Name: Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Découvrez la culture de sphéroïdes tumoraux 3D en haut débit sur plaques 1536-puits pour le dépistage de médicaments en oncologie. Cette méthode améliore l'identification de candidats thérapeutiques efficaces.

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Les auteurs aimerait Marc Ferrer au Centre National pour faire progresser les Sciences translationnelle, National Institutes of Health pour son soutien et ses conseils sur le développement initial de ces tests. En outre, nous tenons à remercier Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling et Vesselina Cooke pour leur apport scientifique et de la discussion que les membres de l’équipe du projet.

1. mise en culture des sphéroïdes tumeur 1536 puits 3D
<ol><li>Préparer une tige moyenne frais 3D tumeur sphéroïde (milieu cellulaire + remplacement de sérum knockout + insuline-transferrine-sélénium) en ajoutant les réactifs suivants dans 500 mL de milieu d’Eagles modifié de Dulbecco (DMEM/F12) : 1 x pénicilline/streptomycine, 10 ng/mL de l’homme facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), 20 ng/mL d’humain facteur croissance épidermique (EGF), 0,4 % d’albumine sérique bovine (BSA) (Fraction V), 1 x insuline-transferrine-sélénium et le remplacement de sérum 1 % knockout (KO) (ne pas de gel-dégel).</li>
	<li>Filtre-stériliser le milieu ensemble avec les suppléments grâce à un système de filtre bouteille-top 0,4 µm.</li>
	<li>Détacher les lignées de cellules cancéreuses, qui ont augmenté selon des conditions de culture courante recommandée, des flacons de culture cellulaire traditionnelle en les lavant 3 x avec phosphate 1 x tampon salin (PBS) et en ajoutant une quantité appropriée de 0,25 % de trypsine (1 mL par 5 cm2) pendant 5 min créer une fine couche sur les cellules. Neutraliser la trypsine avec 5 fois le montant du milieu contenant du sérum et continuer à compter les cellules non vides. Par exemple, utilisez 25 mL de milieu pour 5 mL de la trypsine.</li>
	<li>Ajuster la concentration de la solution de la cellule à 62,5 x 104 cellules/mL pour un total de 500 cellules / puits dans 8 µL de milieu de sphéroïde de graines dans les plaques 1536 puits de tissu-culture-traitée.</li>
	<li>Dans une armoire de sécurité biologique, les cellules à l’aide d’une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite avec un système de pompe péristaltique dotés de graines. Entre différentes lignées cellulaires, rincer la tubulure de la cassette avec 1 x PBS et 70 % éthanol pendant 10 s.</li>
	<li>Par ailleurs, les semences les cellules à l’aide d’un gestionnaire liquid situé à l’intérieur d’une pièce de filtre HEPA en utilisant soit une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite et une pompe péristaltique ou une pompe à seringue jointe, selon le nombre de plaques par une lignée de cellules nécessaires.</li>
	<li>Sceller les plaques en utilisant un joint de plaque adhésive respirante soit manuellement ou à l’aide d’un adhésif.</li>
	<li>Placer les plaques dans un incubateur à rotation fixée à 10 tr/min et 37 ° C, avec 5 % de dioxyde de carbone (CO2) et 95 % d’humidité relative. Laissez les sphéroïdes à se former pendant 3 jours.</li>
</ol>2. mise en culture de lignées cancéreuses 1536 puits 2D
NOTE : Les lignes de cancer 2D 1536 puits doivent être cultivées 24h avant l’ajout du composé aux plaques 3D.
<ol><li>Préparer un support de cellule de cancer 2D en ajoutant les réactifs suivants à 500 mL d’un milieu de culture approprié pour les lignes sélectionnées : 1 x sérum bovin fœtal (SVF) pénicilline/streptomycine et 10 %.</li>
	<li>Filtre-stériliser le milieu ensemble avec les suppléments grâce à un système de filtre bouteille-top 0,4 µm.</li>
	<li>Détacher les lignées de cellules cancéreuses, qui ont augmenté selon des conditions de culture courante recommandée, des flacons de culture cellulaire traditionnelle en les lavant 3 x avec 1 x PBS et en ajoutant une quantité appropriée de 0,25 % de trypsine (1 mL par 5 cm2) pendant 5 min à créer une couche mince sur les cellules. Neutraliser la trypsine avec 5 fois le montant du milieu contenant du sérum et continuer à compter les cellules non vides. Par exemple, utilisez 25 mL de milieu pour 5 mL de la trypsine.</li>
