Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Les objectifs généraux de ce protocole sont d’examiner l’activation de l’inflammasome au niveau de la cellule unique par microscopie à fluorescence et de mesurer la lyse pendant la pyroptose par un test de libération de lactate déshydrogénase ou LDH. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammasome, telles que la régulation de l’activation de la caspase-1. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles permettent à l’utilisateur d’examiner plusieurs étapes des voies d’activation de l’inflammasome et de pyroptose.

Andreas den Hartigh, un chercheur scientifique de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par remplacer le milieu à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse amorcés par le LPS ensemencés sur des lamelles en verre par 290 microlitres de milieu DMEM 5, complété par cinq micromolaires de nigéricine et cinq millimolaires de glycine, par puits. Remettez la plaque de 24 puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en ajoutant 10 microlitres de 30X FAM-YVAD-FMK après les 15 premières minutes.

À la fin de l’incubation, laver les cellules avec un millilitre de PBS froid par puits, trois fois pendant cinq minutes par lavage et fixer les cellules avec 250 microlitres de paraformaldéhyde à 2 % par puits pendant 30 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière, en étiquetant les cellules avec un colorant nucléaire de fluorescence approprié pendant les cinq dernières minutes. À la fin de l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS froid comme nous venons de le démontrer et chargez chaque lame avec sept microlitres de milieu de montage anti-évanouissement. Placez une lamelle sur chaque lame et laissez le support de montage durcir pendant la nuit avant de sceller les lamelles avec du vernis à ongles.

Pour imager les cellules par microscopie confocale à fluorescence, placez la lame de contrôle non traitée sur la platine du microscope et faites la mise au point manuellement sur les cellules. À l’aide des paramètres de la table de recherche du microscope, ajustez le décalage jusqu’à ce qu’aucune coloration positive de la sonde ne soit observée dans les cellules non traitées. Ensuite, à l’aide d’un échantillon traité à la nigéricine, localisez un champ contenant des cellules à la fois positives et négatives pour la coloration de la sonde et ajustez le plan d’imagerie du canal de la sonde au plan qui présente la plus grande intensité de coloration positive.

Ajustez ensuite le gain jusqu’à ce que les foyers soient visibles dans les cellules avec des noyaux condensés et obtenez des images de cinq champs sélectionnés au hasard par lame avec un grossissement total de 100X. Pour l’analyse immunofluorochimique des cellules traitées à la nigéricine, laver les cellules marquées à l’accessoire comme cela vient d’être démontré et incuber les cellules dans 250 microlitres de solution de fixation et de perméabilisation par puits pendant 30 minutes sur de la glace, à l’abri de la lumière. Lavez les macrophages trois fois de plus avec un tampon de lavage frais et étiquetez les cellules avec 250 microlitres d’anticorps primaires contre une protéine semblable à un speck associée à la ptose contenant un domaine de recrutement de caspase C-terminal, ou ASC, par puits, pendant une heure sur glace.

Lavez les cellules à la fin de l’incubation et étiquetez les échantillons avec 250 microlitres d’anticorps secondaire conjugué à un colorant de fluorescence approprié pendant une autre heure sur de la glace, en ajoutant quatre microlitres d’un colorant nucléaire de fluorescence approprié pendant les cinq dernières minutes. Après avoir lavé les cellules trois fois dans un tampon de lavage à froid, montez des lamelles sur les lames avec sept microlitres de milieu de montage anti-évanouissement, comme démontré, et imagez les macrophages par microscopie confocale à fluorescence. Pour effectuer un test de libération de LDH, ajoutez 50 microlitres de milieu DMEM 5 complété par 10 micromolaires de nigéricine dans chaque puits expérimental et 50 microlitres de DMEM 5 dans les puits de contrôle spontané et à 100 % de lyse pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après 30 minutes, ajoutez 10 microlitres de tampon de lyse 10X dans les puits de contrôle de lyse à 100 % et ajoutez 10 microlitres de fluide dans les autres puits. À la fin de l’incubation, centrifugez la plaque et transférez 50 microlitres de surnageant de chaque puits sur une plaque claire à fond plat. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de substrat fraîchement décongelé et préparé dans chaque puits pour une incubation de 30 minutes dans l’obscurité, en vérifiant la plaque après 15 minutes pour confirmer que le signal ne dépassera pas la limite de détection du lecteur de plaques.

À la fin de l’incubation, ajoutez 50 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits et mesurez l’OD490 sur un lecteur de plaque approprié pour permettre le calcul du pourcentage de lyse cellulaire par puits. Alors que les macrophages de type exposés à la nigéricine montrent la formation d’un foyer ASC dans la région périnucléaire qui contient également de la caspase-1 active, indiquant que ces cellules subissent une pyroptose. Alors que les macrophages de souris déficientes en caspase-111 génèrent également un foyer ASC, ces cellules n’ont pas de caspase-1 active associée à ce foyer, comme l’indique l’absence de coloration FAM-YVAD-FMK.

Les noyaux de ces cellules ne sont pas non plus condensés, ce qui indique une absence de mort cellulaire pyroptotique. De plus, un grand pourcentage de macrophages de type sauvage subissent la mort cellulaire après une exposition à la nigéricine, comme mesuré par l’analyse de libération de LDH de leurs surnageants de culture, tandis que les macrophages déficients en Caspase-1 ne libèrent pas de LDH dans le surnageant, ce qui indique que les cellules sont toujours intactes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser la formation d’inflammasome par microscopie à fluorescence et de déterminer le niveau de lyse cellulaire en mesurant la libération de LDH.

Cette procédure peut être modifiée pour l’utilisation d’autres stimuli ou interventions qui modifient l’activation de l’inflammasome ou la pyroptose.