Name: CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez les méthodes ChIP-Seq et CARIP-Seq pour cartographier les interactions protéine-ADN et les ARN associés à la chromatine dans les cellules souches embryonnaires. Ces techniques avancées permettent d'étudier l'épigénétique et la biologie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, une bourse du National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01 a 1) attribué à B.L.K. Ce travail a utilisé la Wayne State University Haute Performance Computing Grid pour des ressources informatiques (< https://www.grid.wayne.edu/>). Nous remercions Jiji Kurup d’assistance avec l’analyse des données CAIRP-Seq.
DE CONTRIBUTIONS DES AUTEURS :
B.L.K. conçoit la méthode CAIRP-Seq, conçu et réalisé des expériences de la ChIP-Seq et CAIRP-Seq, ont analysé les données de séquençage et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale de ce manuscrit.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

ChIP-Seq est une méthode utile pour évaluer l’emplacement des interactions protéine-ADN global (e.g., facteurs de transcription/histone modifiant les modifications d’enzymes/histone et l’ADN) dans les cellules ES, tandis que le protocole de CAIRP-Seq nouvellement développé est utile dans interroger l’association génome d’ARN avec des constituants de la chromatine. ChIP-Seq est un outil fondamental qui sert à évaluer les paysages épigénétiques des cellules ES et autres types de cellules. La qualité de ChIP-Seq et...

Décisions de devenir cellules souches embryonnaires (ES) sont réglementées par la communication entre des signaux extracellulaires et une foule de régulateurs transcriptionnels, y compris les modificateurs d’histone et traduction après modification des queues d’histone. Ces interactions facilitent l’accessibilité de la chromatine et l’emballage de la chromatine dans l’un des deux États : euchromatine, qui est ouvert et transcriptionally actif, et l’hétérochromatine, qui est compact et généralement transcriptionnellement inactif. Facteurs de transcription et les affinités de liaison de séquence spécifique d’ADN modificateurs épigénétique associé régions euchromatiques à participer dans le contrôle de l’expression des gènes. Méthodes de séquençage de nouvelle génération, dont ChIP-Seq1, ont grandement contribués à cartographier le génome réseaux transcriptionnels qui sont fondamentales pour ES cellules autorenouvellement et pluripotence2,3,4 ,5,6. De plus, tout en immunopreciation RNA suivie de prochaine génération séquençage (RIP-Seq)7 évaluations des interactions ARN-protéine suggèrent que protéines liant l’ADN interagissent avec l’ARN pour réglementer les événements transcriptionnelle7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, peu d’études ont étudié la localisation de tout le génome d’ARN associée à la chromatine12ou interactions globales entre les ARN et histone modifications. Longtemps non codantes RNAs (lncRNAs) sont une classe d’ARN qui ont été trouvés à réguler l’activité des protéines associées à la chromatine13,14,15. Par exemple, Xist est un lncRNA qui réglemente, dans les cellules mammifères femelles, inactivation d’un chromosome X, grâce au recrutement de répresseurs épigénétique16,17. Toutefois, l’éventail complet des ARN associée à la chromatine est en grande partie inconnu. Nous décrivons ici un protocole roman, associée à la chromatine RNA immunoprécipitation (CAIRP) suivi par séquençage de prochaine génération (CAIRP-Seq), pour identifier les ARN associée à la chromatine sur une base du génome dans les cellules ES, y compris la préparation de la bibliothèque pour séquençage de prochaine génération et ChIP-Seq pour mapper l’occupation globale des modifications d’histone, facteurs de transcription et modificateurs de l’épigénétiques. Contrairement aux autres méthodes de RIP-Seq7, CAIRP-Seq inclut des étapes de réticulation et sonication, permettant l’identification directe d’ARN associée à la chromatine. Ensemble, ChIP-Seq est un outil puissant pour identifier les interactions protéine-ADN de Génome-large, tandis que CAIRP-Seq est une méthode puissante d’arpenter RNAs sont associées aux composantes de la chromatine.