	<li>Ajuster la concentration de la solution de la cellule à 62,5 x 104 cellules/mL pour un total de 500 cellules / puits dans 8 µL de milieu complet de graines dans les plaques 1536 puits tissu-culture-traitées.</li>
	<li>Dans une armoire de sécurité biologique, les cellules à l’aide d’une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite avec un système de pompe péristaltique dotés de graines. Entre les différentes lignées cellulaires, rincer la tubulure de la cassette avec 1 x PBS stérile et de 70 % éthanol pendant 10 s.</li>
	<li>Par ailleurs, amorcer les cellules à l’aide d’un gestionnaire liquid situé à l’intérieur d’une pièce de filtre HEPA robotique utilisant une cassette en acier inoxydable-pointe stérilisée, petite et une pompe péristaltique ou le pousse-seringue jointe, selon le volume des plaques par cellule ligne nécessaire.</li>
	<li>Sceller les plaques en utilisant un joint de plaque adhésive respirante soit manuellement ou à l’aide d’un adhésif.</li>
	<li>Placer les plaques dans un incubateur à rotation fixée à 10 tr/min et 37 ° C pendant 24 h avant l’addition de composé, avec 5 % CO2 et 95 % d’humidité relative.</li>
</ol>3. composé d’Addition
<ol><li>Préparer des dilutions de 8 points, 3 fois la série des inhibiteurs de la MAPK à 100 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) sur un robot de gestion liquide avec une concentration supérieure de 10 mM. L’inhibiteur du protéasome bortézomib est utilisé comme témoin positif pour une cellule complète tuant pour déterminer la plage dynamique du dosage.</li>
	<li>Rapide-spin tout dosage plaques et composé à 100 g pour recueillir toute condensation. Retirer le joint adhésif de chaque plaque et placer une plaque sur une installation de distributeur acoustique pour ajouter un total de 8 nL de chaque composé/dilution, ce qui représente une concentration finale de 0,1 % DMSO / puits et une dose supérieure composée de 10 µM.</li>
	<li>Après que l’ajout du composé est terminée, placer un couvercle de culture cellulaire sur mesure, en acier inoxydable qui empêche l’évaporation sur la plaque et place la plaque dans un incubateur de filature à 37 ° C pendant 5 jours, avec 5 % CO2 et 95 % d’humidité relative.</li>
</ol>4. Ajout de réactif détection et l’acquisition des données brutes
<ol><li>Préchauffer un volume suffisant d’un réactif de lyse cellulaire contenant la luciférine pour détecter les variations triphosphate de l’adénine (ATP) et, par conséquent, la prolifération des cellules à température ambiante ou dans un bain-marie à 37 ° C. Ajouter un total de 3 µL de réactif de détection à chaque puits à l’aide d’une pompe péristaltique et incuber la plaque à température ambiante pendant au moins 15 min.</li>
	<li>Capturer la luminescence sur un luminomètre plaque.</li>
</ol>5. traitement des données
<ol><li>Extraire les données brutes de l’instrument et normaliser tous les champs contenant des composés d’essai à la moyenne de tous les puits contenant DMSO seul comme le contrôle neutre. Calculer à partir de cette valeur, l’inhibition de la croissance pour cent de chaque composé. C’est terminé à l’aide de la formule fonction dans Microsoft Excel où f (x) = {(échantillon valeur relative unités légères (RLUs) / (valeur de DMSO RLUs en moyenne) * 100)}.</li>
	<li>Générer les courbes dose-réponse et l’inhibiteur IC50s en traçant la courbe des valeurs des données normalisées de l’étape 5.1 contre la concentration de composés à l’aide d’un programme graphique. NOTE : Nous avons analysé les données à l’aide de Helios, un outil de logiciel NIBR interne. Pour compléter cette fonction, nous avons sélectionné l’outil d’analyse de courbe non-paramétrique.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs sont des employés de Novartis, et certains employés sont également actionnaires.

