Name: La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Découvrez comment déterminer la spécificité des protéases dans les extraits bruts de tissus de souris par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Cette méthode permet l'analyse simultanée de multiples échantillons.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu en partie par la subvention de recherche de l’Université Nihon pharmaceutique de Nihon Pharmaceutical University (2016) et le MEXT KAKENHI Grant nombre JP17854179.

Protocoles expérimentaux animaux ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Université Nihon Pharmaceutical et effectués conformément aux directives pour le soin et l’Use of Laboratory Animals de la Nihon University Pharmaceutical. Le protocole a été ajusté pour les extraits de tissus provenant de souris ICR. Souris ICR ont été achetés chez Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japon)
1. préparation du substrat marqué Iminobiotin
Le substrat subit une synthèse en phase solide à l’aide de groupe 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-acides aminés protégés tel que décrit ci-dessous11. Tableau 2 permet de déterminer le Fmoc-composé utilisé, selon le désiré d’acides aminés et le stade de synthèse.
<ol><li>Swill 0,2 g de résine Fmoc-NH-SAL avec 10 mL de N, N-diméthylformamide (DMF) dans une colonne de synthèse.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de pipéridine de 30 % dans le DMF. La solution pendant 10 min en conjonction avec le Fmoc-groupe de rock.</li>
	<li>
Vérifiez Fmoc clivage avec l’acide trinitrobenzènesulfonique (TNBS) tester12: ajouter 10 µL de 1 % tube de TNBS DMF et 10 µL de diisopropyléthylamine (DIPEA) pour un tube de verre de2 mm 10 x 75, puis transfert une petite quantité de résine sur le verre. La résine Fmoc-clivés doit développer une couleur orange.
	<ol>
<li>Répétez les étapes 1,2-1,3 si ce résultat est négatif.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laver la résine trois fois avec 5 mL de DMF.</li>
	<li>
Ajouter 5 mL de DMF contenant 0,3 mmol du Fmoc-composé figurant au tableau 2 (à partir du composé utilisé dans l’étape 1), 0,3 mmol de hexafluorophosphate de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hydroxy-1H-benzotriazole, monohydraté (HOBt) et 0,6 mmol de diisopropyléthylamine (DIPEA). Balancer la solution pendant 30 min à coupler avec la résine.
	<ol>
<li>Vérifier cette étape avec le test TNBS. Si le résultat est positif, cela signifie que la réaction n’a pas suffisamment progressé, et cette étape doit être répétée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laver la résine trois fois avec 5 mL de DMF.</li>
	<li>Répétez la réaction d’allongement en répétant les étapes 1,2 à 1,6, changeant le Fmoc-composé utilisé à l’étape 1.5 selon le tableau 2.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’eau de 2,5 %, 1 % éthanedithiol de triisopropylsilane (TIS) et de 2,5 % (EDT) dans l’acide trifluoroacétique en conjonction avec des peptides des résine et la protection des groupes. Roche la solution pendant 60 min.</li>
	<li>Filtrer et recueillir le filtrat dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 40 mL d’éthanol froid diéthylique et magasin du jour au lendemain à-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugeuse 4 000 x g à-20 ° C pendant 30 min. recueillir le culot.</li>
	<li>Utilisez un dessiccateur pendant 3 h pour éliminer l’éther.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’acétonitrile 50 % d’eau et dissoudre les peptides bruts. Lyophiliser la solution pour enlever l’acide trifluoroacétique. Répétez cette opération plusieurs fois.</li>
	<li>
Purifier les peptides utilisant une colonne C18 à cartouche.
	<ol>
<li>Activer la résine dans la colonne de cartouche C18 en utilisant les 3 mL d’acétonitrile (ACN).</li>
		<li>Équilibrer avec 5 mL d’ACN de 5 %, 0,1 % TFA dans H2O.</li>
		<li>Charger les peptides synthétiques bruts dans la colonne de cartouche C18.</li>
		<li>Laver avec 10 mL d’ACN de 5 %, 0,1 % TFA dans H2O.</li>
		<li>Éluer les échantillons avec 3 mL de 60 % ACN, 0,1 % TFA dans H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vérifiez les peptides en mesurant leur poids moléculaire par spectrométrie de masse MALDI-TOF.
	<ol>
