Name: MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Découvrez la préparation de bibliothèques d'ADN complémentaire pour le séquençage de microARN rétrospectif à partir de tissus fixés au formol et inclus en paraffine. Cette méthode permet l'analyse de spécimens archivés jusqu'à 35 ans pour la découverte de biomarqueurs.

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Nous remercions le Dr Thomas Tuschl, chef du laboratoire de biologie moléculaire des ARN, ainsi que des membres de son laboratoire pour leur soutien et pour le partage de la technologie mise au point dans son laboratoire et de la fourniture d’accès à l’oléoduc WashableMarker. Nous remercions également le Dr Markus Hafner partage son protocole et de fournir des descriptions détaillées sur toutes les étapes biochimiques et enzymatiques utilisées dans sa procédure initiale.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs tiennent à divulguer qu’une publication contenant certaines données présentées dans ce manuscrit a été publiée dans la revue internationale des Sciences moléculaires par Loudig et al. 21.

Un protocole de préparation de bibliothèque cDNA hautement reproductible et robustes pour NGS de petits ARN archivées dans des échantillons FFPE ARN est présenté dans ce protocole, qui est une version modifiée et optimisée de la procédure décrite par Hafner et al. 22
Toutes les étapes de ce protocole ont été optimisés pour une utilisation avec ancien archivé et compromis l’ARN total extraite des échantillons FFPE. L’étape clé du présent protocole, pour le trait...

miARN est remarquablement bien conservés dans fixés au formol paraffine (FFIP) échantillons1,2,3. Travaux antérieur ont démontré que l’expression de ces courtes réglementaire non codantes unique échoués des molécules d’ARN peut être évalué avec succès à l’aide de l’ARN total des échantillons FFPE et fournir des données pertinentes d’expression par rapport à l’original frais tissus4,5,6,7,8. Par rapport aux ARN messagers de grande taille, qui se sont révélés d’être gravement affectés par FFIP traitement tissulaire (formaldéhyde, chaleur, dessiccation, etc.), des ribonucléases endogènes et l’âge des spécimens, la petite taille des miARN (~ 18 – 24 nucléotides) s’affiche pour les rendre résistants à la dégradation et résilient pour l’entreposage à long terme, a également démontré par des études d’expression de miRNA qui surpassent les études ADN messagère haut débit dans les spécimens archivés9. les études d’expression de miRNA archivés sur des échantillons cliniques, qui ont principalement été réalisées dans les analyses à petite échelle, ont démontré que seul ou multiplexé des analyses par PCR quantitatives, différents types de microarray technologies et plus récemment NGS peut servir à évaluer l’expression des miARN préservée après l’optimisation de ces dosages10,11,12,13,14.
Étant donné que le dérèglement de miRNA expression a été associé au développement d’une variété de cancers humains et qu’il y a potentiellement une offre énorme de cliniquement annoté spécimens archivés, il est devenu évident que ces petits ARN molécules représentent une source prometteuse de potentiels du cancer biomarqueurs15,16,17,18. L’utilisation d’une technologie d’expression de gène de haut-débit comme NGS a l’avantage de fournir une évaluation globale de toutes les transcriptions de miRNA par rapport aux technologies ciblées comme la PCR et/ou microarrays19. Pour cette raison, un protocole optimisé, abordable et facilement applicable pour la préparation de bibliothèque de cDNA de petits ARN de plus vieux spécimens archivés pour NGS a été optimisé pour permettre des études rétrospectives à grande échelle de20.
Nous avons déjà établi un protocole d’extraction d’ARN/ADN simultané pour restauration séparée de l’ARN et l’ADN de plus vieux spécimens archivés, que nous avons trouvées pour surpasser les kits commerciaux contemporains21. À l’aide de ce protocole d’extraction, d’obtenir l’ARN total de tissus FFPE archivées pendant une période prolongée de temps, nous avons optimisé la préparation de banques d’ADNc pour NGS des miARN préservés dans les échantillons cliniques jusqu'à 35 ans. En outre, dans une étude récemment publiée, où nous avons préparé des banques d’ADNc de cliniquement classés carcinome canalaire in situ des spécimens (CCIS), nous avons identifié des miARN différentiellement exprimés qui ont été validées par PCR quantitative, qui indiquait que modifications de l’expression miRNA spécifiques peuvent être détectables dans les lésions de la CCIS de patients qui développent un cancer du sein par rapport aux lésions de la CCIS de patients qui ne développent pas de cancer du sein.
Si l'on considère le coût des trousses commerciales pour la préparation de petites banques d’ADNc de RNA, le potentiel de leur arrêt, ainsi que l’utilisation de réactifs/brevet protégé qui ne peut pas être optimisée, nous avons décidé d’adapter un publiées antérieurement en laboratoire et sans kit de 3' Protocole bibliothèque préparation d’ADNc avec code à barres pour NGS de petits ARN archivées dans des échantillons FFPE, permettant l’analyse simultanée de 18 échantillons22. Ce protocole prévoit une procédure étape par étape idéale et robuste avec points de contrôle visuel et l’évaluation technique, qui critiquaient pour adaptation aux spécimens d’ARN FFIP, et a un fort potentiel d’application à d’autres sources de compromis ou difficile d’utiliser le matériel de RNA. Applicabilité du protocole original a été améliorée en remplaçant les marqueurs de taille marquée radioactivement avec fluorescentes (p. ex., SYBR Gold) détectables marqueurs de taille de RNA utilisés lors de la sélection des bibliothèques ligaturés sur grands gels de polyacrylamide. Ce protocole optimisé repose sur la ligature de barcoded adaptateurs de 3' à 18 échantillons FFPE RNA individuels, qui sont alors regroupées ensemble pour subir une ligature des adaptateur 5', transcription inverse, ainsi qu’une analyse PCR pilote pour adapté l’amplification de l’ADNc final Bibliothèque avant amplification PCR à grande échelle, purification et NGS sur un séquenceur haut débit.