Les méthodes présentées ici montrent un protocole détaillé sur la façon de produire des sphéroïdes de tumeur en plaques 1536 puits pour projections composées à grande échelle. Ces méthodes ont été initialement adaptés au travail à l’Institut National du Cancer où sphéroïdes de tumeur ont été cultivées dans des essais de faible débit dans des plaques 6 puits et 96 puits à poser des questions sur la génétiques dépendances et sensibilité composé13, 14 , <...

Au cours de la dernière décennie, de plus en plus des études ont mis en place l’utilisation de modèles de culture de cellules 3D de comprendre les concepts qui ne sont pas entièrement récapitulées en cultivant des cellules en 2D sur plastique. Exemples de ces concepts incluent les alternances dans les cellules épithéliales normales polarité1 où l’orientation spatiale de couches basales et apicales des cellules sont perdus, ainsi que le rôle de la matrice extracellulaire dans la régulation de la survie et le sort de la cellule. Recherche en oncologie, en particulier, utilise des modèles 3D pour comprendre la biologie fondamentale des cellules cancéreuses et les différences entre 2D et 3D cell culture systèmes3,4. Le développement des techniques de culture cellulaire plus sophistiqués et leur adaptation supplémentaire aux formats multipuits a permis à la recherche de nouveaux médicaments dans paramètres 3D. Contrairement aux cellules cultivées dans des conditions 2D, des modèles 3D de la gamme de tumeurs dans la complexité de systèmes cellulaires en couches5 de type single-cell sphères de différentes tailles, complexe multi-cell-type sphères6,7, 8. la découverte de nouveaux composés ou un agent biologique qui puissamment induire la mort cellulaire dans ces systèmes de modèle 3D est, par conséquent, d’un grand intérêt dans les campagnes de développement de médicaments. Points de terminaison de ces tests sont souvent identiques à celles exercées dans les cultures 2D pour évaluer les changements dans la prolifération cellulaire, mais lorsque menées dans un cadre plus physiologiquement pertinent, ils peuvent révéler le véritable niveau de dépendance du gène cible ou en voie interrogé.
Tel que présenté ci-dessus, une variété de systèmes modèles ont été développés pour étudier les réponses de drogue dans des systèmes de culture 3D, mais la plupart utilise deux microplaques 96 ou 384 puits et n’est pas facilement adaptable aux formats haut débit (HTS) de dépistage souvent utilisés dans les campagnes de dépistage de découverte de médicaments. Ces systèmes comprennent l’utilisation d’accrocher technologies gouttelette, cultures de sphéroïde, pulsant de cellules avec des particules magnétiques pour induire la lévitation et les cultures, incorporant des gels naturels ou synthétiques comme le collagène, Matrigel ou polyéthylène glycol (PEG)2 . Nous présentons ici les méthodes détaillées d’une technique déjà développée pour produire des cultures de sphéroïde 3D provenant de lignées cellulaires établies du cancer dans un format de plaque 1536 puits. Dans le présent protocole, un milieu très défini est utilisé qui empêche la fixation des lignées de cellules adhérentes normalement9. Ce système a des limites (par exemple, il ne peut pas récapituler complètement un système complexe modèle de cancer), mais néanmoins, ces tests permettent un criblage à haut débit de grandes collections de petites molécules et des comparaisons en travers de la réaction aux médicaments entre 2D et 3D des cultures contre une variété de lignées cellulaires et composés.
Les lignées de cellules sélectionnées afin de démontrer les méthodes dans cet article toutes les mutations dans les gènes associés à la signalisation de voie, une voie qui est hautement dysrégulation dans le cancer, MAPK harbor et pour les thérapies dont beaucoup sont disponibles. Beaucoup de lignes ont activation d’oncogènes mutations du virus Kirsten Rat Sarcoma, également dénommé KRAS, le RAS de neuroblastome ou ARN, l’oncogène virus de sarcome de Rat Harvey ou HRAS et les kinases associées rapidement accéléré fibrosarcomes, également connu sous le nom Fra. La littérature récente suggère que les inhibiteurs des différents nœuds de cette voie sont particulièrement bien plus efficaces pour un sous-ensemble des lignées cellulaires lorsqu’il est cultivé sous des conditions 3D9,10. Une étude a révélé que lorsque les cellules cancéreuses avec RAS active ont été cultivées en 3D, ils ont démontré une sensibilité accrue aux inhibiteurs de la MAPK et en outre, que cette approche pourrait identifier les voies et ciblé des inhibiteurs qui pourraient manquer dans le 2D traditionnelle réglage. L’objectif de cette étude est de présenter les méthodes utilisées pour la culture de ces lignées cellulaires, et plus, pour démontrer la différence de réponses à ces inhibiteurs que l'on peut observer seulement en utilisant 3D cell systèmes de culture.