<li>Pipetter 1 µL d’éluant sur une plaque de mire. Ajouter immédiatement la solution de (ACSSD) acide α-cyano-4-hydroxycinnamique saturée dans 50 % d’acétonitrile dans 0,1 % d’acide trifluoroacétique</li>
		<li>Cristalliser le mélange par séchage à l’air.</li>
		<li>Acquisition de spectres de masse des échantillons selon le protocole du fabricant de l’instrument.<ol>
<li>Régler manuellement le spectromètre de masse MALDI-TOF à un positif reflète mode.</li>
			<li>Calibrer le spectromètre de masse à l’aide de CHCA, bradykinine fragment 1-7 (monoisotopique moléculaire = Da 756.3997) et l’angiotensine II (monoisotopique moléculaire = Da 1,045.5423).</li>
			<li>Acquérir les spectres de masse de peptides synthétiques et ensuite évaluer par comparaison avec le poids moléculaire théorique.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation des extraits de tissus
<ol><li>Offrir une souris ICR mâles dans une chambre d’inhalation isoflurane et vérifier la profondeur de l’anesthésie par l’intermédiaire de pincement de l’orteil. Euthanasier les souris par dislocation cervicale.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux, faire une incision abdominale médiane à travers la peau, s’étendant jusqu'à le processus xiphoïde.</li>
	<li>Couper à travers la membrane et de recueillir tous les tissus pulmonaires. Couper le tissu en petits morceaux.</li>
	<li>Laver le tissu trois fois avec glacée 50 mM Tris salin (pH 7,4).</li>
	<li>Peser les tissus et les transfert environ 100 mg de tissus à un tube de verre de 12 x 75 mm2 .</li>
	<li>Ajouter 0,3 mL de tampon d’extraction (50 mM Tris-tampon pH 7,4, contenant 0,1 % éther d’octylphényle poly (oxyéthylène)).</li>
	<li>
Homogénéiser les échantillons de tissus pulmonaires à l’aide d’un mélangeur homogénéisateur.
	<ol>
<li>Laisser refroidir les échantillons sur la glace.</li>
		<li>Homogénéiser les échantillons à 20 000 tr/min pendant 30 s dans un mélangeur. Répétez cette étape jusqu'à ce que les échantillons soient parfaitement homogènes. Remarque : Ne pas homogénéiser pendant plus d’une minute en continu, afin d’éviter une augmentation de température.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer 1 000 µL de l’homogénat dans un tube de 1,5 mL et centrifuger pendant 5 min à 10 000 x g à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer 500 µL du liquide surnageant dans un nouveau tube en plastique de 1,5 mL.</li>
	<li>Utiliser 10 µL de l’échantillon pour déterminer la concentration de protéines, à l’aide de méthodes telles que le bicinchoninic acide (BCA) ou la méthode Coomassie brillant bleu (CBB).</li>
	<li>Pour éviter le gel, ajouter 80 % de glycérol pour les échantillons destinés à une concentration finale de 50 % de glycérol.</li>
	<li>Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.</li>
</ol>3. digestion des substrats en modèle protéase et des extraits de tissus
<ol><li>
Ajouter 10 µL de 0,1 µg/µL de N-tosyl-L-phénylalanine chlorométhyl cétone (TPCK)-trypsine, 0,1 µg/µL de protéase de Staphylococcus aureus V8 ou 10 µg/µL d’extraits de tissus en 890 µL d’un tampon de la digestion.
	<ol>
<li>Pour clarifier la différence de spécificité de protéase selon le pH, utiliser les tampons ajustés à pH 3, 5, 7 et 9. La composition de la mémoire tampon de digestion est indiquée dans le tableau 3.</li>
		<li>Effectuer un contrôle négatif à l’aide de protéase inactive dans les extraits de tissus, préparés par une incubation dans l’eau bouillante (ou chauffage à 100 ° C) pendant 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 10 µL de substrats marqués au iminobiotin (dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), concentration finale = 100 pmol/10 µL).</li>
	<li>Incuber pendant 3 heures à 37 ° C, pour digérer les substrats marqués iminobiotin.</li>
	<li>Après incubation, arrêter la digestion des supports à l’eau bouillante (ou par chauffage à 100 ° C) pendant 10 min.</li>
	<li>Centrifuger les substrats digérés pendant 5 min à 10 000 x g à 4 ° C.</li>
	<li>Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
</ol>4. la purification du substrat marqué Iminobiotin
<ol><li>
Ajouter 50 µL de streptavidine 50 % Sépharose perles dans 1 M Tris-tampon (pH 9) contenant 0,1 % poly (oxyéthylène) octylphényle l’éther.
	<ol>
