aux cellules d’origine humaine, pourrait concernent le vaste d’applications de la médecine régénératrice à l’étude de l’état de stemness somatique et expansion du somatique tige cellules in vitro.

Spécifique aux tissus les cellules souches somatiques (SCs) sont essentiels pour renouvellement tissulaire et de la réparation après une blessure. La possibilité de facilement isoler et illimitée augmenter ex vivo somatique SCs représente un enjeu crucial pour thérapies régénératives potentiels, ainsi que pour les applications de SC en recherche fondamentale et de la modélisation de la maladie. Toutefois, les progrès dans cette direction, a été limitée par la difficulté de capturer l’état de SC de divers organes épithéliales in vitro. En effet, dans plusieurs tissus adultes résidents SCs peuvent existe pas, ou ne pas être facilement disponible, ou leur nombre et leur potentiel de régénération peuvent être érodés par les conditions de vieillissement ou une maladie. En 2016, nous avons commencé à combler cette lacune en signalant que l’expression d’un seul co-activateur transcriptionnel, YAP (protéine associée aux Oui) ou ses protéines apparentées TAZ (activateur de la transcription d’un motif PDZ), en cellules différenciées en phase terminale efficacement crée des populations de cellules fonctionnelles, extensible, non tumorigènes autologue qui sont sur le plan opérationnel et moléculairement indiscernables de leur correspondant du SCs tissu-spécifiques1. Une impulsion de subies YAP ou activité TAZ pour quelques jours est suffisante pour induire l’apparition du renouvellement automatique de SCs somatiques. Il s’agit d’un état stable qui n’est plus tributaire de l’expression du transgène continue, comme il peut être transmis par des générations de cellules sans davantage d’expression ectopique YAP/TAZ1. Le protocole présenté ici les détails la procédure utilisée pour générer des cellules souches/progénitrices épithéliales de novo de la glande mammaire et du pancréas, à partir de cellules différenciées de ces tissus. Cette procédure remplit une boîte noire dans l’arène de reprogrammation/transdifférenciation actuel. Principaux efforts dans ces directions ont en effet jusqu'à présent centrée sur la transition de la cellule à un état de cellules souches (iPSC) pluripotentes induites, suivie de la conversion de ces embryons et les cellules pluripotentes SCs en plus différencient. Toutefois, le CISP est tumorigènes une fois introduits dans les tissus adultes, soulevant la nécessité de développer des protocoles pour leur différenciation complète et efficace2. Toutefois, cette étape de différenciation, même lorsque cela est possible, est au prix de potentiels à long terme de repeuplement évolutivité, auto-organisation et orgue. Ce sont les qualités essentielles pour la régénération de l’orgue qui caractérisent en fait uniquement de SCs endogènes de tissu-spécifique et des SCs d’induite par YAP actuellement décrits (CJS). De même, transdifférenciation directe d’un type de cellule dans une autre à l’aide de cocktails de transcription divers facteurs génèrent également des cellules qui n’ont pas essentiel proliférative et stemness potentiels3différenciées.