<table><tbody><tr><td>1 % Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt échelle</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml Sérum de bovin</td><td>Albumine Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Titane Taq</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL Système d’électrophorèse vertical sur gel avec plaques de verre et peignes</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse Eppendorf 5424R</td><td>USA scientifique</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixeur</td><td>USA scientifique</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade ; Tubes de microcentrifugation siliconés à faible rétention 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Tube briseur de gel 0,5 ml</td><td>IST Engineering Inc,3388-100</td><td></td><td></td> Appareil d’électrophorèse</tr><tr><td>sur gel 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT avec plateaux de gel et peignes</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge centrifugeuse personnelle à double rotor</td><td>USA scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Modèle V16 appareil d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, lunettes, peignes et espaceurs</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides</td><td></td><td>IDT Défini lors de la commande</td><td></td></tr><tr><td>Owl EasyCast B2 mini système d’électrophorèse - avec plateaux de gel et peignes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme de restriction PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans RNase</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 transilluminateur de lumière bleue</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agarose</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III kit de transcription inverse</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2 Tronqué K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Themocycler avec couvercle chauffant</td><td>Applied Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel system concentré, diluant et tampon</td><td>National Diagnostic</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

microarn rétrospective séquençage : l’adn complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’arn de paraffine fixés au formol