<li>Papier réactif pH permet de s’assurer que la solution est autour de pH 9. Si le pH de la solution est faible, le réglage à environ pH 9 en ajoutant 1 M Tris-tampon (pH 9) contenant 0,1 % poly (oxyéthylène) octylphényle l’éther. Cette étape est importante, car elle implique la liaison du substrat de streptavidine marquée iminobiotin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber une nuit à 4 ° C, avec un mélange doux continu sur une roue rotator pour lier les substrats marqués au iminobiotin à la streptavidine. Les perles doivent rester suspendus tout au long de l’incubation.</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g à 4 ° C. Retirez le surnageant.</li>
	<li>
Laver les perles cinq fois comme suit :
	<ol>
<li>Ajouter 1 000 µL d’un tampon de lavage (50 mM Tris-tampon à pH 9) aux talons.</li>
		<li>Se laver pendant 10 min à 4 ° C, avec un mélange doux continu sur une roue de rotator. Les perles doivent rester suspendus tout au long de l’incubation.</li>
		<li>Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g à 4 ° C et éliminer le surnageant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ajouter 100 µL de 0,2 % d’acide trifluoroacétique aux talons.
	<ol>
<li>Utilisez du papier pH test pour s’assurer que la solution est en dessous de pH 2. Si le pH de la solution est élevé, ajuster le pH à moins de 2 en ajoutant 1 % d’acide trifluoroacétique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber 30 min à température ambiante avec un mélange doux continu sur une roue de rotator.</li>
	<li>Centrifuger pendant 1 min à 10 000 x g à 4 ° C, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
</ol>5. préparation des échantillons et spectrométrie de désorption-ionisation Laser assistée par matrice Time-of-Flight masse (spectrométrie de masse MALDI-TOF)
Remarque : Toutes les solutions dans les étapes suivantes doivent être préparées avec la chromatographie liquide haute performance (HPLC)-eau de séquençage-grade grade ou d’acides aminés.
<ol><li>Pipeter 500 µL de l’acétonitrile sur une résine C18 pour l’activer. Supprimer l’acétonitrile utilisé. Répétez cette opération trois fois.</li>
	<li>Equilibrer la résine C18 avec 100 µL de 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Supprimer l’éluant. Répétez cette opération trois fois.</li>
	<li>Pour charger les échantillons, lier les échantillons à la résine à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Laver la résine avec 20 µL de 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Répétez cette opération cinq fois.</li>
	<li>Éluer les échantillons avec 3 µL de 60 % d’acétonitrile dans 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Pipette de l’éluant sur une plaque de mire pour la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Immédiatement ajouter saturée solution de (ACSSD) acide α-cyano-4-hydroxycinnamique dans 50 % d’acétonitrile dans 0,1 % d’acide trifluoroacétique.</li>
	<li>Cristalliser le mélange par séchage à l’air.</li>
	<li>
Acquisition de spectres de masse des échantillons selon le protocole du fabricant de l’instrument.
	<ol>
<li>Régler manuellement le spectromètre de masse MALDI-TOF à un positif reflète mode.</li>
		<li>Calibrer le spectromètre de masse à l’aide de CHCA, bradykinine fragment 1-7 (monoisotopique moléculaire = Da 756.3997) et l’angiotensine II (monoisotopique moléculaire = Da 1,045.5423).</li>
		<li>Acquisition de spectres de masse des échantillons, très attentif aux spectres de masse de 700 à 900 Da pour la forme clivée des substrats marqués à la biotine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifier les pics détectés à l’aide du tableau 1. Détection de poids moléculaire approprié indique un clivage à l’extrémité C-terminale de l’acide aminé pertinente.</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
<li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li>
<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Ce protocole utilise la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour identifier la spécificité de la protéase dans les échantillons bruts provenant d’extraits de tissus et peut facilement être ajustée vers le haut pour le traitement des échantillons multiples. En particulier, nous avons manipulé le pH afin de provoquer un changement de spécificité de substrat.
La méthode avidine-biotine complexe (ABC), qui a été largement utilisée en biochimie en raison de sa spécificité de liaison, a été utilisée da...

