Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis
15 mars 2018
Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.
L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des enregistrements électrophysiologiques de cellules entières à partir de neurones du tectum optique du têtard afin d’en savoir plus sur leur modèle de connectivité au cours du développement et, en fin de compte, de comprendre comment les circuits neuronaux se forment et fonctionnent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement neuronal, telles que comment les neurones changent au cours du développement et comment les circuits fonctionnent pour donner naissance au comportement. Le principal avantage de ces préparations est qu’elles permettent l’enregistrement électrophysiologique des neurones du tectum optique afin de fournir des informations sur la fonction des circuits neuronaux en développement.
La démonstration de la procédure sera faite par Zhenyu Lui, un étudiant diplômé de mon laboratoire. À l’aide d’une pipette de transfert d’élimination, déplacer le têtard anesthésié dans une boîte d’enregistrement de dissection contenant une solution d’enregistrement externe. Fixez le têtard anesthésié à un bloc de silicone immergé sur le sol de la parabole d’enregistrement de dissection.
Pour une vue claire du cerveau, retirez la peau qui recouvre le cerveau en faisant une incision superficielle le long de la ligne médiane à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 25. Filetez le cerveau le long du même axe médian en insérant l’aiguille dans le tube neural et en tirant doucement vers le haut de sorte que la partie dorsale du tube soit coupée proprement tout en laissant la plaque de sol intacte. Pour isoler le cerveau, utilisez d’abord une aiguille de calibre 25 pour sectionner le cerveau postérieur.
Ensuite, passez doucement l’aiguille sous le cerveau dans une direction caudale à rostrale pour sectionner tout le tissu conjonctif latéral et ventral et les fibres nerveuses. Ensuite, fixez le cerveau à un bloc d’élastomère de silicone en plaçant une goupille dans l’un des bulbes olfactifs et une autre goupille dans le cerveau postérieur. Il s’agit de la configuration optimale pour l’enregistrement à partir de neurones tectals.
Déplacez ensuite la boîte contenant la préparation du cerveau entier épinglée de la lunette de dissection à la plate-forme d’électrophysiologie. Retirez la membrane ventriculaire à l’aide d’une pipette en verre brisé. Pour activer directement les axones RGC, abaissez doucement une électrode de stimulation bipolaire sur le chiasma optique de sorte qu’une petite bosse se forme dans le tissu.
L’électrode de stimulation bipolaire doit être rostrale et presque adjacente au grand ventricule moyen où se trouve le chiasma optique. L’électrode bipolaire est entraînée par un stimulateur d’impulsions qui permet de contrôler avec précision la force de la stimulation. Pour préparer la tranche de cerveau horizontale, commencez par toute la préparation du cerveau.
Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour exciser le quart le plus latéral d’un côté d’un tectum optique. Cette coupe est faite parallèlement au plan caudal rostral. Ensuite, réépinglez le cerveau sur le côté de l’élastomère de silicone, le côté tranché vers le haut afin que le somata et le neuropil soient directement accessibles pour l’enregistrement et que la surface ventriculaire du cerveau soit tournée vers l’opposé du bloc d’élastomère de silicone afin qu’une électrode bipolaire puisse être placée sur le chiasma optique.
Effectuez ensuite l’enregistrement du patch clamp de la cellule entière ou du potentiel de champ local. Voici le schéma montrant la configuration d’une préparation de tranche de cerveau horizontale. Notez que bien que l’électrode de stimulation reste au niveau du chiasma optique, la pipette enregistreuse est maintenant positionnée pour accéder aux cellules de toutes les couches tectales exposées par la préparation de la tranche de cerveau horizontale
.Il s’agit d’une réponse évoquée par RGC à partir d’un neurone résidant dans la couche superficielle du tectum. Dans cette figure, les potentiels de champ enregistrés à travers le neuropil et les densités de source de courant converties sont représentés par un graphique d’image. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 minutes et durera généralement jusqu’à trois ou quatre heures.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la préparation du cerveau entier et de la tranche horizontale du cerveau pour les enregistrements de cellules entières afin de quantifier les propriétés électriques des neurones tectaux et leur connectivité.
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Aperçu
Cette étude explore les techniques d'enregistrement en configuration whole cell patch clamp afin d'analyser le circuit rétino-tectal chez les têtards de Xenopus laevis. En utilisant différentes préparations cérébrales, la recherche vise à comprendre les schémas de connectivité des neurones dans le tectum optique du têtard au cours du développement ainsi que la fonction globale des circuits neuronaux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Électrophysiologie
- Circuits neuronaux
Contexte
- Étudier la formation et le fonctionnement des circuits neuronaux chez les organismes en développement.
- Le circuit rétino-tectal est essentiel pour le traitement visuel chez les amphibiens.
- Les têtards de Xenopus laevis constituent un modèle précieux pour l'étude des connexions neuronales.
- Les enregistrements en configuration tout-cellule fournissent des informations détaillées sur l'activité neuronale.
Objectif de l'étude
- Comprendre les schémas de connectivité entre les neurones du tectum optique.
- Analyser la manière dont les neurones évoluent au cours du développement.
- Explorer la contribution des circuits neuronaux au comportement.
Méthodes utilisées
- Des méthodes de patch-clamp en cellule entière ont été utilisées pour les enregistrements électrophysiologiques.
- Le modèle biologique impliquait des cerveaux de têtards disséqués afin d'étudier les neurones du tectum optique.