<table><tbody><tr><td><Réactifs > forts</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Acheté en tant que solution préparée. Cette recette s’est avérée préférée par rapport à d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Acheté en tant que solution préparée.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Acheté en tant que solution préparée.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Acheté comme solution préparée.</td></tr><tr><td>1x 0,25 % de trypsine avec acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Acheté sous forme de solution préparée.</td></tr><tr><td>1x Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Acheté comme solution préparée.</td></tr><tr><td>10 ng/mL Facteur de croissance fibrobère humain basique (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Remettre en suspension dans de l’eau stérile.</td></tr><tr><td>20 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Resuspension dans de l’eau stérile.</td></tr><tr><td>0,4 % d’albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>Remettre en suspension dans du PBS stérile et un filtre.</td></tr><tr><td>1x Insuline Transferrine Sélénium (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1 % KnockOut (KO) Remplacement du sérum</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Ajouter frais juste avant utilisation.</td></tr><tr><td>100 % Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Acheté comme solution préparée.</td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Combi Cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Small Multiflow Cassette</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536 puits (blanc)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>Plaques TC stériles 1536 puits (noir)</td><td>Corning</td><td>3893</td><td></td></tr><tr><td>Scivax Plaques</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesives</td> joints <td>ThermoFisher</td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur rotatif</td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Couvercles en acier inoxydable</td><td>Institut de génomique de la Fondation de recherche Novartis (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispensateur acoustique</td><td>ATS EDS Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Acoustic Dispensor</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump- Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