La procédure décrite ici tire également parti de la technologie organoïde récemment introduite, par laquelle SCs endogènes peuvent être étendus et différencient ex vivo4. Induite par le YAP SCs peuvent générer SCs organoïde formant même dans des conditions biologiques ou maladie expérimentales, dans laquelle SCs endogènes ne sont pas présents. Nous tenons à noter que, à la différence avec d’autres procédures de reprogrammation, le type de la plasticité cellulaire communiquée par YAP peut correspondre à la seule forme de la réversion à un statut de SC-like qui se produit dans les tissus vivants. Réacquisition de SC-comme des traits a été associée à la réparation des tissus ou oncogènes activation5. Bien que dispensable pour l’homéostasie de plusieurs tissus adultes, YAP et/ou TAZ est absolument essentiel pour la régénération, la croissance tumorale et l’expansion de SCs somatiques in vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table><tbody><tr><td>Seringues stériles de 10 mL</td><td>Rays</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à cellules de 100 mm</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques stériles de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de fixation ultra basses à 24 puits</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à cellules de 40 mm</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à puits multiples à 48 puits</td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes coniques stériles</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Plaques multipuits 6 puits</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>supplément B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase, type I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels jetables</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline hyclate</td><td>Sigma</td><td>D9891&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 100 %</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS (avec capuchons de crépine)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-souris CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp ;#19780&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp ;#84041</td><td>utilisé comme témoin négatif</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td>&nbsp ;#84008</td><td>utilisé comme témoin négatif</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp ;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&nbsp ;#84010</td><td>utilisé comme témoin négatif (mutant YAP mort transcriptionnellement)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>héparine sel sodique</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin1 humain (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase à partir de testicules bovins</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>K-14</td> anticorps <td>Life Technologies</td><td>Ab7800&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps K-8</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>&nbsp ; </td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin (cocktail d’anticorps de la lignée de souris allophycocyanine [APC])</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg ; Matrice de membrane basale réduite en facteur de croissance, sans rouge de phénol</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>adhésif non cellulaire 10 cm boîtes (polystirol stérile boîte de Pétri &oslash ; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Hamster Anti-Souris CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Rat Anti-Homme CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-souris/rat CD29 Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen I (revêtement)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de queue de rat I pour la culture 3D</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>recombinant humain FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>recombinant humain Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murin EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>recombinant murin FGF basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 moyen</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (Inhibiteur de la trypsine à partir de Glycine max)</td><td>Sigma</td><td>T6522&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tris BASE&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,05 %</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth medium</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

de novo génération de cellules souches somatiques par yap/taz

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Nous présentons ici des protocoles visant à isoler les cellules différenciées primaires et tourner en cellules souches/progénitrices (SCs) de la même lignée de l’expression transitoire du facteur de transcription YAP. Avec cette méthode, cellules luminales de (LD) différenciés de la glande mammaire de la souris sont converties en cellules qui présentent des propriétés moléculaires et fonctionnelles de SCs mammaire. YAP aussi tour à tour entièrement dissociés exocrine cellules pancréatiques dans le pancréas conduit comme progéniteurs. De même, à SCs endogènes, naturelles, induite par YAP souches comme cellules (« CJS ») peuvent être éventuellement étendus comme organoïde cultures à long terme in vitro, sans nécessité d’ectopique YAP/TAZ, comme CJS sont dotés d’un État autorenouvellement SC héréditaire.
La procédure de reprogrammation présentée ici offre la possibilité de générer et développez in vitro de cellules progénitrices de diverses sources de tissus à partir de cellules différenciées. L’expansion directe des cellules somatiques ex vivo a des implications pour la médecine régénérative, pour la compréhension des mécanismes d’initiation de la tumeur et, plus en général, pour la cellule et des études de biologie du développement.

Génération d’yMaSCs Un aperçu de la stratégie expérimentale pour reprogrammer les cellules mammaires primaires de LD par expression transitoire de YAP est présenté dans la Figure 1 a. Principales cellules épithéliales mammaires de la LD sont purifiés par fluorescence-lancée de cellules tri13. Figure 1 b représente une procédure de tri typique pour obtenir trois sous-populations distinctes : cellules basales (EpCAMfaibleCD49fhauteCD61–), les cellules progénitrices luminale (LP) (EpCAMhauteCD49ffaibleCD61+ ) et les cellules de LD (EpCAMhauteCD49ffaibleCD61–). Attention blocage des trois sous-populations est essentiel pour isoler une pure préparation de cellules LD, qui se distinguent entièrement et complètement croissance arrêtée lorsqu’ensemencées en formant des conditions (voir la Figure 1, panneau latéral gauche) des colonies de la glande mammaire. À l’inverse, lorsque amené à exprimer YAP exogène, cellules de LD commencent prolifèrent pour former des colonies épithéliales denses facilement reconnaissables dans les cultures en suspension matrice membrane basale 5 % (Figure 1). L’efficacité de la reprogrammation, attesté autour de 3 % pour une expérience, peut être marqué en comptant le nombre de colonies sur le nombre de cellules individuelles initialement ensemencé dans la membrane basale des cultures en suspension matrice (Figure 1). Les cellules luminales reprogrammés (yMaSCs) peuvent alors être passage dans 100 % membrane basale matrice organoïde conditions de culture (voir Figure 1 a), auto-organisés dans des structures ressemblant à des organoïde complexes qui se développent autour des lumières multiples et afficher la remarquable capacité d’autorenouvellement même en absence de doxycycline (c'est-à-dire en l’absence d’expression de YAP transgénique) (Figure 1E). Sur le plan histologique, dérivé d’yMaSC organoïdes affichent une couche basale (K14 positive), face à la matrice de la membrane basale reconstituée ECM et une couche luminale (K8 positive), face à des cavités lumen-comme dans l’organoïde (Figure 1F). Cette architecture est indiscernable de celle d’organoïdes formé par MaSCs natif (Figure 1F).
