Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues
5 septembre 2018
Dans un grand éventail d’indications de la maladie, les modèles plus physiologiquement pertinents soient développés et mis en œuvre dans les programmes de recherche. Le nouveau système de modèle décrit ici montre comment tridimensionnelle tumeur sphéroïdes peuvent être cultivées et diffusés dans un système d’axée sur la plaque du haut débit 1536 puits pour chercher de nouveaux médicaments anticancéreux.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments, telles que le cadre de culture tissulaire le plus pertinent pour l’identification du hit to lead. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de cultiver des cellules en trois dimensions, de manière à haut débit, à l’aide de 1536 plaques de puits. La démonstration de ce protocole sera assurée par Kalyani Gampa, un scientifique principal de mon laboratoire.
Pour mettre en place une culture de sphéroïdes tumoraux en 3D, détachez les lignées cellulaires cancéreuses d’intérêt avec trois lavages de BBS. Suivi de l’ajout d’un millilitre de trypsine par zone de cinq centimètres carrés de la fiole de culture. Après cinq minutes, neutralisez la trypsine avec cinq fois le volume de milieu supplémenté en sérum dans chaque flacon et comptez les cellules.
À l’aide d’une petite cassette stérilisée à embout en acier inoxydable avec un système basé sur une pompe péristaltique, ensemencez un total de 500 cellules dans huit microlitres de milieu sphéroïde dans chaque puits d’une plaque traitée pour la culture tissulaire de 1 536 puits. Utilisez ensuite un joint de plaque adhésif respirant pour couvrir la plaque. Et placez la plaque dans un incubateur rotatif réglé à 37 degrés Celsius et 10 tr/min avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité relative pendant trois jours.
L’étape la plus critique consiste à s’assurer que les plaques sont bien scellées avant d’être placées dans l’incubateur. Les sphéroïdes auront besoin de trois jours pour se former et cette étape empêche l’évaporation du milieu. À la fin de l’incubation, faites tourner rapidement les plaques de culture tapissées de cancer à 100 fois la gravité pour recueillir toute condensation et retirez les joints adhésifs.
Placez chaque plaque à traiter sur un distributeur acoustique configuré pour délivrer un total de huit nanolitres de chaque composé. Dilution à une concentration finale de 0,1 % de DMSO par puits et à une dose maximale de composé de 10 micromolaires. Lorsque le composé a été ajouté aux plaques appropriées, placez un couvercle de culture cellulaire en acier inoxydable sur mesure sur chaque plaque pour éviter l’évaporation, et remettez les plaques dans l’incubateur rotatif pendant cinq jours supplémentaires.
À la fin de l’incubation, ajoutez trois microlitres de réactif de lyse cellulaire préchauffé, complété par de la luciférine dans chaque puits de chaque plaque de culture cellulaire. Et incubez les plaques à température ambiante pendant au moins 15 minutes. Capturez ensuite la luminescence ATP sur un luminomètre à plaque.
Lorsque toutes les plaques ont été analysées, extrayez les données brutes de l’instrument et normalisez tous les champs contenant les composés d’essai à la moyenne de tous les puits contenant uniquement du DMSO comme contrôle neutre. Le pourcentage d’inhibition de la croissance de chaque composé peut ensuite être calculé en fonction de la formule, et des courbes dose-réponse, et des CI50 inhibitrices peuvent être générées. Une variété de cellules cancéreuses établies, connues pour bien se développer dans des conditions de culture 2D, ont également formé des structures 3D lorsqu’elles ont été cultivées, comme nous venons de le démontrer, malgré leurs différences morphologiques.
Lorsqu’il est utilisé pour le criblage à grande échelle, on peut observer une sensibilité différentielle entre les cultures cultivées en 2D et celles cultivées en 3D. Chaque point représentant la concentration inhibitrice d’un seul composé pour lequel une réponse de destruction cellulaire de 50 % est observée dans les deux contextes de culture. Dans cette expérience représentative, les deux composés inhibiteurs de kinases RAF testés étaient plus puissants dans des conditions 3D dans une culture de lignée de cancer du poumon non à petites cellules hébergeant une mutation activatrice dans la protéine KRAS.
Cependant, les composés démontrent une puissance similaire dans les cultures de sphéroïdes 3D et de lignées de cancer du côlon 2D qui contiennent une mutation activatrice G13D dans KRAS. Le test 3D permet également d’observer le phénomène paradoxal d’activation de la croissance, qui se produit lorsqu’il y a une inhibition incomplète des dimères RAF dans les lignées mutantes RAF hautement activées, comme en témoigne la croissance cellulaire à de faibles concentrations du médicament, qui est réprimée à des concentrations élevées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments anticancéreux pour explorer des conditions de culture alternatives afin d’identifier de nouvelles matières chimiques efficaces contre des cibles connues.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente une méthode innovante pour la découverte de médicaments utilisant des sphéroïdes tumoraux tridimensionnels cultivés dans un système de plaque à 1536 puits à haut débit. Cette approche vise à renforcer la pertinence des conditions de culture tissulaire pour l'identification de médicaments potentiels en oncologie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Oncologie
- Découverte de médicaments
- Techniques de culture cellulaire
Contexte général
- Les cultures cellulaires traditionnelles en deux dimensions échouent souvent à imiter le microenvironnement tumoral.
- Les cultures en trois dimensions offrent un modèle plus pertinent sur le plan physiologique pour l'étude du cancer.
- Le criblage à haut débit est essentiel pour une découverte efficace de médicaments.
- Cette étude se concentre sur l'optimisation de la culture de sphéroïdes tumoraux.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode à haut débit pour la culture de sphéroïdes tumoraux.