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

– Archivés, classés cliniquement fixés au formol paraffine des tissus (FFIP) peuvent fournir des acides nucléiques pour des études rétrospectives et moléculaires du développement du cancer. En utilisant des lésions non invasives ou précancéreuses chez des patients qui développent plus tard une maladie invasive, analyses d’expression génique peuvent aider à identifier des altérations moléculaires précoces qui prédisposent au risque de cancer. Il a été bien décrit qu’acides nucléiques extraits des tissus FFPE ont subi de graves dommages physiques et des modifications chimiques, qui compliquent leur analyse et exige généralement des dosages adaptés. Cependant, microARN (miARN), qui représentent une petite classe de molécules d’ARN s’étendant sur plus de ~ 18 – 24 nucléotides, auraient dû être divulgués à résister au stockage à long terme et ont été analysés avec succès dans des échantillons FFPE. Nous présentons ici un 3' avec code à barres ADN (cDNA) Bibliothèque préparation au protocole complémentaire spécialement optimisé pour l’analyse de petits ARN extraites des tissus archivés, qui a été récemment démontrée pour être robuste et hautement reproductible lors de l’utilisation archivées échantillons cliniques stockées jusqu'à 35 ans. Cette préparation de bibliothèque est bien adaptée à l’analyse multiplex de matériel compromise/dégradé où les échantillons d’ARN (jusqu'à 18) sont ligaturés avec barcoded adaptateurs individuels de 3' et ensuite regroupées ensemble pour les préparations enzymatiques et biochimiques avant l’analyse. Toutes les purifications sont effectuées par sur gel de polyacrylamide (PAGE), qui permet des sélections de taille spécifique et enrichissements de petites espèces d’ARN avec code à barres. Cette préparation de bibliothèques d’ADNc est bien adaptée aux entrées de RNA minutes, comme une réaction en chaîne par polymérase pilote (PCR) permet la détermination d’un cycle d’amplification spécifique produire des quantités optimales de matériel pour l’ordonnancement de prochaine génération (NGS). Cette approche a été optimisée pour l’utilisation des dégradés FFIP ARN des spécimens archivés jusqu'à 35 ans et fournit des données hautement reproductibles de l’end.

Comme décrit dans la méthode ici, un total de 18 échantillons FFPE RNA individuels (100 ng de chacun) sont mis en place dans des tubes distincts pour subir 3' adenylated avec code à barres oligonucléotide T4 ligature du jour au lendemain. Le lendemain, les réactions enzymatiques sont chaleur-désactivée, combinées et précipitées dans un seul tube. Le culot de RNA est remis en suspension et les molécules d’ARN ligaturés sont séparés sur gel de polyacrylamide (PAGE), où les marqueurs de tail...

Fixés au formol des spécimens de paraffine représentent une source précieuse de biomarqueurs moléculaires des maladies humaines. Nous présentons ici un protocole de préparation du bibliothèque de cDNA en laboratoire, initialement conçu avec de l’ARN congelée fraîche et optimisé pour l’analyse des microARN archivés des tissus conservés jusqu'à 35 ans.

MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

L’objectif global de la préparation de cette banque d’ADNC est de permettre le séquençage réussi de petits ARN qui ont été stockés dans des tissus formels et fixés inclus dans de la paraffine. Cette méthode est très utile pour l’analyse d’échantillons formels et fixés enrobés de paraffine. Vous extrayez l’ARN d’un maximum de 18 échantillons, vous analysez le contenu de tous ces échantillons et obtenez un profil de toutes les microRNases pour tous les échantillons.Pour commencer le protocole, ajoutez 8,5 microlitres de mélange maître de ligature préalablement préparé à chacun des 18 échantillons FFPERNA aliquote individuellement. Agitez doucement les tubes et centrifugez pendant deux secondes. Après la centrifugation, stockez les tubes sur de la glace.À l’aide d’une pipette de trois microlitres, transférez un microlitre de chaque adaptateur vers les échantillons FFPERNA correspondants contenant de l’ARN et un mélange maître de ligature. Ne pipetez pas de haut en bas et ne changez pas d’embouts entre les échantillons FFPERNA. Fermez chaque tube, effleurez-les pour mélanger et centrifugez-les pendant deux secondes.Placez les tubes sur de la glace. Dénaturez les réactions en plaçant le

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Nous décrivons une méthode ciblée basée sur le séquençage de l’ARN qui comprend la préparation de banques d’ADNc indexées, l’hybridation et la capture avec des sondes personnalisées et l’analyse de données pour interroger les transcrits sélectionnés pour l’expression génique, les mutations et les fusions de gènes. Le RNAseq ciblé permet une évaluation rapide et rentable des transcrits sélectionnés sur un séquenceur de bureau.