Protéases régulent les processus physiologiques par clivage des protéines, et l’initiation de l’activité de la protéase à certains moments et endroits est réglé1. Il est donc important d’identifier l’expression et l’activité des tissus qui sont réglementés localement et de développer une nouvelle méthode pour détecter les protéases. La méthode proposée dans la présente étude vise à identifier la spécificité de la protéase en parallèle afin de détecter les protéases.
Il y a quelques méthodes pour détecter la spécificité de la protéase. La méthode azocaséine est bien connue pour son utilisation dans la détection des protéases2 mais est limitée dans sa capacité à obtenir des informations complémentaires. Zymographie est une autre méthode de détection de protéase complète qui peut être utilisée pour déterminer le poids moléculaire de protéases3, mais il ne peut pas servir à examiner la spécificité de substrat. Spécificité de protéase peut être déterminée par les analyses spectrométriques, en utilisant des substrats tels que p-nitroanilide4et essais fluorimétrique, à l’aide de substrats de coumarine5 ou Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) essais6. Ces méthodes permettent la détection de single-spécificité des substrats contenues dans un seul puits. Dans la présente étude, la spécificité de la protéase des extraits de tissus est examinée dans diverses conditions, car ces extraits contiennent plusieurs protéases. Activité de la protéase est régie par plusieurs facteurs, notamment le pH, coenzymes, groupes prosthétiques et force ionique. Récemment, des méthodes axées sur la protéomique ont été utilisés pour identifier la spécificité de la protéase ; par exemple, la méthode mentionnée par Biniossek et al. 7 le protéome pour déterminer la spécificité de substrat même dans des extraits bruts et permet une détermination précise de l’activité de clivage des protéases qui tiennent compte de plusieurs acides aminés séquences8. Toutefois, cette méthode ne consiste pas pour l’analyse de nombreux échantillons. En revanche, notre méthode permet le traitement simultané de plusieurs échantillons et l’utilisation de Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) spectrométrie de masse pour l’analyse de l’échantillon facilite la détection rapide et facile de la clivés substrats.
Le présent document décrit une méthode permettant d’évaluer la spécificité de protéase à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour mesurer le poids moléculaire de substrats uniques. Les formes moléculaires de substrats clivés, ainsi que leurs poids moléculaires théoriques, sont indiquées dans la Figure 1 et tableau 1. Des études antérieures ont utilisé des substrats contenant polyglycine entretoises et biotine9; Toutefois, ces substrats sont imparfaites parce que la séquence de polyglycine peut être clivée par des enzymes qui reconnaissent la séquence glycine. En outre, la forte affinité entre l’avidine et biotine peut conduire à un taux de récupération faible. Afin d’améliorer ces inconvénients, dans cette étude, que nous avons synthétisé un support unique qui était composé de polyéthylène glycol (PEG), iminobiotin et un acide aminé qui pouvait identifier le site de clivage (Figure 1). D’établir une discrimination entre les acides aminés de poids moléculaires semblables, la D-sérine a été ajoutée entre l’entretoise de PEG et de l’acide aminé du site clivées.
Le N-terminal du substrat a été marqué avec iminobiotin, qui permet la purification d’affinité des échantillons bruts. L’utilisation d’iminobiotin au lieu de biotine est critique ; Biotine a une forte affinité avec l’avidine, qui se traduit par des faibles taux de récupération des substrats biotine-étiquetés de la résine de l’avidine, tandis que l’affinité d’iminobiotin pour l’avidine peut être modifiée par pH. Marqué Iminobiotin substrats seront liera à avidine dans des conditions au-dessus de pH 9, tandis qu’avidine libère des substrats marqués au iminobiotin en conditions en dessous de pH 4. Par conséquent, iminobiotin a été utilisé pour affinité purification10. En résumé, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour détecter les spécificité de protéase en utilisant des substrats uniques.

