CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires

L’objectif global de CARIP-Seq est d’étudier les ARN associés à la chromatine à l’échelle du génome. L’objectif de ChIP-Seq est d’évaluer les interactions protéine-ADN à l’échelle mondiale dans les cellules souches embryonnaires. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’épigénétique et des cellules souches, à identifier l’emplacement du génome, les facteurs de transcription ou le régulateur épigénétique, la liaison ou l’occupation de la modification des histones, ou les ARN associés à la chromatine dans les cellules souches embryonnaires.

Le principal avantage de ces techniques est qu’elles permettent l’interrogation impartiale à l’échelle du génome des ARN associés aux constituants de la chromatine et l’identification globale des interactions entre l’ADN des protéines. Bien que ces méthodes puissent donner un aperçu de la biologie des cellules souches embryonnaires, elles peuvent également être appliquées à d’autres types de cellules de mammifères pour étudier la biologie du cancer ou d’autres maladies humaines. Pour récolter les cellules souches embryonnaires, lavez d’abord les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate.

Ensuite, détachez les cellules avec 0,25 % de trypsine, préchauffée à 37 degrés Celsius. Après trypsinisation, remettre les cellules en suspension dans un milieu MEF préchauffé, complété par 10 % de sérum bovin fœtal. Ensuite, ajoutez 37 % de formaldéhyde aux cellules dans un tube conique jusqu’à une concentration finale de 1 % et incubez à 37 degrés Celsius pendant huit minutes pour réticuler les cellules.

Pour arrêter la réaction de fixation, ajoutez 1,25 molaire de glycine pré-refroidie à quatre degrés Celsius à une concentration finale de 0,125 molaire. Ensuite, placez le tube sur un rotateur et retournez-le à huit tours par minute pendant cinq minutes à température ambiante. Après cinq minutes, centrifugez l’échantillon à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante.

Une fois la centrifugation terminée, jetez le surnageant. Ensuite, lavez la pastille avec une solution saline tamponnée au phosphate pré-refroidie et centrifugez à nouveau l’échantillon. Ensuite, retirez la solution saline tamponnée au phosphate et congelez les cellules dans de l’azote liquide pendant une minute.

Une fois les cellules souches embryonnaires décongelées sur de la glace, remettez la pastille en suspension dans 2,5 millilitres de tampon de sonication. Pour étudier les facteurs de transcription ou les facteurs épigénétiques, réactivez la pastille cellulaire dans un tampon de sonication sans dodécylsulfate de sodium. Pour les modifications d’histones, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un tampon contenant du dodécylsulfate de sodium.

Ensuite, pour l’immunoprécipitation de la chromatine, sonicate la chromatine pendant 14 à 18 cycles à 40 % d’amplitude avec 30 secondes de marche et 30 secondes de repos. Pour solubiliser la chromatine pour le facteur protéique ChIP, complétez le tampon de sonication avec 28 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 10 %. Pour les facteurs protéiques dans les modifications d’histones, ajoutez 28 microlitres de désoxycholate de sodium et 0,28 millilitre de Triton X-100 à 10 % et mélangez bien.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 10 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour pré-éliminer la chromatine. Dans un tube à faible reliure de 1,5 millilitre, ajoutez 40 microlitres de billes magnétiques A ou G. Ensuite, lavez les billes avec 600 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate et transférez le tube avec les billes sur une grille contenant un aimant et incubez pendant une minute à température ambiante.

Ensuite, retirez la solution saline tamponnée au phosphate et remettez à nouveau les billes en suspension dans 100 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate. Dans le tube, ajoutez deux à quatre microgrammes d’anticorps et incubez-le en le plaçant sur un rotateur pendant 40 minutes à huit tours par minute pour favoriser la liaison de l’anticorps aux billes. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate pour laver les billes.

Après le lavage, incubez l’extrait de chromatine soniquée sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour immunoprécipiter les protéines liées à la chromatine. Le lendemain, lavez les billes et incubez avec un tampon RIPA, un tampon RIPA avec du sel, un tampon pour chlorure de lithium, un tampon Tris-EDTA avec Triton X-100 et un tampon Tris-EDTA, chacun pendant 10 minutes sur un rotateur. Pour décroiser les liens pour ChIP, remettre les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon Tris-EDTA.

