Protocole de transfert de micro-ARN dans la moelle osseuse hématopoïétique cellules souches adultes pour activer la cellule génie combiné avec un ciblage magnétique

Notre protocole peut répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, telles que si les cellules peuvent être améliorées pour leurs propriétés bénéfiques et si elles peuvent être ciblées sur le site d’intérêt. L’un des principaux avantages de notre protocole est le fait que les cellules peuvent être modifiées génétiquement de manière transitoire à l’aide de notre méthode de transfection non virale, conservant ainsi les propriétés des cellules. La méthode de Sauter peut fournir un aperçu de la modification des cellules souches hématopoïétiques qui peuvent être appliquées à d’autres types de cellules utilisées pour la transplantation, telles que les cellules souches mésenchymateuses.

Pour commencer le protocole, préchauffez le milieu des lymphocytes humains à température ambiante et décongelez la collagénase B et la DNase. Prélevez la moelle osseuse dans un tube conique de 50 millilitres. Jetez tous les caillots existants.

Prélever un échantillon de BM de 200 microlitres pour une analyse cytométrique en flux ultérieure. Conservez l’échantillon à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Ensuite, transférez dix millilitres de BM dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et ajoutez six millilitres de PBS EDTA, 20 millilitres de milieu lymphocytaire humain, 175 microlitres de collagénase B et 175 microlitres de DNase.

Mélangez délicatement la solution et incubez-la pendant 30 minutes à température ambiante sur un shaker. Amorcez un tube de centrifugation à gradient de densité de 50 millilitres en appliquant 15 millilitres de milieu séparateur de lymphocytes humains dans le tube de 50 millilitres et centrifugez-le à 1 000 fois G pendant 30 secondes. Superposez soigneusement 35 millilitres de BM dilué sur le filtre du tube de centrifugation à gradient de densité et centrifugez le tube à 445 fois G pendant 35 minutes.

Retirez délicatement le tube de la centrifugeuse sans le secouer. Jetez soigneusement un maximum de 20 millilitres de la solution supérieure transparente, sans toucher la couche trouble directement sur le dessus du filtre. Transférez soigneusement la couche trouble contenant les cellules mononucléaires, ou MNC, dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et remplissez-le de PBS EDTA jusqu’à un volume final de 50 millilitres.

Comptez les MNC en transférant 10 microlitres de la suspension cellulaire de 50 millilitres dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 10 microlitres d’acide acétique à 3 % avec du bleu de méthylène. Mélangez délicatement le contenu et appliquez 10 microlitres dans une chambre de comptage.

Calculez le nombre de MNC. Centrifugez la suspension MNC à 300 fois G pendant 10 minutes. Jetez le surnageant.

Pour préparer une sélection magnétique pour un fois 10 à la huitième cellule au total, remettez soigneusement les MNC en suspension dans 300 microlitres de tampon MACS. Ajoutez 100 microlitres de réactif bloquant le FCR et 100 microlitres de particules de fer dextran superparamagnétiques liées aux anticorps CD133. Ensuite, mélangez doucement la suspension cellulaire et incubez-la pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Agitez doucement la suspension cellulaire pendant l’incubation deux à trois fois. Après l’incubation, ajoutez deux millilitres de tampon MACS par fois 10 cellules. Mélangez délicatement la suspension cellulaire et centrifugez le mélange à 300 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Installez le support d’aimant MACS et fixez l’aimant permanent MACS. Installez la colonne MACS et appliquez le filtre de pré-séparation sur le dessus. Équilibrez la première colonne MACS et le filtre de pré-séparation avec le tampon MACS.

Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon MACS. Appliquez la suspension de cellule sur le filtre de pré-séparation. Lavez la colonne MACS et le filtre de pré-séparation trois fois et jetez le filtre de pré-séparation.

Éluer la fraction cellulaire directement sur la deuxième colonne MACS. Transférez immédiatement la première colonne MACS au-dessus de la deuxième colonne MACS et poussez la suspension de cellule à travers la colonne MACS à l’aide du piston fourni. Lavez la colonne MACS 3 fois avec la mémoire tampon MACS.