Génération d’yDucts Un aperçu de la stratégie expérimentale pour reprogrammer les acini pancréatiques primaires par l’expression transitoire de YAP est présenté dans la Figure 2 a. Toute acineuses clusters sont isolés de la masse du tissu pancréatique par une combinaison de dissociation douce et l’exclusion de taille par filtration. Une préparation typique est présentée dans la Figure 2 b. Après l’isolement, les grappes de cellules acineuses doivent apparaître sous forme de suspension exocrine acineuses unités de taille homogène, sans contamination par endocrinien îlots de Langerhans ou fragments de l’arborescence ductal pancréatique et dissociation minime aux cellules individuelles. Contamination par des îlots endocriniens ou fragments canalaires est une indication de filtration sélective déficiente (étape 2.1.10), probablement à cause de traitement rigoureux ; dissociation indésirable de clusters acineuses à monocellules peut-être dû à traitement de collagénase excessive ou non l’activité des enzymes protéolytiques libéré par le tissu, qui peut être freiné par un traitement additionnel SBTI.
Une expérience typique de reprogrammation acineuse est présentée dans la Figure 2; dans 5-7 jours de culture en collagène 3D-je me suis basé hydrogel en présence de doxycycline, les acini pancréatiques dérivés R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A souris facilement se transformer en amas semblables conduit (que nous avons appelée yDucts), composée par un mince monocouche de cellules épithéliales qui prolifèrent autour d’une cavité centrale en pleine expansion. La reprogrammation de l’efficacité, qui représente environ 70 % pour une expérience typique, peut être facilement mesurée en marquant le nombre de clusters conduit comme sur le nombre total de graines acini (Figure 2D). Cellules de contrôle négatif, c'est-à-dire R26-rtTAM2 / + cellules ou cellules R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A gauche sans doxycycline, invariablement restent comme post-mitotiques clusters acineuses dans ces conditions de culture, comme indiquées précédemment1 ,14,15. YDucts reprogrammé peut ensuite être repiquées au niveau unicellulaire dans de conditions culture axée sur le Matrigel organoïde16 (voir Figure 2 a), affichage remarquable capacité d’autorenouvellement même en absence de doxycycline (c.-à-d. en l’absence d’expression de YAP transgénique) (Figure 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figure 1 : Isolement de LD mammaire primaire des cellules et l’induction de mammaire de cellules souches. (A) représentation schématique de la procédure expérimentale adopte pour reprogrammer les cellules mammaires primaires de LD. (B) représentant FACS-parcelles illustrant une procédure de tri typique pour purifier les cellules de la LD. i) cellules dissociées sont bloquées après dispersion vers l’avant et latérale pour des cellules vivantes (P1 ; bleu) ; II) population P1 est alors plus dépendants selon son profil de Lin : la sous-population de cellules de la lignée négatives (P2 ; gris) est sélectionnée, à l’exclusion des cellules hématopoïétiques lignée positives ; III) population P2 est alors séparée en un EpCAMhaute (P3 ; jaune + vert) et un sous-populationsfaible (P6 ; rouge) EpCAM ; IV) P3 et P6 sont alors davantage dépendants selon leur profil CD61/CD49f en trois sous-populations : EpCAMfaibleCD49fhauteCD61 cellules basales de– (P7 ; rouge), EpCAMhauteCD49ffaibleCD61+ LP cellules (P8 ; jaune) et EpCAMhauteCD49ffaibleCD61 cellules de LD– (P9 ; vert). (C) Images illustrent la capacité des cellules de LD, infectées par les constructions indiquées, pour former des colonies mammaires 15 jours après l’ensemencement dans le milieu de la colonie mammaire. Seulement tour de cellules exprimant le YAP en formant des colonies cellules, tandis que les cellules contrôle négatif (EGFP-infectés) demeurent comme arrêté à la croissance des cellules individuelles. Echelle = 50 μm. (D) la Quantification de la colonie formant la capacité des cellules indiquées, comme en (C). Les données sont présentées comme moyenne + s.d. et sont représentatifs des cinq expériences indépendantes, chacune avec six réplicats techniques. (E) l’image représentative de YAP-reprogrammé cellules souches comme cellules mammaires (yMaSCs) après 12 jours en conditions de culture organoïde dans trois dimensions frais 100 % membrane basale matrice hydrogel en l’absence de la Doxycycline. Echelle = 100 μm. (F) images représentatives immunofluorescence pour le marqueur basal K14 (vert) et le marqueur luminal K8 (rouge) d’organoïdes a dérivé les cellules indiquées, après 12 jours en conditions de culture organoïde. Echelle = 10 μm. Cette figure est reproduite de Panciera et coll., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figure 2 : Isolement des cellules acineuses du pancréas primaires et induction des cellules souches pancréatiques. (A) représentation schématique de la procédure expérimentale adoptée pour reprogrammer des cellules acineuses exocrines pancréatiques primaires. (B) l’image représentative des acini pancréatiques primaires juste après la procédure d’isolement (étape 2.1.14). La préparation acineuse doit apparaître comme une suspension homogène de grappes acineuses, avec une présence minimale des cellules individuelles. Echelle = 400 μm. (C) des images représentatives des acini pancréatiques primaires issus de la R26-rtTAM2 (panneaux supérieurs)ou R26-rtTAM2 ; tetO-YAPS127A (baisse de panneaux) souris et cultivées en 3D collagène I-base d’hydrogel pour 5 jours avec ou sans Doxycycline (doxy), comme indiqué. Seulement exprimant le YAP primaire acini convertit en cellules cultivées comme les kystes organoïde après addition de la Doxycycline. Barreaux de l’échelle = 70 μm. (D) la Quantification de la capacité des acini pancréatiques pour former organoïdes canalaire à la surexpression de YAP transgénique comme en (C). Les données sont présentées en moyenne + s.d. et sont représentatifs des cinq expériences indépendantes, effectuées avec quatre répétitions techniques. Image de représentant (E) des cellules de type canalaire YAP-reprogramed (yDucts) après trois passages dans trois dimensions frais 100 % membrane basale matrice hydrogel en l’absence de Doxycycline. Echelle = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolement des cellules mammaires primaires</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 + solution de chélation</td>