<table><tbody><tr><td>Résine Fmoc-NH-SAL (-[2,4-Diméthoxyphényl-N-(9-fluorénylméthoxycarbonyle) résine aminométhyl]phénoxy)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide (DMF)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>pipéridine</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>acide trinitrobenzènesulfonique (TNBS)</td><td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HCTU)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxy-1H-benzotriazole, monohydraté (HOBt)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropyléthylamine (DIPEA)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropylsilane (TIS)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>acide trifluoroacétique (TFA)</td><td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>acétonitrile</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18</td><td>cartouche colonne Eaux</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>poly(oxyéthylène) octylphényléther</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>mélange homogénéisateur</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>Homogénéisateur Polytron</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosyl-L-phénylalanine chlorométhylcétone (TPCK)-trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>streptavidine sépharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>Acide ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF spectrométrie de masse</td><td>Bruker Daltonics, Allemagne</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés Fmoc</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse maldi-tof : manipulation ph afin de provoquer des modifications de la spécificité

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Protéases ont plusieurs fonctions biologiques, y compris la digestion des protéines activation/inactivation et la nourriture. Identifier la spécificité de la protéase est important pour avoir révélé les fonction de protéase. La méthode proposée dans la présente étude détermine la spécificité de la protéase en mesurant le poids moléculaire de substrats uniques à l’aide de désorption/ionisation Laser assistée par matrice spectrométrie de masse à temps de vol (MALDI-TOF). Les substrats contiennent des iminobiotin, tandis que le site clivé est composé d’acides aminés et l’entretoise est constitué de polyéthylène glycol. Le substrat clivé générera un poids moléculaire unique à l’aide d’un acide aminé clivé. L’un des mérites de cette méthode est qu’elle peut être réalisée dans un pot à l’aide d’échantillons bruts, et il est également approprié pour l’évaluation des échantillons multiples. Dans cet article, nous décrivons une méthode expérimentale simple optimisée avec des échantillons extraits de tissus pulmonaires de souris, y compris l’extraction tissulaire, placement des substrats digestifs dans des échantillons, purification des substrats digestifs dans des conditions de pH différents et mesure le poids moléculaire des substrats par spectrométrie de masse MALDI-TOF. En résumé, cette technique permet l’identification de la spécificité de la protéase dans les échantillons bruts provenant d’extraits de tissus à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF, qui peut facilement être ajustée vers le haut pour le traitement des échantillons multiples.

Évaluation de la méthode d’identification de la spécificité de la protéase de protéase de modèle
L’efficacité de ce système a été évaluée à l’aide de TPCK-trypsine et protéase V8, dont spécificités de substrat ont été obtenues. TPCK-trypsine et protéase V8 ont été estimées en conjonction avec la séquence d’acides aminés au C-terminal des résidus lysine et arginine et du côté de carboxy des résidus d’acide glutamique, acide aspartiq...

Nous présentons ici un protocole pour déterminer la spécificité de la protéase dans les tissus de souris brut extraits par spectrométrie de MALDI-TOF.