<table><tbody><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie de souris (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 or 107 units</td></tr><tr><td>GSK3&beta ; inhibiteur CHIR99021 (GSK3i)</td>Solvant <td>Stemgent</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>inhibiteur de MEK PD0325901 (MEKi)</td>Solvant <td>Stemgent</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glucose élevé</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol (50 mM)</td><td>Solution</td><td>d’acides</td> aminés non essentiels Gibco 31350010 <td></td></tr><tr><td>MEM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Sérum de veau fœtal qualifié pour les cellules, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1 % Solution de gélatine</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1,25 M de stock de conentration dans l’eau</td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8,0 1X</td><td>Qualité Biologique</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>Solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate solution (20 %)</td><td>Qualité Biologique</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 sonifier</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solution</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protéine G pour l’immunoprécipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protéine A pour l’immunoprécipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protéine A/Protéine G et Magnet Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td> Chlorure de <td></td></tr><tr><td>lithium</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Kit de purification de l’ARNm (pour la purification de l’ARNm à partir de préparations d’ARN totales)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Synthèse d’ADNc double brin Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Purification PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr ; 5' exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX gels d’agarose, 2 %</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion master-mix haute fidélité 2X avec tampon HF</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ Triméthyl-Histone H3 (Lys4) - Anticorps validé ChIP</td><td>Anticorps EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-histone H3 (di méthyl K4) [Y47] - Grade ChIP (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire à fond plat Corning Costar (6 puits)</td><td></td><td></td>Boîtes de culture tissulaire standard Fisher 720083 <td></td></tr><tr><td>Falcon (10cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction</td> Kit <td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H4 (tri méthyl K20) anticorps - ChIP Grade (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur Labquake</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Plateforme Illumina HiSeq Illumina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

cairp-seq et chip-seq : méthodes pour identifier les arn associée à la chromatine et interactions protéine-adn dans les cellules souches embryonnaires

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires (ES) et de différenciation est régie par des signaux extrinsèques et intrinsèques réseaux de facteurs de transcription, régulateurs épigénétiques et traduction après modification des histones qui combinatoirement influent sur le gène État d’expression des gènes voisins. RNA a également été montré pour interagir avec diverses protéines pour réguler la dynamique de la chromatine et expression du gène. Immunoprécipitation de RNA associées à la chromatine (CAIRP) suivie de la nouvelle génération séquençage (CAIRP-Seq) est une nouvelle méthode pour sonder l’ARN associée à des protéines de la chromatine, tandis que de l’immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage de prochaine génération ( ChIP-Seq) est une technique puissante de génomique pour mapper l’emplacement du post-traductionnelles des histones, facteurs de transcription et épigénétiques modificateurs à l’échelle mondiale-dans les cellules ES. Nous décrivons ici les méthodes pour exécuter CAIRP-Seq et ChIP-Seq, y compris la construction de la bibliothèque de SEQUENÇAGE de nouvelle génération, pour générer des global associées à la chromatine RNA et épigénomique cartes dans les cellules ES.

Nous avons interrogé avec succès la liaison pangénomique du H3K4me3, H3K4me2 et KDM5B dans les cellules ES ce ChIP-Seq protocole6. ES cellules ont été cultivées dans des conditions sans chargeur (Figure 1) et réticulé comme décrit ci-dessus. Sonication a été effectuée tel que décrit à l’étape 3.2 du protocole ChIP-Seq et évalués par l’ADN en cours d’exécution sur un gel d’agarose à 2 % (Figure 2). Ensuite,...

Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer des ChIP-Seq et cartes de CAIRP-Seq, y compris la préparation de la bibliothèque pour l’ordonnancement de nouvelle génération, pour générer l’épigénomique global et l’ARN associée à la chromatine dans les cellules ES.

CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

L’objectif global de CARIP-Seq est d’étudier les ARN associés à la chromatine à l’échelle du génome. L’objectif de ChIP-Seq est d’évaluer les interactions protéine-ADN à l’échelle mondiale dans les cellules souches embryonnaires. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’épigénétique et des cellules souches, à identifier l’emplacement du génome, les facteurs de transcription ou le régulateur épigénétique, la liaison ou l’occupation de la modification des histones, ou les ARN associés à la chromatine dans les cellules souches embryonnaires.Le principal avantage de ces techniques est qu’elles permettent l’interrogation impartiale à l’échelle du génome des ARN associés aux constituants de la chromatine et l’identification globale des interactions entre l’ADN des protéines. Bien que ces méthodes puissent donner un aperçu de la biologie des cellules souches embryonnaires, elles peuvent également être appliquées à d’autres types de cellules de mammifères pour étudier la biologie du cancer ou d’autres maladies humaines. Pour récolter les cellules souches embryonnaires, lavez d’abord les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate.Ensuit

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

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Developmental Biology

Biologie du développement

La différenciation de l'ESC coïncide avec un type de cellule des changements spécifiques dans la structure et la composition de la chromatine. La détection de ces changements fournit de précieuses indications sur les mécanismes qui définissent stemcellness et la différenciation cellulaire. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) représente une méthode utile pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation des cellules souches.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

Nous démontrons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) méthode pour identifier les interactions de facteurs au tissu-spécifique des gènes pendant ou après l'apparition de tissu-spécifique l'expression des gènes dans les tissus embryonnaires de souris. Ce protocole devrait être largement applicable pour l'étude de l'activation de gènes spécifiques de tissus comme il se produit pendant le développement embryonnaire normal.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Cette vidéo montre les étapes de base pour effectuer une analyse du transcriptome entier sur des échantillons de moelle épinière embryonnaire de poussin disséqués après transfection avec électroporation in ovo.

ARN-Seq analyse de l&#39;expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

La question de savoir comment les organismes de réglementation et des états de la chromatine chromatine affecte le génome in vivo est essentielle à notre compréhension de la façon dont les premières décisions du destin cellulaire sont faites dans l'embryon en développement. ChIP-Seq-la méthode la plus populaire pour étudier les caractéristiques de la chromatine au niveau-est globale définie ici pour les embryons de xénope.

Snapshot échelle du génome des régulateurs de la chromatine et les États dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons par Chip-Seq

Un règlement de réglage fin de la transcription des gènes à la base embryonnaire décision du destin cellulaire. Nous décrivons ici des analyses d'immunoprécipitation de chromatine utilisées pour étudier la régulation épigénétique de la différenciation cardiaque des cellules souches et le développement cardiaque d'embryons de souris.

Régulation épigénétique de Cardiac Différenciation des cellules et tissus souches embryonnaires

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

La détermination précise des emplacements liant les protéines dans l’ensemble du génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. Ici nous décrivons une méthode génomique de cartographie qui traite l’ADN chromatin-immunoprécipité avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) suivie du séquençage à haut débit. Cette méthode détecte les interactions protéine-ADN avec une résolution cartographique proche de la paire de base et un rapport signal-bruit élevé chez les neurones mammifères.

Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

Ce protocole fournit un pipeline de calcul rationalisé pour quantifier les transcrits d’amplificateurs naissants. En intégrant l’accessibilité de la chromatine, les caractéristiques de la chromatine et les données transcriptionnelles, il permet une détection précise et une analyse spécifique du brin de l’activité des amplificateurs dans des régions intragéniques complexes, tout en restant accessible aux chercheurs sans formation approfondie en bioinformatique.

Un pipeline informatique pour la quantification de l’ARN amplificateur intergénique/intragénique dans les cellules souches embryonnaires de souris

Ici, nous présentons un protocole pour capturer les interactions ADN-ADN chromatine associées à l’ARN afin de cartographier l’organisation tridimensionnelle du génome liée à l’ARN.

Méthode d’interaction ADN-ADN chromatine associée à l’ARN

Une méthode ChIRP à base d’UV pour identifier les interactions directes entre lncRNA et protéine.

Une méthode chIRP à base d’UV pour l’identification vérifiable des protéines qui interagissent directement avec lncRNA : des cellules cultivées au testicule de souris

Découvrez les méthodes ChIP-Seq et CARIP-Seq pour cartographier les interactions protéine-ADN et les ARN associés à la chromatine dans les cellules souches embryonnaires. Ces techniques avancées permettent d'étudier l'épigénétique et la biologie cellulaire.

CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal

CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires

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