			<td>Conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02 % p/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagène I solution de revêtement</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acide acétique 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagène de queue de rat (revêtement)</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution a</td>
			<td>Conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Moyen de dissociation</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution mère de l’hyaluronidase</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagénase de solution mère j’ai</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution hémolytique</td>
			<td>Conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de NH4Cl</td>
			<td>1 pièces</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 pièces</td>
		</tr>
<tr>
<td>ajuster le pH à 7,2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>x 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution mère de l’hyaluronidase</td>
			<td>Filtre 0,2 µm, conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase des testicules bovins (poudre)</td>
			<td>2 000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 7,3 M de tampon phosphate de sodium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de NH4Cl</td>
			<td>Stocker à T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ajuster le pH à 7,65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de tri</td>
			<td>Filtre 0,2 µm, conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PH HEPES 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Laver le moyen #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Laver le moyen #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu de culture 2D mammaire</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>héparine</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murin</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murin</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Induction et Passaging d’yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Moyen de colonie mammaire</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>héparine</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (ajouter immédiatement avant le semis)</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murin</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murin</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mammaires organoïde Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12 avancée</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>héparine</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caboche humaine</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>bEGF murin</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murin</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : génération d’yMaSCs. Composition de tous les différents milieux de culture et les solutions requises pour l’isolement de cellules primaires de LD mammaires et induction d’yMaSCs (section 1)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolement des acini pancréatiques primaires</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Milieu de Culture acineuses</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexaméthasone</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moyen de Waymouth</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Support de lavage acineuses</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu RPMI</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Moyen de récupération acineuses</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu de Culture acineuses</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30 %</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagénase j’ai solution A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Support de lavage acineuses</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagénase de solution mère j’ai</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Conserver à 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (tampon Phosphate salin)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagénase de solution mère j’ai</td>
			<td>Conserver à-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagénase, type I (poudre)</td>
			<td>6 000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passage des organoïdes pancréatique</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagénase j’ai solution B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagénase de solution mère j’ai</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pancréatique organoïde Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM avancé/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrine</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF10 humaine</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caboche humaine</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murin</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acétylcystéine</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stylo/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : génération d’yDucts. Composition de tous les différents milieux de culture et les solutions requises pour l’isolement des cellules acineuses primaires et l’induction et le passage des yDucts (section 2)

Disponibilité de SCs somatiques est cruciale pour la médecine régénérative, modélisation de la maladie et de mieux comprendre les propriétés SC. Nous présentons ici des stratégies expérimentales de reprogrammer, in vitro, les cellules adultes différenciées dans les cellules correspondantes d’extensible tissu-spécifique souches/progénitrices par l’expression transitoire de l’activateur de transcriptional co seul YAP.