génération des sphéroïdes high-throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Les cellules cancéreuses ont systématiquement été cultivés en deux dimensions (2D) sur une surface en plastique. Cette technique, cependant, n’a pas le vrai environnement une tumeur masse affleure à in vivo. Tumeurs solides poussent non pas comme une feuille jointe au plastique, mais plutôt comme un ensemble de cellules clonales dans un en trois dimensions (3D) espace interagissant avec leurs voisins et avec des propriétés spatiales distinctes telles que l’interruption de la polarité cellulaire normale. Ces interactions provoquent des cellules cultivées en 3D à acquérir des caractéristiques morphologiques et cellulaires qui sont plus pertinentes pour les tumeurs in vivo . En outre, une tumeur masse est en contact direct avec les autres types de cellules comme les cellules stromales et immunitaires, ainsi que la matrice extracellulaire de tous les autres types de cellules. La matrice déposée est constituée de macromolécules biologiques, comme le collagène et la fibronectine.
Dans le but d’augmenter la traduction des résultats de la recherche en cancérologie de banc au chevet du patient, de nombreux groupes ont commencé à enquêter sur l’utilisation de systèmes de modèles 3D dans leurs stratégies de développement de médicaments. Ces systèmes sont censés être plus physiologiquement pertinentes car elles tentent de récapituler l’environnement complexe et hétérogène d’une tumeur. Ces systèmes, cependant, peuvent être assez complexes, et, bien que favorable à la croissance de formats de 96 puits et d’autres maintenant même en 384, ils offrent peu de choix pour la croissance à grande échelle et de dépistage. Cette observée écart a conduit à l’élaboration des méthodes décrites ici en détail de sphéroïdes de tumeur de la culture dans une capacité de haut débit en plaques 1536 puits. Ces méthodes représentent un compromis aux systèmes de matrice-basé très complexes, difficiles à l’écran et des essais 2D classiques. Une variété de lignées de cellules cancéreuses hébergeant des mutations génétiques différentes sont retenus et menée, en examinant l’efficacité composée en utilisant une bibliothèque organisée des composés ciblant la voie Mitogen-Activated protéine Kinase ou MAPK. Les réponses de culture sphéroïde sont ensuite comparées à la réponse des cellules cultivées en 2D, et activités différentielles sont signalées. Ces méthodes fournissent un protocole unique pour tester l’activité composée dans un cadre 3D haut débit.

Une variété de cellule de cancer établis lignées qui poussent bien dans des conditions de culture 2D ont été testées en utilisant les méthodes décrites ici. Des images représentatives d’une variété de cancer mutant MAPK lignées cellulaires (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS et KNS-62:HRAS) sont visibles dans la Figure 1. Ces images montrent que bien que les lignées cellulaires ont des morphologies différentes, chacun formé des structures 3D des plaq...

Dans un grand éventail d’indications de la maladie, les modèles plus physiologiquement pertinents soient développés et mis en œuvre dans les programmes de recherche. Le nouveau système de modèle décrit ici montre comment tridimensionnelle tumeur sphéroïdes peuvent être cultivées et diffusés dans un système d’axée sur la plaque du haut débit 1536 puits pour chercher de nouveaux médicaments anticancéreux.

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments, telles que le cadre de culture tissulaire le plus pertinent pour l’identification du hit to lead. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de cultiver des cellules en trois dimensions, de manière à haut débit, à l’aide de 1536 plaques de puits. La démonstration de ce protocole sera assurée par Kalyani Gampa, un scientifique principal de mon laboratoire.Pour mettre en place une culture de sphéroïdes tumoraux en 3D, détachez les lignées cellulaires cancéreuses d’intérêt avec trois lavages de BBS. Suivi de l’ajout d’un millilitre de trypsine par zone de cinq centimètres carrés de la fiole de culture. Après cinq minutes, neutralisez la trypsine avec cinq fois le volume de milieu supplémenté en sérum dans chaque flacon et comptez les cellules.À l’aide d’une petite cassette stérilisée à embout en acier inoxydable avec un système basé sur une pompe péristaltique, ensemencez un total de 500 cellules dans huit microlitres de milieu sphéroïde dans chaque puits d’une plaque traitée pour la culture tissulaire de 1 536 puits. Utilisez ensuite un joint de plaque adhésif re

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Nous introduisons un protocole pour la génération d'un grand nombre (des milliers à des centaines de milliers) de taille et d'sphéroïdes uniformes de composition contrôlée tumorales, en utilisant commerce microplaques.

La production de grands nombres de tumeurs Sphéroïdes Taille contrôlée à l&#39;aide de micro puits Plaques

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Un protocole pour l’impression robotisée de sphéroïdes de cellules cancéreuses dans un format de plaque à 96 puits à haut débit à l’aide d’un système aqueux biphasé est présenté.