- Aucun workflow multiomique n'a été mentionné.
- Les étapes spécifiques comprenaient l'immobilisation du têtard, l'isolement du cerveau et la réalisation d'enregistrements ciblés.
- Ces méthodes permettent des enregistrements dans un délai crucial de 10 minutes, durant généralement plusieurs heures.
Résultats principaux
- Les préparations ont permis avec succès l'enregistrement de l'activité neuronale dans le tectum.
- Des modifications électrophysiologiques indicatives de la connectivité neuronale ont été observées.
- Les résultats ont suscité des discussions sur les implications fonctionnelles du circuit rétino-tectal.
- Les découvertes contribuent à la compréhension des circuits neuronaux en développement.
Conclusions
- Cette recherche démontre des méthodes efficaces pour étudier la connectivité neuronale dans les cerveaux de têtards en développement.
- L'étude améliore la compréhension du fonctionnement des circuits neuronaux au cours du développement.
- Les résultats ont des implications plus larges pour l'examen des processus neurologiques et des comportements chez les amphibiens.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'enregistrement en mode « whole cell » par patch clamp chez les têtards de Xenopus laevis permet une interrogation à haute résolution de la formation et de la fonction des circuits neuronaux, offrant des aperçus mécanistiques sur la connectivité synaptique et l'excitabilité neuronale au cours du développement. Cette approche soutient la validation de cibles en neurosciences en permettant la mesure directe des réponses neuronales à des stimuli définis, tels que l'activité induite par les cellules ganglionnaires rétiniennes dans le tectum optique. L'adaptabilité de cette méthode à des préparations in vivo, de cerveau entier ou de tranches horizontales améliore la reproductibilité et l'évolutivité pour la détection préclinique des cibles neurodéveloppementales.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant les réponses neuronales aux stimuli sensoriels, clarifiant ainsi la connectivité fonctionnelle dans les circuits en développement.
- Valeur opérationnelle : Soutient la détection biologique des risques grâce à des relevés électrophysiologiques directs de l'activité neuronale, réduisant ainsi l'ambiguïté concernant l'engagement de la cible.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en reliant des perturbations génétiques ou pharmacologiques à des changements mesurables de l'excitabilité neuronale tectale et de l'intégration synaptique.
Développement de criblages et de tests
- Préparation du test : Prépare des systèmes biologiques validés pour le criblage de composés en mettant en place des préparations neuronales stables et enregistrables, dotées de propriétés définies en matière de stimulus-réponse.
- Résultats quantitatifs : Génère des mesures électrophysiologiques telles que les courants postsynaptiques et les potentiels de champ, permettant l'analyse dose-réponse et la quantification des effets des composés.
- Réutilisation de la plateforme : La préparation de tranches cérébrales horizontales permet l'enregistrement à travers toutes les couches du tectum, augmentant le débit et la reproductibilité lors de sessions expérimentales répétées.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise les processus neurodéveloppementaux liés aux troubles impliquant un mauvais câblage des circuits, soutenant l'exploration de biomarqueurs translationnels.
- Continuité préclinique : Fait le lien entre découverte et validation en permettant l'enregistrement cohérent de la fonction neuronale à différents stades du développement.
- Décisions adaptées au risque : Appuie les critères de poursuite ou d'abandon sur la base de phénotypes électrophysiologiques, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée des programmes neurodéveloppementaux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en fournissant une validation fonctionnelle des cibles neuronales avant l'optimisation du composé leader, les résultats orientant à la fois le choix des cibles et la compréhension mécanistique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en enregistrant les réponses évoquées par les neurones téctaux suite à la stimulation des axones des cellules ganglionnaires rétiniennes.
- Écrantage : Permet la standardisation des tests grâce à des préparations reproductibles de cerveau entier et de tranches, produisant des réponses électrophysiologiques quantifiables pour l'écrantage de composés.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes telles que les amplitudes des courants et les latences, facilitant la comparaison entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Assure une validité préclinique en conservant les propriétés des circuits pertinentes pour la maladie à travers les différentes préparations, soutenant ainsi l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme électrophysiologique réutilisable, adaptable à divers contextes expérimentaux, réduisant ainsi le développement redondant de méthodes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à l'enregistrement neuronal direct.
- Valeur opérationnelle : Renforce la reproductibilité et la standardisation entre laboratoires grâce à des protocoles de préparation définis pour les méthodes in vivo, en cerveau entier et en tranches.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant la détection précoce de composés inefficaces, réduisant ainsi les investissements dans des cibles non viables.
- Impact sur le portefeuille : Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque en reliant les résultats électrophysiologiques à la fonction au niveau des circuits.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en électrophysiologie et en techniques de dissection microchirurgicales pour une préparation cérébrale reproductible.
- Dépend de solutions d'enregistrement extracellulaires stables et d'un équipement de stimulation fonctionnel pour obtenir des réponses évoquées fiables.
- Exige une standardisation inter-équipes des paramètres de stimulation et des réglages d'enregistrement afin d'assurer la comparabilité des données.
- L'adaptation à différents systèmes modèles peut nécessiter des ajustements des méthodes de dissection et de mise en culture en fonction de la taille et de l'accessibilité du cerveau.
- Les limites pratiques incluent des taux de réussite dépendant de l'opérateur et une stabilité de la préparation au cours de séances d'enregistrement prolongées.