De Novo Génération de cellules souches somatiques par YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

L’objectif global de cette procédure est de transformer des cellules différenciées primaires en cellules progénitrices de la même lignée par l’expression transitoire du facteur de transcription YAP. Cette procédure de reprogrammation offre la possibilité de générer in vitro des cellules progénitrices ou souches de divers tissus à partir de leurs homologues différenciés, même lorsque les cellules souches endogènes sont rares ou difficiles à identifier. La possibilité ici d’étendre les cellules somatiques ex vivo a des implications pour la médecine régénérative, pour la compréhension des mécanismes de plasticité cellulaire qui est également pertinente dans le cancer et pour le tissu cellulaire et le développement des études biologiques.Cette procédure remplit une boîte noire dans le domaine actuel de la reprogrammation, car nous ne visons pas à fabriquer des cellules spécialisées par différenciation des cellules souches embryonnaires, mais des cellules souches spécifiques aux tissus à partir de cellules différenciées. Après avoir sacrifié 10 souris femelles selon le protocole textuel, disséquez les glandes mammaires en faisant une incision en forme de Y le long de la peau abdominale. Ensuite, à l’aide d’une pince de Dumont, séparez soigneusement les glandes du péritoine en tirant doucement.Placez les glandes disséquées dans une coupelle adhésive non cellulaire avec 10 millilitres de HBSS+PS glacé. Sous une hotte de culture tissulaire, utilisez 10 millilitres de HBSS+PS frais pour laver chaque glande une fois et placez-les dans un plat adhésif non cellulaire vide. Ensuite, à l’aide de deux scalpels stériles, hachez finement les glandes en fragments d’un millimètre cube.Un bon hachage des glandes est essentiel pour une isolation cellulaire efficace. Rassemblez 20 glandes et essayez d’effectuer cette étape dans les trois à cinq minutes pour une viabilité cellulaire optimale. À l’aide d’une pipette sérologique de 25 millilitres et de 10 millilitres de milieu de dissociation, récupérez le tissu haché de chaque boîte et transférez la suspension dans un tube conique de 50 millilitres en pipetant au moins cinq fois pour désagréger les amas de tissus.Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant une heure en secouant vigoureusement et continuellement. Ensuite, faites tourner le tissu digéré à 400 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, utilisez trois millilitres de solution hémolytique pour remettre le tissu en suspension et incubez sur de la glace pendant trois minutes.Ensuite, avec 10 millilitres de milieu de lavage numéro un, lavez les cellules. Après avoir essoré le tissu digéré et jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille de tissu dans 10 millilitres de milieu de lavage numéro deux et plaquez les cellules dans des boîtes de culture de tissus de 10 centimètres. Ensuite, incubez les plats à 37 degrés Celsius pendant une heure.Récupérez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et faites tourner le tube à 400 fois g pendant cinq minutes. Utilisez ensuite 10 millilitres de la solution chélatrice de calcium pour remettre la pastille en suspension. Après la centrifugation et après avoir répété le lavage, remettre le granulé en suspension dans cinq millilitres de 0,25 % de trypsine-EDTA.Après avoir incubé l’échantillon, ajoutez cinq millilitres de solution de dispase complétés par un microgramme par millilitre de DNase sur la solution de trypsine. Pour désagréger les amas à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, pipeter de haut en bas au moins cinq fois et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, en secouant toutes les trois minutes. Ajoutez 10 millilitres de fluide de lavage numéro deux et filtrez la solution à travers une crépine à cellules de 40 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.Ensuite, faites tourner la suspension cellulaire. Pour effectuer la purification cellulaire par FACS, utilisez 200 microlitres de fluide de lavage numéro un pour remettre en suspension chaque pastille. Ajoutez ensuite 44,5 microlitres de mélange d’anticorps, pipetez à fond et incubez l’échantillon dans l’obscurité sur de la glace pendant 30 minutes.Versez la suspension cellulaire dans 10 millilitres de produit de lavage numéro un et faites tourner l’échantillon. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de solution de tri et filtrer à travers un tube FACS à crépine avant de procéder à la séparation FACS des populations cellulaires. Utilisez la solution de lavage numéro un pour laver les cellules récupérées du FACS.Après avoir retiré le surnageant, utilisez un milieu de culture mammaire 2D pour remettre en suspension la pastille cellulaire et une plaque de 500 microlitres par puits sur une plaque traitée au collagène. Sept jours après l’induction de la doxycycline dans les cellules LD primaires infectées par des lentiviraux, ajoutez 150 microlitres par puits de 05 % trypsine-EDTA aux cellules et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois les cellules lavées et comptées, utilisez un milieu de colonie à mémoire, complété par deux microgrammes par millilitre de doxycycline pour les remettre en suspension.Ensuite, ensemencez 1 000 cellules par puits dans des plaques de fixation ultra basses de 24 puits pour la culture de colonies de type masque exprimant YAP. Pour sous-cultiver des masques y, prélever chaque échantillon et ajouter 10 à un volume de HBSS glacé, puis incuber les échantillons sur de la glace pendant une heure afin de solubiliser la matrice de la membrane basale. Après avoir fait tourner les colonies, utilisez du HBSS glacé pour laver les cellules trois fois.Ajoutez ensuite 05 % de trypsine-EDTA aux colonies et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Passez 10 fois les colonies à travers l’embout d’une pipette P1000 pour obtenir une suspension unicellulaire. Ensuite, comptez et réensemencez les cellules dans un milieu de colonie mammaire sans doxycycline dans 24 plaques de fixation ultra faibles à une densité cologénique de 1 000 cellules par puits.Avant le troisième passage, transférez les colonies de masque Y dans des conditions de culture organoïde en récupérant les colonies du milieu de la colonie mammaire et utilisez une matrice de membrane basale réduite à 100 % de facteur de croissance pour les remettre en suspension. Après l’incubation, lorsque la matrice de la membrane basale s’est solidifiée, recouvrir les gels de 500 microlitres de milieu organoïde mammaire. Faites passer les cultures en prélevant chaque échantillon d’organoïde et en les incubant dans un volume excédentaire de HBSS sur de la glace pendant une heure.Ensuite, utilisez du HBSS glacé pour laver les organoïdes trois fois. Trypsinisez les organoïdes comme démontré plus tôt dans cette vidéo et réensemencez les suspensions unicellulaires dans une goutte de matrice de membrane basale réduite à 100 % du facteur de croissance, puis utilisez 500 microlitres de milieu organoïde mammaire pour superposer les gels. Après avoir lavé le tissu pancréatique de souris digéré conformément au protocole de texte, utilisez six millilitres de milieu de récupération acineux pour remettre soigneusement en suspension le tissu digéré et le répartir entre deux puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits.À l’aide d’un stéréomicroscope, évaluez soigneusement la qualité de l’isolement de l’acineux et retirez tous les gros amas de tissus éventuellement présents. Pour semer des acini pancréatiques primaires, après avoir incubé les grappes pendant deux heures pour la récupération cellulaire, collectez la suspension de cellules acineuses dans un tube conique et centrifugez les échantillons à 100 fois g et 18 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir remis en suspension les acini dans un milieu de culture acineux, diluez la suspension avec un volume égal de collagène de queue de rat neutralisé une solution, en gardant les tubes sur de la glace.Mélangez soigneusement et rapidement et ensemencez la suspension cellulaire dans 16 puits sur le dessus du coussin de collagène. Pour un ensemencement optimal des acini pancréatiques, il est crucial de garder tous les tubes dans de la glace avant le placage et de procéder rapidement, mais en même temps, un pipetage minutieux pour éviter la formation de bulles d’air est essentiel pour créer une matrice de collagène homogène. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant une heure pour permettre la formation d’un hydrogel.Ensuite, pour induire des organoïdes pancréatiques, superposez les hydrogels de collagène avec 500 microlitres de milieu de culture acineux complété par de la doxycycline. Pour sous-cultiver les organoïdes, jetez le milieu de culture, extrayez soigneusement les hydrogels et transférez-les dans des tubes coniques contenant quatre millilitres de solution B de collagénase I, puis incubez les tubes à 37 degrés Celsius en secouant vigoureusement pendant 30 minutes avant de faire tourner les cellules et d’éliminer le surnageant. Après avoir essayé de stabiliser les cellules et éliminé le surnageant PBS, utilisez une matrice de membrane basale glacée pour remettre en suspension la pastille cellulaire et ensemencer la suspension dans des plaques de fixation ultra basses.Laissez l’hydrogel matriciel de la membrane basale se solidifier en incubant les plaques à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes, puis en les superposant avec un organoïde pancréatique. Les conduits se développeront comme des organoïdes semblables à des kystes en sept à 10 jours. Il est essentiel de dresser soigneusement les cellules épithéliales primaires de la LD mammaire dans les trois sous-populations présentées ici pour isoler une préparation pure de cellules LD qui sont entièrement différenciées et dont la croissance est complètement arrêtée lorsqu’elles sont ensemencées dans des conditions de formation de colonies de glandes mammaires.À l’inverse, lorsqu’elles sont induites à exprimer des YAP exogènes, les cellules LD commencent à proliférer pour former des colonies épithéliales denses facilement reconnaissables dans des cultures en suspension de matrice de membrane basale à 5 %. Dans des conditions de culture d’organoïdes matriciels à membrane basale, les cellules luminales reprogrammées s’auto-organisent en structures complexes de type organoïde qui se développent autour de plusieurs lumens et s’auto-renouvellent même en l’absence de doxycycline. Au cours des cinq à sept jours de culture dans un hydrogel à base de collagène 3D I en présence de doxycycline, les acini panrcréatiques différenciés se transforment facilement en amas de canaux ou en canaux en Y composés d’une mince monocouche de cellules épithéliales qui prolifèrent autour d’une cavité centrale en expansion.L’efficacité de reprogrammation peut être facilement mesurée en marquant le nombre de grappes de conduits sur le nombre total d’acini ensemencés. Les yDucts reprogrammés peuvent ensuite être passés au niveau de la cellule unique dans des conditions de culture d’organoïdes à base de matrigel, montrant une capacité d’auto-renouvellement remarquable même en l’absence d’expression endogène de YAP. Nous avons détaillé deux procédures.L’un a permis de reprogrammer les cellules purifiées par FACS à travers des vecteurs lentiviraux et un second qui évite l’infection virale et tire parti de l’expression transgénique de YAP. Lors de la tentative de reprogrammation des cellules mammaires, il est important d’éviter l’utilisation d’un titre viral excessif car cela peut nuire à l’efficacité de la reprogrammation. La stratégie entièrement transgénique convient aux acini pancréatiques primaires, car ceux-ci sont à peine propices à l’infection lentivirale.Il offre également le même avantage que les vecteurs lentiviraux dépendants de la doxycycline pour le contrôle du type d’expression génique. En plus des exemples démontrés ici, ce protocole de reprogrammation YAP s’est avéré efficace pour convertir des neurones différenciés en neurones proliférants. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une reprogrammation dépendante de YAP pour convertir des types de cellules différenciés de différents tissus adultes en leurs cellules souches spécifiques aux tissus correspondantes.Cette procédure élargit les stratégies de reprogrammation actuelles en fournissant un moyen de générer des cellules souches somatiques qui peuvent être pertinentes pour la médecine régénérative, pour l’étude de la souche somatique et pour l’expansion des cellules souches somatiques in vitro. Veuillez noter que la manipulation de la préparation lentivirale peut être extrêmement dangereuse et, par niveau de sécurité, deux mesures doivent toujours être adoptées lors de l’exécution de cette procédure.

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