Éluez la fraction cellulaire de la colonne en ajoutant un tampon MACS sur la deuxième colonne MACS et en retirant la colonne MACS de l’aimant permanent MACS. Transférez immédiatement la deuxième colonne MACS au-dessus d’un tube et poussez la suspension de la solution cellulaire à travers la colonne MACS. Centrifugez le tube.

Jetez soigneusement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon MACS. Prélever un échantillon d’une fois 10 à la quatrième cellule pour une analyse cytométrique en flux ultérieure. Remettre en suspension les cellules restantes dans le milieu de culture et ensemencer cinq fois 10 dans les quatrièmes cellules dans une plaque de 24 puits pour la transfection.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 et 20 % d’O2. Utilisez deux aliquotes BM d’échantillons de 10 microlitres et un échantillon de SC CD133 positifs fraîchement isolés pour l’analyse. Transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre.

Ajoutez 10 microlitres de réactif bloquant FcR et remplissez le tube avec un tampon MACS jusqu’à un volume de 33 microlitres. Ajoutez les anticorps sur la face interne du tube. Une fois que tous les anticorps ont été ajoutés, secouez le côté anticorps du tube.

Mélangez délicatement la solution, qui a un volume final de 50 microlitres, et incubez-la pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez un millilitre d’un globule rouge X ou d’un tampon de lyse des globules rouges. Mélangez doucement la suspension et incubez la solution sur de la glace pendant 10 minutes.

Ensuite, centrifugez la suspension. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille obtenue dans 100 microlitres de PBS. Évaluer la pureté et la viabilité des cellules à l’aide de mesures cytométriques en flux.

Utilisez 20 picomoles de MIR par puits d’une plaque de 24 puits. Diluer MIR dans la solution de glucose à 5 % jusqu’à une concentration finale de 0,25 % de MIR de picomoles par microlitre. Diluez le PEI dans une quantité égale de solution de glucose à 5 %.

Ensuite, ajoutez le PEI prédilué dans le MIR prédilué et vortex pendant 30 secondes. Pendant l’incubation des complexes MIR PEI pendant 30 minutes à température ambiante, sonicez les nanoparticules magnétiques, ou MNP, pendant 20 minutes à 35 kilohertz dans un bain d’eau sonique à température ambiante. Assurez-vous que les particules sont en suspension et ne s’agrègent pas.

Ajoutez les MNP soniqués dans les complexes MIR PEI et vortex la solution pendant 30 secondes. Incuber les complexes MIR PEI MNP pendant 30 minutes à température ambiante. Ajouter le complexe MIRNA PEI MNP goutte à goutte directement dans le puits approprié contenant les CS positifs pour CD133 fraîchement isolés dans le milieu de culture.

Mélangez doucement en balançant l’assiette d’avant en arrière. Incuber les cellules. 18 heures après la transfection, recueillir le contenu de chaque puits dans un tube séparé de 1,5 millilitre.

Lavez chaque puits une fois avec 500 microlitres de PBS et transférez cette suspension cellulaire dans le même tube. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon MACS.

Ajoutez 0,5 microlitre d’un colorant réactif aux amines pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Mélangez doucement la suspension et incubez les cellules pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de PBS et centrifugez à nouveau les cellules à 300 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille obtenue dans 100 microlitres de PBS, ajoutez 33 microlitres de 4 % de PFA et mélangez vigoureusement. Évaluez l’efficacité d’absorption du MIR et la cytotoxicité médiée par la transfection par des mesures de cytométrie en flux. En suivant la méthode décrite dans le protocole, la cytométrie en flux a déterminé que la fraction cellulaire CD133 positive enrichie magnétiquement a donné une viabilité et une pureté supérieures à 80 %.

Avec une efficacité d’absorption d’environ 80 % de cellules viables. De plus, il n’y a pas d’effets cytotoxiques significatifs évidents 18 heures après la transfection par rapport aux cellules témoins. De plus, une livraison suffisante et une distribution habituelle des composés du complexe de transfection peuvent être observées dans le cytoplasme des cellules à l’aide de la microscopie à éclairage structuré, ou SIM.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’application in vivo de cellules souches modifiées peuvent être effectuées. Cela permettra d’étudier la survie réelle et les effets dans des conditions dynamiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer la transfection à base de polymères et de nanoparticules magnétiques pour introduire efficacement le microARN dans les cellules souches fraîchement hématopoïétiques.