MicroARN rétrospective séquençage : L’ADN complémentaire bibliothèque protocole de préparation à l’aide de spécimens d’ARN de paraffine fixés au formol

L’objectif global de la préparation de cette banque d’ADNC est de permettre le séquençage réussi de petits ARN qui ont été stockés dans des tissus formels et fixés inclus dans de la paraffine. Cette méthode est très utile pour l’analyse d’échantillons formels et fixés enrobés de paraffine. Vous extrayez l’ARN d’un maximum de 18 échantillons, vous analysez le contenu de tous ces échantillons et obtenez un profil de toutes les microRNases pour tous les échantillons.

Pour commencer le protocole, ajoutez 8,5 microlitres de mélange maître de ligature préalablement préparé à chacun des 18 échantillons FFPERNA aliquote individuellement. Agitez doucement les tubes et centrifugez pendant deux secondes. Après la centrifugation, stockez les tubes sur de la glace.

À l’aide d’une pipette de trois microlitres, transférez un microlitre de chaque adaptateur vers les échantillons FFPERNA correspondants contenant de l’ARN et un mélange maître de ligature. Ne pipetez pas de haut en bas et ne changez pas d’embouts entre les échantillons FFPERNA. Fermez chaque tube, effleurez-les pour mélanger et centrifugez-les pendant deux secondes.

Placez les tubes sur de la glace. Dénaturez les réactions en plaçant les tubes sur un bloc de chaleur à 90 degrés Celsius pendant une minute, puis placez-les immédiatement sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une pipette de trois microlitres, transférez un microlitre de l’enzyme de ligature diluée dans chacun des 18 échantillons d’ARN.

Placez les ligatures sur de la glace et placez-les dans une chambre froide à quatre degrés Celsius pour une incubation d’une nuit de 18 heures. Placez les tubes sur un bloc chauffant pendant une minute à 90 degrés Celsius pour désactiver la réaction de ligature, puis remettez-les dans la glace pendant au moins deux minutes pour qu’ils refroidissent. Transférez 1,2 microlitre du mélange maître de précipitation dans chaque tube.

Ajouter 63 microlitres d’éthanol à 100 %. Fermez chaque tube, agitez les tubes pour mélanger et centrifugez-les pendant deux secondes. Placez les tubes sur de la glace.

Combinez le contenu des 18 tubes en un seul tube siliconé de 1,5 millilitre et retournez-le trois fois pour mélanger. Centrifugez les tubes pendant deux secondes et placez-les sur de la glace pendant 60 minutes pour qu’ils précipitent. Après la précipitation, centrifugez le tube de 1,5 millilitre avec les ligatures regroupées.

Ensuite, retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, mais laissez un peu de liquide au fond. Inclinez le tube et utilisez une pipette de 20 microlitres pour retirer le surnageant restant. Aspirez le surnageant sous vide à l’aide d’une pipette Pasteur avec un embout de 10 microlitres, puis remettez en suspension la pastille d’ARN dans 20 microlitres d’eau exempte de RNase en agitant le tube.

Ajoutez 20 microlitres de solution de chargement de gel PAA pour remettre l’ARN en suspension. Secouez le tube, centrifugez-le pendant deux secondes à température ambiante et placez le tube sur de la glace. Remplacez le 0,5 XTBE précédemment préparé de l’appareil en gel par du 0,5 XTBE frais, et chargez ce dernier, les marqueurs de taille et la RNase ligaturée au centre du gel, en laissant deux puits vides des deux côtés.

Ensuite, faites couler le gel. Après avoir fait couler le gel, démoulez la page 15 % en retirant l’une des plaques de verre. Vaporisez légèrement le gel posé sur la plaque de verre avec 10 microlitres de solution de colorant fluorescent et 25 millilitres de 0,5 XTBE, et laissez-le reposer à plat pendant cinq minutes dans l’obscurité.

Posez le verre avec le gel sur un transilluminateur à lumière bleue et alignez les marqueurs de taille 19 nucléotides et 24 nucléotides avec une règle pour diriger l’excision des petits ARN ligaturés. Ensuite, excisez le gel. Placez le gel excisé dans un tube de 0,5 millilitre conçu pour fragmenter les tranches de gel, solidement positionné dans un tube de microcentrifugation siliconé de 1,5 millilitre.

Centrifugez le gel à 16 mille fois G pendant trois minutes à température ambiante. Remettez en suspension le gel fragmenté avec 300 microlitres de solution de chlorure de sodium de 400 millimolaires. Fermez le tube et scellez-le avec un film de paraffine.

Agitez le contenu sur un mélangeur thermique à 11 cents tr/min dans une chambre froide à quatre degrés Celsius pour une incubation d’une nuit. Le lendemain, récupérez le tube du mélangeur thermique et utilisez une pipette d’un millilitre pour transférer la solution sur un tube filtrant de cinq micromètres, inséré dans un tube de collecte siliconé sans RNase de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube pendant trois minutes à 23 cents fois G à température ambiante.

Jetez le tube filtrant, ajoutez 950 microlitres d’éthanol à 100 % dans le tube de collecte contenant la solution filtrée et retournez le tube pour mélanger. Centrifugez le tube pendant deux secondes et placez-le sur de la glace pendant 60 minutes. Ensuite, précipitez la pastille d’ARN.