- Évaluer la pertinence de ce modèle dans la découverte de médicaments.
- Faciliter l'identification de nouveaux médicaments en oncologie.
Méthodes utilisées
- Détacher des lignées de cellules cancéreuses à l'aide de lavages BBS.
- Utiliser la trypsine pour le détachement cellulaire et neutraliser avec un milieu supplémenté en sérum.
- Cultiver les cellules dans un format de plaque à 1536 puits.
- Effectuer le criblage de candidats médicaments potentiels de manière haut débit.
Résultats principaux
- La méthode permet une culture efficace de sphéroïdes tumoraux en 3D.
- Les capacités de criblage à haut débit permettent une évaluation rapide de candidats médicaments.
- Pertinence démontrée du modèle de culture en 3D dans la découverte de médicaments.
- Potentiel d'améliorer le processus d'identification des hits précurseurs.
Conclusions
- Cette méthode de culture de sphéroïdes tumoraux en 3D améliore les efforts de découverte de médicaments.
- Elle offre une représentation plus précise de la biologie tumorale.
- L'approche peut permettre l'identification de nouvelles thérapies en oncologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode comble le fossé translationnel dans la découverte de médicaments en oncologie en permettant un criblage à haut débit dans un modèle de sphéroïdes tumoraux tridimensionnels physiologiquement pertinent. Elle renforce la fiabilité prédictive de la validation de cibles en révélant des réponses différentielles aux médicaments entre des conditions de culture en 2D et en 3D. L'approche améliore l'identification des « hits » vers des candidats précurseurs pour les inhibiteurs de la voie MAPK dans des modèles de cancer génétiquement définis.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans un système pertinent pour la maladie, qui reproduit les interactions cellulaires tridimensionnelles et l'organisation spatiale.
- Valeur opérationnelle : Permet une détection mécanistique des risques en comparant l'efficacité d'un composé dans des cultures en 2D et en 3D afin d'identifier une activité dépendante du contexte.
- Valeur prédictive : Facilite l'identification de composés d'intérêt en détectant une sensibilité différentielle dans des modèles de cancer du poumon non à petites cellules porteurs d'une mutation KRAS en conditions tridimensionnelles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit un système de culture 3D standardisé et reproductible, compatible avec les formats de 1536 puits, pour le criblage à grande échelle de composés.
- Valeur opérationnelle : Permet des mesures quantitatives par luminescence basées sur l'ATP afin d'évaluer l'inhibition de la croissance et de générer des courbes dose-réponse ainsi que des valeurs d'IC50.
- Préparation du test : Utilise un dosage acoustique pour une délivrance précise de composés en nanolitres et une incubation scellée afin d'éviter l'évaporation, garantissant ainsi l'intégrité du test.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie la découverte et les flux de travail précliniques en modélisant les interactions tumeur-stroma et les conditions semblables à la matrice extracellulaire dans un format évolutif.
- Progression adaptée au risque : Permet d'observer l'activation paradoxale de la croissance chez les mutants dimères de RAF, orientant les stratégies de thérapies combinées et réduisant les risques liés aux candidats cliniques.
- Alignement des biomarqueurs : Facilite l'évaluation d'inhibiteurs spécifiques de voies (par exemple, MAPK) dans des contextes génétiquement définis afin de corréler le génotype à la réponse au médicament.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, depuis la validation de la cible jusqu'à l'identification de composés d'intérêt, permettant ainsi d'évaluer précocement l'efficacité de composés dans un contexte plus physiologiquement pertinent avant tout investissement préclinique.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses en révélant comment la culture 3D modifie la sensibilité aux médicaments dans des modèles pilotés par des oncogènes, tels que les CBNPC porteurs de mutations KRAS.
- Essais de criblage : Assure la préparation et la reproductibilité des tests grâce à une formation standardisée de sphéroïdes dans des plaques 1536-puits, combinée à des protocoles contrôlés d'incubation et de scellement.
- Analyse : Permet la mesure quantitative de variables dépendantes par normalisation de la luminescence de l'ATP aux témoins DMSO, facilitant ainsi le calcul des IC50 et les analyses comparatives de puissance.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en modélisant l'architecture spatiale des tumeurs et les interactions clonales, absentes dans les systèmes en 2D.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une plateforme réutilisable pour le criblage de diverses lignées cellulaires cancéreuses et de bibliothèques de composés ciblant des voies conservées telles que MAPK.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à la comparaison directe des réponses aux médicaments en 2D et en 3D.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation, la reproductibilité et la possibilité de passage à l'échelle par des protocoles utilisant des plaques de 1536 puits compatibles avec la robotique et une incubation scellée.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en identifiant les composés présentant une activité spécifique au contexte, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des candidats-médicaments ajustée au risque, fondée sur leur efficacité différentielle dans des modèles physiologiquement pertinents.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques de culture cellulaire en 3D, notamment la neutralisation de la trypsine, le comptage cellulaire et le semis stérile.
- Dépend d'instruments tels que des systèmes à cassettes basés sur des pompes péristaltiques, des distributeurs acoustiques, des incubateurs rotatifs et des luminomètres de plaques.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de scellage, des paramètres d'incubation (37 °C, 10 tr/min, 5 % CO2, 95 % d'humidité) et des procédures de normalisation des données.
- Suppose des adaptations selon les lignées cellulaires cancéreuses, car l'efficacité de formation des sphéroïdes peut varier même si la formation réussit dans des lignées établies.
- Comprend des limites pratiques telles que la nécessité de prévenir l'évaporation pendant les incubations prolongées et l'optimisation du dosage des composés en volumes nanolitriques.