Ciblées ARN Séquençage Assay pour caractériser l&#39;expression génique et génomique Transformations

Ce protocole d’extraction modifié améliore les rendements en ARN et en ADN à partir de régions d’intérêt plus précisément ciblées dans les blocs de tissus histopathologiques.

Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d&#39;extraction d&#39;ADN

Ce protocole donne un aperçu des procédures d’isolement d’ARN pour le profilage de transcriptomique des tissus ganglionnaires de grands animaux, y compris les étapes dans l’identification et l’excision des ganglions lymphatiques du bétail et la faune, échantillonnage des approches pour assurer la cohérence entre plusieurs animaux et des considérations plus des résultats représentatifs pour la préservation de l’après la collecte et le traitement aux fins d’analyse de RNA.

Collecte et traitement des ganglions lymphatiques des animaux de grande taille pour l’analyse de l’ARN : préparation pour l’étude de transcriptomique ganglion des grandes espèces animales

Le présent protocole aux chercheurs un nouvel outil pour surveiller la fidélité de la transcription dans plusieurs organismes modèles.

Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes

Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN non codants qui peuvent avoir des rôles dans la régulation transcriptionnelle et la médiation des interactions entre les protéines. Après l'évaluation de différents paramètres pour la construction des bibliothèques de séquençage circRNA, un protocole a été compilé utilisant la préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et est présenté ici.

Identification des ARN circulaires à l'aide du séquençage de l'ARN

Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d'ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2'-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l'aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.

Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

La résistance de thérapie se développe souvent dans les patients présentant le cancer de la prostate avancé, et dans certains cas, le cancer progresse à un sous-type mortel appelé cancer de la prostate neuroendocrine. L'évaluation des petits changements moléculaires non codants à médiation d'ARN qui facilitent cette transition permettrait une meilleure stratification de la maladie et l'identification des mécanismes causals qui mènent au développement du cancer de la prostate neuroendocrine.

Séquençage de petits ARN non codants à partir de tissus fixeds et d'exosomes dérivés du sérum provenant de patients atteints d'un cancer de la prostate résistant à la castration

Nous décrivons une technique de profilage des microARN chez les premiers embryons de souris. Ce protocole surmonte le défi de l’entrée de cellules faibles et de l’enrichissement de l’ARN. Ce test peut être utilisé pour analyser les changements dans l’expression miRNA au fil du temps dans différentes lignées cellulaires de l’embryon de souris précoce.

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

Ce protocole décrit une méthode pour isoler l’ARN à partir de régions histologiques définies de tissu hépatique de souris fixé au paraformaldéhyde et à la température optimale de coupe, en utilisant une microdissection par capture laser, permettant une analyse ciblée de l’expression génique en aval.

Microdissection par capture laser du tissu hépatique de souris fixé au paraformodéhyde pour l’analyse de l’ARN

Nous présentons ici un protocole pour enquêter sur génome large méthylation de l'ADN dans les études de patients cliniques à grande échelle de dépistage en utilisant le séquençage de l'ADN méthyl-Binding Capture (MBDCap-seq ou MBD-seq) la technologie et de la bioinformatique ultérieures analyse pipeline.

Méthyl-liaison par capture d&#39;ADN de séquençage pour les tissus du patient

Découvrez la préparation de bibliothèques d'ADN complémentaire pour le séquençage de microARN rétrospectif à partir de tissus fixés au formol et inclus en paraffine. Cette méthode permet l'analyse de spécimens archivés jusqu'à 35 ans pour la découverte de biomarqueurs.

MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol (Vidéo) | JoVE Journal

MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol

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