La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

L’objectif global de cette expérience est de déterminer la spécificité de la protéase dans plusieurs extraits bruts. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour déterminer la spécificité de la protéase. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier la spécificité de la protéase de plusieurs échantillons en parlay.Échantillons de tissus pulmonaires froids obtenus à partir de souris ICR mâles dans de la glace. Homogénéiser les échantillons à 20 000 RMP pendant 30 secondes dans un mélangeur. Répétez cette étape jusqu’à ce que les échantillons soient complètement homogènes.Ne pas homogénéiser plus d’une minute en continu afin d’éviter une augmentation de la température. Transférez 1 000 microlitres d’homogénat dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez pendant cinq minutes à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Transférez 500 microlitres de surnageant dans un nouveau tube en plastique de 1,5 millilitre.Utilisez 10 microlitres de l’échantillon pour déterminer la concentration en protéines. À l’aide de méthodes, telles que le dosage de l’acide bicinchoninique ou le dosage de Bradford. Pour éviter le gel, ajoutez 80 % de glycérol aux échantillons pour une concentration finale de 50 % de glycérol.Pour clarifier la différence de spécificité de la protéase en fonction du pH, utilisez des tampons de digestion ajustés aux pH trois, cinq, sept et neuf. Dans 890 microlitres d’un tampon de digestion, ajoutez soit 10 microlitres de 0,1 microgramme par microlitre ou de trypsine TPCK, soit 0,1 microgramme par microlitre de protéase V8 de staphylocoque doré, soit 10 microgrammes par microlitre d’extraits de tissus. Préparez des contrôles négatifs en inactivant la protéase dans les extraits de tissus par incubation et en faisant bouillir de l’eau pendant 10 minutes.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de substrats de biotine MNO aux échantillons et incubez pendant trois heures à 37 degrés Celsius pour digérer. Après l’incubation, arrêtez la digestion des substrats avec de l’eau bouillante pendant 10 minutes. Centrifugez les substrats digérés pendant cinq minutes à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius.Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 50 millilitres de billes de sépharose à 50 % de streptavidine dans un tampon molaire tris, contenant 0,1 % de polyoxyéthylène octylphényléther . Utilisez du papier réactif pour vous assurer que la solution est autour du pH neuf.Il est important d’ajuster le bon pH à neuf ou plus. L’aminobiotine ne peut pas mordre une perle à moins qu’elle n’ait un pH de neuf ou plus. Si le pH de la solution est bas, ajustez-le à environ pH neuf en ajoutant plus de tampon.De plus, un tampon molaire peut être ajouté pour augmenter le pH si nécessaire. Incuber la suspension pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un mélange doux continu sur une roue rotative pour lier les substrats marqués à la biotine MNO à la streptavidine. Les billes doivent rester en suspension tout au long de l’incubation.Le lendemain, centrifugez les échantillons pendant une minute à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, lavez les billes en ajoutant 1 000 microlitres d’un tampon de lavage. Ensuite, incubez pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec un mélange doux et continu sur un rotateur.Centrifugez les billes pendant une minute à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et répétez ce lavage quatre fois. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,2 % aux billes.Utilisez du papier réactif pour vous assurer que la solution est inférieure au pH deux. Si le pH de la solution est élevé, ajustez le pH en dessous de deux en ajoutant 1 % d’acide trifluoroacétique. Incuber la suspension pendant 30 minutes à température ambiante avec un mélange doux et continu sur une roue rotative.Après avoir centrifugé les billes comme précédemment, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Pipetez 20 microlitres d’acétonitrile sur une résine C18 pour l’activer. Retirez l’acétonitrile usagé et répétez cette étape d’activation trois fois.Ensuite, équilibrez la résine C18 avec 20 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 %. Retirez l’éluant et répétez cette étape d’équilibrage trois fois. Pour charger les échantillons, fixez-les à la résine à l’aide d’une pipette.Lavez la résine avec 20 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 %. Répétez cette étape cinq fois. Éluer les échantillons avec trois microlitres d’acétonitrile à 60 % dans de l’acide trifluoroacétique à 0,1 %.Pipeter l’éluant sur une plaque cible pour la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Ajouter immédiatement la solution CHCA, saturée en 50 % d’acétonitrile et en 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Cristalliser le mélange par séchage à l’air.Acquérir les spectres de masse des échantillons, selon le protocole du fabricant de l’instrument, en accordant une attention particulière aux spectres de masse de 700 à 900 daltons pour la forme clivée des substrats des marqueurs de biotine. Les spectres de masse des substrats synthétiques sont présentés ici. Des pics correspondant à la masse moléculaire du précurseur ont été détectés entre 850 et 1 050.Les fragments clivés sont détectés dans la gamme de 700 à 850. Voici les spectres des substrats marqués à la biotine MNO traités avec de la trypsine TPCK. Les pics de 839,81 daltons et 796,76 daltons correspondent aux fragments clivés de l’extrémité C de la lysine et de l’arginine respectivement.Voici les spectres de masse des substrats synthétiques digérés avec la protéase V8. Les pics de 769,78 daltons et 755,62 daltons correspondent aux fragments clivés de l’extrémité C de l’acide glutamique et de l’acide aspartique respectivement. Les spectres des substrats de marquage à la biotine MNO traités avec un extrait de tissu pulmonaire à diverses conditions de pH sont présentés ici.À l’état acide, à un pH cinq, le poids moléculaire d’un fragment clivé était de 770,13 daltons et 826,66 daltons, indiquant un clivage à l’extrémité C de l’acide glutamique et du tryptophane. À l’état neutre et basique, à pH sept et neuf, le poids moléculaire d’un fragment clivé a augmenté au pic de 767 daltons et 840 daltons, indiquant clivé à l’extrémité C de l’arginine et de la lysine. À l’inverse, les pics d’acide glutamique et de tryptophane ont diminué.De plus, cette méthode ne permet pas de détecter les fragments clivés avec des extraits inactivés. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en deux jours si elle est bien réalisée, sauf pour la synthèse de substrat. De plus, une fois le substrat synthétisé, il peut être mesuré dans plusieurs échantillons. Pourquoi?En essayant cette procédure, il est important de se rappeler de fonctionner au pH tampon, environ neuf. Généralement, la réaction du complexe avidine amino-biotine. Suite à cette procédure, il est possible de quantifier l’activité enzymatique en effectuant une CMS.Cette méthode permettra aux chercheurs dans le domaine des protéons d’ouvrir la voie à l’exploration de l’expression de la protéase dans plusieurs conditions.

the-determination-protease-specificity-mouse-tissue-extracts-maldi

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Composés de capture sont trifonctionnel petites molécules afin de réduire la complexité du protéome par fonctionnels réversibles petite molécule de protéine d'interaction suivie par la photo-réticulation et de purification. Ici, nous utilisons un composé de capture avec...