Production robotique de Cancer Cell Sphéroïdes avec un système aqueux à deux phases pour le dépistage des drogues

Les xénogreffes de glioblastome multiforme dérivées de patients peuvent être miniaturisées en microtumeurs vivantes à l’aide d’un système de culture de biogel humain 3D. Ce test tumoral 3D in vivo est adapté aux tests de réponse aux médicaments et au profilage moléculaire, y compris l’analyse kinomique.

Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug

Tomographie par cohérence optique (OCT), une technologie d’imagerie en trois dimensions, a été utilisé pour surveiller et caractériser la cinétique de croissance des sphéroïdes multicellulaires de tumeur. Une quantification volumétrique précise des sphéroïdes de tumeur à l’aide d’un voxel comptage approche et la détection de tissu mort exempte d’étiquette dans les sphéroïdes basé sur contraste intrinsèque d’atténuation optique, ont été démontrées.

Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Ce protocole décrit la génération des sphéroïdes patients-dérivés, et l'analyse en aval comprenant la quantification de la prolifération, l'essai de cytotoxicité, la cytométrie de flux, la coloration d'immunofluorescence et l'imagerie confocale, afin d'évaluer le médicament potentiel des candidats en tant que thérapeutique anti-néoplastique. Ce protocole soutient la médecine de précision avec l'identification de médicaments spécifiques pour chaque patient et stade de la maladie.

Patients physiologiques dérivés sphéroïdes 3D pour le dépistage des médicaments anti-néoplastiques pour cibler les cellules souches cancéreuses

Ce protocole détaille une méthode pour la production de trois types différents de sphéroïdes d’une manière qui les rend adaptés au criblage et à l’analyse à grande échelle à haute teneur. En outre, des exemples sont présentés montrant comment ils peuvent être analysés au niveau des sphéroïdes et des cellules individuelles.

Une méthode robuste pour la production à grande échelle de sphéroïdes pour les applications de criblage et d’analyse à haute teneur

Les sphéroïdes tumoraux sont de plus en plus utilisés pour évaluer les interactions cellule tumorale-microenvironnement et la réponse thérapeutique. Le présent protocole décrit une méthode robuste mais simple pour l’imagerie à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux 3D en utilisant un nettoyage optique rapide.

Nettoyage optique rapide pour l’analyse à semi-haut débit des sphéroïdes tumoraux

Le présent protocole décrit la génération de modèles de culture tumorale 3D à partir de cellules cancéreuses primaires et l’évaluation de leur sensibilité aux médicaments à l’aide de tests de viabilité cellulaire et d’examens microscopiques.

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Cet article démontre une méthode standardisée pour construire des sphéroïdes tumoraux tridimensionnels. Une stratégie d’observation des sphéroïdes et d’analyse d’apprentissage profond basée sur l’image à l’aide d’un système d’imagerie automatisé est également décrite.

Génération de sphéroïdes tumoraux 3D pour des études d’évaluation de médicaments

Ici, nous établissons une plateforme de profilage métabolique intégrant des sphéroïdes de gliome tridimensionnels (3D) et une normalisation basée sur l’imagerie via l’analyse des flux extracellulaires. Cette approche permet une évaluation plus précise des réponses métaboliques tumorales aux traitements médicamenteux et donne un aperçu des mécanismes potentiels de résistance.

Progrès dans le profilage métabolique des sphéroïdes de tumeurs cérébrales tridimensionnelles pour le criblage de médicaments

Découvrez la culture de sphéroïdes tumoraux 3D en haut débit sur plaques 1536-puits pour le dépistage de médicaments en oncologie. Cette méthode améliore l'identification de candidats thérapeutiques efficaces.

Génération des sphéroïdes High-Throughput tumeur en trois dimensions pour le dépistage des drogues

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