Ajoutez ensuite trois microlitres de dodécylsulfate de sodium à 10 % et cinq microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K, et incubez les billes à 65 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, le lendemain, retournez les tubes plusieurs fois, laissez-les sur la grille magnétique et transférez le surnageant dans un tube frais. Ensuite, lavez les billes magnétiques en ajoutant 100 microlitres de tampon Tris-EDTA, contenant 0,5 molaire de chlorure de sodium et combinez les deux surnageants.

Pour décrosslink pour CARIP, remettre les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon Tris-EDTA. Ensuite, ajoutez trois microlitres de dodécylsulfate de sodium à 10 % et cinq microlitres de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K et incubez les billes à 65 degrés Celsius pendant quatre à 12 heures. Encore une fois, retournez le tube plusieurs fois et placez-le sur le support magnétique pour transférer le surnageant dans un tube frais.

Ensuite, lavez les billes magnétiques en ajoutant 100 microlitres de tampon Tris-EDTA, contenant 0,5 molaire de chlorure de sodium, puis combinez les deux surnageants. Enfin, isolez l’échantillon d’ARN en utilisant du phénol chloroforme isoamylique dans un rapport volume par volume de 25 à 24. Ensuite, utilisez la DNase pour retirer l’ADN de l’échantillon d’ARN immunoprécipité associé à la chromatine.

Ensuite, ajoutez un tampon DNase 10X à l’échantillon CARIP et ajustez le volume final à une concentration de 1X. Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, synthétisez le premier brin d’ADN complémentaire en mettant en place une réaction PCR en ajoutant 10,5 microlitres d’ARN et un microlitre de trois microgrammes par millilitre d’amorces hexamères aléatoires.

Pour dénaturer la structure secondaire, incubez d’abord le tube à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis sur de la glace pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez le mélange principal dans le tube PCR et incubez à 25 degrés Celsius pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez un microlitre de 200 unités par microlitre d’exposant deux et lancez le programme de thermocycleur.

Pour synthétiser le deuxième brin d’ADN complémentaire, mettez en place la réaction sur de la glace en ajoutant les réactifs, le tampon et les enzymes. Ensuite, utilisez un vortex pour mélanger doucement les réactifs et incubez à 16 degrés Celsius pendant deux heures. Une fois l’ADN synthétisé, purifiez l’ADN complémentaire à l’aide d’un kit de purification PCR.

Ensuite, défragmentez l’ADN double brin, utilisez un sonificateur à bain d’eau et un tube de 1,5 millilitre pour partager l’ADN à une taille de 250 à 500 paires de bases pendant trois fois 10 minutes ou quatre fois 10 minutes. Ensuite, préparez la bibliothèque et effectuez le séquençage de nouvelle génération. Ici, des images en contraste de phase de cellules souches embryonnaires ont été capturées pour visualiser les colonies de cellules souches.

Dans ce protocole, les cellules ont été cultivées en présence ou en l’absence de fibroblastes embryonnaires de souris inactivés mitotiquement avec LIF et/ou GSK3i dans les milieux de culture afin d’empêcher la différenciation des cellules. Ensuite, pour visualiser l’efficacité de la sonication de la chromatine de la cellule souche embryonnaire réticulée, de l’ADN double brin soniqué a été chargé sur un gel d’agarose à 2 %. L’image du gel montre une chromatine cisaillée dans la gamme de 200 à 500 paires de bases.

Ensuite, des banques ChIP-Seq ont été générées et séquencées à l’aide d’une plateforme de séquençage de nouvelle génération pour évaluer l’occupation à l’échelle du génome d’une enzyme modifiant les histones et les modifications des histones dans les cellules souches embryonnaires. À partir de la vue personnalisée du navigateur UCSC, la triméthylation enrichie de H3K4, la diméthylation de H3K4 et KDM5B sont visibles au niveau du gène régulateur de pluripotence de base, POU5F1 et du cluster HOXC. L’analyse CARIP-Seq a également été réalisée pour évaluer les ARN associés à la chromatine dans les cellules souches embryonnaires.

La vue personnalisée du navigateur UCSC montre l’ARN associé à la triméthylation H4K20 et l’occupation de la triméthylation H4K20 dans les cellules souches embryonnaires. D’après les résultats de CARIP-Seq, on peut interpréter que, bien que l’ARN soit associé à la triméthylation de H4K20, il pourrait ne pas interagir avec le locus particulier. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier les ARN associés à la chromatine à l’aide de CARIP-Seq et d’identifier les interactions protéine-ADN à l’échelle mondiale dans les cellules souches embryonnaires.