Profilage de la méthyltransférase et autres S-Adénosyl- L-Homocystéine protéines liant par spectrométrie de masse de captation composé (CDSM)

Le second messager omniprésent c-di-GMP contrôle la croissance et le comportement de nombreuses bactéries. Nous avons mis au point une nouvelle technologie basée sur la spectrométrie de masse des composés de capture pour identifier et caractériser biochimiquement les protéines de liaison c-di-GMP dans pratiquement toutes les espèces bactériennes.

Captation composé spectrométrie de masse - un outil puissant pour identifier de nouveaux c-di-GMP protéines effectrices

Les réseaux de peptides synthétisés par la méthode SPOT peuvent être utilisés pour analyser la spécificité du substrat des protéines lysine méthyltransférases (PKMT) et pour définir le spectre du substrat des PKMT afin de comprendre leur rôle biologique. Ce protocole décrit comment synthétiser des réseaux de peptides, les méthyler avec des PKMT et analyser les résultats.

Spécificité Analyse des protéines lysine Methyltransferases Utilisation SPOT Peptide Arrays

Nous présentons ici un protocole pour effectuer le polysome profilage sur le cœur isolé perfusé souris. Nous décrivons des méthodes pour la perfusion cardiaque polysome profilage et analyse des fractions polysome en ce qui concerne les ARNm, miARN et le protéome polysome.

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

Ce flux de travail décrit la performance de l’enrichissement rentable et temporel de multiples modifications post-traductionnelle (PTM) de protéines simultanément pour l’analyse protéomique globale quantitative. Le protocole utilise l’enrichissement ptM de niveau peptidique avec de multiples anticorps conjugués, suivi d’une analyse de spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données pour obtenir des connaissances biologiques sur le crosstalk PTM.

Enrichissement simultané d’affinité de deux modifications post-traductionnelle pour la quantification et la localisation des sites

Ce protocole couvre une analyse détaillée de la composition du peptidoglycane à l’aide de la spectrométrie de masse par chromatographie liquide couplée à un logiciel avancé d’extraction de caractéristiques et d’analyse bioinformatique.

Analyse semi-quantitative du peptidoglycane par chromatographie liquide Spectrométrie de masse et bioinformatique

Ce protocole décrit comment effectuer le marquage de protéines spécifiques au type cellulaire avec l’azidonorleucine (ANL) à l’aide d’une lignée de souris exprimant une synthétase d’ARNt L274G-méthionine mutante (MetRS*) et les étapes nécessaires pour isoler des protéines marquées spécifiques au type cellulaire. Nous décrivons deux voies d’administration possibles d’ANL chez des souris vivantes par (1) l’eau potable et (2) les injections intrapéritonéales.

Purification et identification de protéines spécifiques de type cellulaire à partir de tissus complexes à l’aide d’une lignée de souris mutante d’ARNt synthétase de méthionine

Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement des phosphoprotéines phosphatases endogènes et de leurs protéines en interaction à partir de cellules et de tissus et leur identification et quantification par spectrométrie de masse protéomique.

Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs

Nous présentons un protocole pour identifier et quantifier les composants dans des mélanges d’espèces possédant des protéines similaires. La spectrométrie de masse détecte les peptides pour l’identification et donne une quantification relative par des rapports de surfaces de pics. En tant qu’outil de détection des fraudes, la méthode peut détecter 1 % de cheval dans le bœuf.

Détermination des espèces et Quantification en mélanges utilisant la spectrométrie de masse MRM de Peptides appliquée à l&#39;authentification de la viande

Découvrez comment déterminer la spécificité des protéases dans les extraits bruts de tissus de souris par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Cette méthode permet l'analyse simultanée de multiples échantillons.

La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité (Vidéo) | JoVE Journal

La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité

Explorer plus de vidéos