Ensuite, séchez la pastille d’ARN en ouvrant le capuchon et en retirant soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette d’un millilitre, tout en laissant un peu de liquide au fond. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres, retirez tout le surnageant restant sans toucher la pastille. Inclinez le tube pour que la solution restante se déplace du côté opposé de la pastille.

À l’aide d’une pipette Pasteur, aspirez le surnageant et séchez la pastille sous vide. Remettre en suspension la pastille d’ARN dans 5,6 microlitres d’eau sans RNase. Décongelez les réactifs de transcription inverse sur de la glace pendant 15 minutes.

Mettez en place une réaction de transcription inverse en ajoutant trois microlitres de tampon 5X, 4,2 microlitres de dioxynucléotide triphosphate 10X, ou DNTP, et 1,5 microlitre de dithiothréitol, ou DTT. Agitez doucement le tube pour mélanger la réaction et centrifugez pendant deux secondes pour recueillir la solution. Une fois que la réaction se déroule sur un bloc chauffant à 90 degrés Celsius pendant exactement 30 secondes, transférez-la directement dans un mélangeur thermique à 50 degrés Celsius pendant deux minutes pour égaliser la température.

Ajoutez 0,75 microlitre de l’enzyme de transcription inverse directement dans la solution. Effleurez doucement pour mélanger et remettez le tube sur le thermo-mélangeur à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes immédiatement. Après 30 minutes, transférez le tube dans un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pendant une minute pour arrêter la transcription inverse.

Ajoutez 95 microlitres d’eau sans RNase directement à la transcription inverse. Agitez le tube pour mélanger et placez-le directement sur la glace pendant deux minutes. Assemblez la réaction PCR pilote et configurez deux cycles PCR sur le thermocycleur.

Configurez la réaction PCR pilote sur le thermocycleur et lancez le premier fichier. À la fin du premier fichier, utilisez une pipette de 20 microlitres pour transférer 12 microlitres de la réaction PCR pilote dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant trois microlitres de colorant de chargement de gel 5X. Mélanger par pipetage de haut en bas.

Et étiquetez-le 10 cycles. Fermez le tube PCR pilote et démarrez la deuxième lime sur le thermocycleur. À la fin du deuxième fichier, utilisez une pipette de 20 microlitres pour transférer 12 microlitres de solution dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec trois microlitres de colorant de chargement de gel 5X, et étiquetez-le 12 cycles.

Répétez les étapes ci-dessus pour prélever 12 microlitres de produits PCR à partir de la réaction PCR pilote aux cycles PCR 14, 16, 18 et 20. Ajoutez ensuite trois microlitres de colorant de chargement de gel 5X à chacune des aliquotes PCR de 12 microlitres et à l’échelle de 20 nucléotides contenant trois microlitres d’échelle et neuf microlitres d’eau sans RNase. Après avoir analysé les échantillons sur un gel d’agarose avec 0,5 XTBE, évaluez le gel sur une boîte UV pour identifier le cycle de PCR optimal.

Ensuite, mettez en place les réactions PCR à grande échelle pour la purification de la bibliothèque de gels d’agarose. Après l’amplification par PCR, transférez neuf microlitres de chaque tube PCR dans six tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, contenant trois microlitres de colorant de chargement de gel 5X. Préparez une échelle de 20 nucléotides.

Chargez l’échelle, le contrôle PCR négatif et six produits PCR sur le gel d’agarose et faites fonctionner le gel pendant 30 minutes à 120 volts. Vérifiez l’uniformité des implifications PCR entre les voies sur un boîtier UV, et prenez une image. Combinez trois réactions PCR dans deux tubes de microcentrifugation siliconés de 1,5 millilitre, ajoutez 27 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et 950 microlitres d’éthanol à 100 %.

Retournez les tubes pour qu’ils mélangent et réglez-les à 20 degrés Celsius pendant la nuit pour précipiter les produits PCR. À l’aide du protocole, la corrélation d’expression des micro-ARN entre les deux ARN tumoraux fraîchement congelés et leurs homologues spécifiques de l’échantillon FFPERNA a été déterminée. Les graphiques entre les micro-ARN fraîchement congelés appariés et les micro-ARN FFPE indiquent que la préparation de la banque d’ADNC offre une bonne reproductibilité, car il existe une forte corrélation entre les microARN détectés dans des échantillons traités différemment.

Pour déterminer si le protocole de préparation optimisé de la banque CNDA était applicable et reproductible avec des échantillons FFPE de plus en plus anciens, des profils d’expression de micro-ARN provenant de tissus FFPE archivés depuis 18, 20, 22, 27, 30 et 35 ans ont été obtenus. Le coefficient de corrélation est demeuré supérieur à 0,96 quel que soit l’âge de l’échantillon ou la semaine de préparation de la banque. Par conséquent, le protocole de préparation optimisé de la bibliothèque CDNA fournit un outil robuste pour l’analyse reproductible des échantillons FFPE, quelle que soit leur durée d’archivage.

Donc, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer vos petites banques d’ARN et d’obtenir un profil complet de microinexpression de tous vos précieux échantillons formels et fixes inclus dans la paraffine.