Levator Auris Longus Préparation pour l’examen de la Transmission neuromusculaire mammifères dans des Conditions de tension de serrage

L’objectif global de cette procédure est d’isoler le muscle releveur de l’auris long et son nerf afin d’enregistrer les courants synaptiques à la jonction musculaire neurale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de la physiologie synaptique telles que la taille du courant de la plaque d’extrémité, le contenu quantal, la probabilité de libération et les relations entre la neurotransmission et l’excitabilité musculaire. Le principal avantage de cette technique est que les enregistrements électrophysiologiques détaillés d’une seule synapse peuvent facilement être combinés avec des expériences optiques de cellules vivantes.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la fonction synaptique et de la communication en retour entre les nerfs et les muscles, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes allant de la drosophile aux mammifères. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés parce que la préparation des muscles nerveux des mammifères est fragile, en particulier le nerf. L’acquisition et l’interprétation minutieuses des données de la pince de tension ultérieures peuvent également s’avérer difficiles.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Steve Burke, de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, faites sous un microscope à stéréo-dissection une petite incision dans la peau sur le dos de la souris au niveau des omoplates.

Utilisez une paire de ciseaux de microdissection. Coupez la peau sur la tête et le dos. Ensuite, tirez la peau vers le haut le long de l’incision près des omoplates.

Coupez les muscles qui sont inférieurs à la LAL en commençant par l’omoplate droite. Ensuite, soulevez doucement le tissu coupé immédiatement à droite de la ligne médiane. Faites une incision vers l’oreille gauche avec les lames des ciseaux pressées contre le crâne pour enlever plusieurs couches de muscle qui sont inférieures à la LAL gauche.

Évitez de couper le nerf qui innerve le LAL qui s’enroule autour du conduit auditif et pénètre dans les muscles du côté médial de l’oreille. Continuez à couper à travers le conduit auditif en gardant autant de nerf attaché que possible. Ensuite, coupez le tissu adipeux derrière le conduit auditif le long de la partie ventrolatérale de l’oreille.

Coupez le long de l’omoplate gauche de la même manière que les procédures effectuées sur le côté droit pour retirer complètement le muscle de la souris. Ensuite, coupez le pavillon de l’oreille le long de la base en laissant la partie cartilagineuse de l’oreille attachée au LAL. Retournez le muscle de manière à ce que le côté inférieur soit tourné vers le haut.

Pour isoler le muscle LAL, placez le LAL et le tissu environnant dans une boîte de Pétri avec un fond en élastomère de silicium et épinglez le tissu disséqué au fond. Lavez fréquemment les tissus dans une solution saline physiologique. Ensuite, placez une épingle à insectes dans le conduit auditif pour maintenir la préparation en place.

À l’aide de broches plus petites, épinglez le tissu restant du côté opposé de la ligne médiane de la LAL. Utilisez une paire de pinces. Tirez doucement la peau vers le haut sur la partie latérale de l’oreille pour étirer le muscle et placez une petite épingle à travers la peau.

Répétez cette étape jusqu’à ce que le mouchoir soit bien fixé au plat. Retirez les muscles qui recouvrent la LAL et ceux qui sont liés à la LAL par le tissu conjonctif et qui sont particulièrement tendus près de la ligne médiane. Par la suite, tirez vers le haut la couche musculaire sus-jacente et coupez le tissu conjonctif avec les lames orientées vers la couche musculaire tirée.

Coupez vers la ligne médiane jusqu’à environ 3/4 de la ligne médiane et continuez à retirer les couches musculaires jusqu’à ce qu’il ne reste que le LAL. Pendant le processus de nettoyage, assurez-vous que les nerfs ne sont pas endommagés. Ensuite, retirez une partie du tissu conjonctif restant qui recouvre le LAL pour aider à l’empalement des électrodes.

N’enlevez que les tissus qui peuvent être faits facilement sans risquer d’endommager le LAL dans le processus. Pour identifier le nerf qui innerve le LAL, à l’aide d’un stimulateur nerveux, touchez les nerfs avec le stimulateur nerveux. Lorsque le muscle se contracte, le bon nerf a été identifié.

Ensuite, saisissez soigneusement le tissu près du nerf et utilisez des ciseaux à ressort pour séparer le nerf du tissu entourant l’oreille. Pour minimiser les dommages, gardez la majeure partie du nerf incrustée dans un tissu environnant qui sera utilisé plus tard pour fixer le nerf à la boîte d’enregistrement. À ce stade, l’enquêteur peut prendre une pause d’une heure à condition que le LAL soit baigné dans 20 millilitres ou plus d’une solution saline physiologique.

Ensuite, détachez et transférez le muscle dans un insert de platine sous le microscope de dissection pour les expériences d’électrophysiologie. Épinglez le muscle aux extrémités et le long de son bord. Positionnez le nerf perpendiculairement aux fibres musculaires et épinglez-le au fond de la boîte à travers un excès de tissu qui a été laissé intact à l’extrémité du nerf.

Gardez le tissu baigné dans une solution saline physiologique en tout temps. Pour les expériences d’électrophysiologie, fixez la chambre de perfusion avec le LAL à la platine du microscope. Placez l’électrode de référence dans une coupelle remplie de chlorure de potassium à trois molaires qui est reliée à la chambre d’enregistrement par un pont de gélose.

À ce stade, positionnez l’électrode de stimulation nerveuse sur le nerf. Exposez la préparation LAL à 4-Di-2-Asp pendant 10 minutes pour obtenir une florescence adéquate pour la visualisation des jonctions neuromusculaires. Après 10 minutes, remplacez la solution de 4-Di-2-Asp par la solution de calcium normale.

Pendant ce temps, remplissez les capillaires en verre avec les solutions appropriées pour les électrodes de détection de tension et de passage de courant. Tapotez doucement le capillaire pour éliminer les bulles d’air et fixez le capillaire rempli dans le porte-électrode sur la tête. À l’aide d’un microscope vertical avec un éclairage standard en champ clair et en fluorescence, recherchez une bande brillante de jonctions neuromusculaires vertes fluorescentes perpendiculaires aux fibres musculaires le long de la préparation avec un objectif d’immersion dans l’eau à faible grossissement.

Ensuite, passez à un objectif d’immersion dans l’eau à plus fort grossissement pour identifier une jonction neuromusculaire sur la couche supérieure du muscle afin de l’examiner par électrophysiologie. En utilisant principalement un champ clair, positionnez l’électrode au-dessus de la membrane musculaire à moins de 100 microns de la jonction neuromusculaire identifiée. Cette figure montre un exemple des impulsions de courant et des réponses en tension d’une fibre LAL sous pince ampèremétrique d’une souris R62 de type sauvage âgée de 12 semaines.

Les enregistrements ont été obtenus dans une solution saline physiologique normale et la présence de mEPPs indique que ces enregistrements ont été prélevés sur la plaque d’extrémité du moteur. Voici un enregistrement représentatif d’un EPC et de deux mEPC obtenus à la condition d’une pince de tension. Cette figure montre les EPC et mEPC superposés à partir d’une fibre représentative.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie de cellules vivantes avec des colorants membranaires tels que FM143 ou l’histologie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions liées à l’absorption de la libération des vésicules ou aux changements morphologiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie pour explorer la transmission synaptique et la communication nerveuse-cellulaire dans des organismes allant de la drosophile aux mammifères.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler le muscle releveur innervé de l’auris long afin d’enregistrer les courants synaptiques à la jonction neuromusculaire. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre grand soin de retirer le tissu musculaire attaché au LAL et d’isoler le nerf.