Name: Levator Auris Longus Préparation pour l’examen de la Transmission neuromusculaire mammifères dans des Conditions de tension de serrage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez la préparation du muscle levator auris longus chez la souris pour étudier la transmission synaptique neuromusculaire par enregistrements électrophysiologiques. Cette méthode permet d'analyser les courants synaptiques et la communication nerve-muscle.

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Nous remercions le Dr Mark M. Rich et Daniel Miranda commentaires éditoriaux, Ahmad Khedraki pour aider à mettre en place cette technique et Wright State University de soutien financier (fonds de démarrage de A.A.V.).

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<li>Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neurotransmitter+release+at+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease.</a> J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).</li>
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<li>Silveira, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+and+inositol+triphosphate+receptors+modulate+facilitation+and+tetanic+depression+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).</li>
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<li>Miranda, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+Cl-+channel+defects+reveal+disrupted+skeletal+muscle+maturation+in+R6%2F2+Huntington%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice.</a> J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Décrite ici est la préparation et l’utilisation de la souris muscle Lacroix pour la mesure de la transmission neuromusculaire dans des conditions de courant ou de tension-clamp. Il y a plusieurs points importants à considérer pour la dissection de la LAL. Nettoyage des excès du tissu conjonctif du sida de muscle en impalement électrode, comme les électrodes peut accrocher le tissu conjonctif quand leur positionnement pour empalement. Cependant, seulement enlever du tissu conjonctif qui peut être enlevé facilement pour li...

Étude de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire permet de mieux comprendre la relation dynamique entre les systèmes musculaires, nerveux et squelettiques et est un excellent modèle pour étudier la physiologie synaptique. Le releveur auris longus (LAL) est un muscle mince, permettant au niveau des jonctions neuromusculaires à visualiser facilement. Les rapports précédents ont décrit la commodité d’utiliser la LAL pour examiner les toxines et les médicaments synaptiques et ont caractérisé les caractéristiques de type de fibre musculaire squelettique de la LAL1,2. De nombreuses études ont utilisé la LAL pour étudier la physiologie neuromusculaire3,4,5,6,7,8. Pour l’électrophysiologie, la capacité d’observer facilement les jonctions neuromusculaires LAL permet le positionnement précis des microélectrodes à la plaque de serrage moteur et réduit considérablement les problèmes de serrage d’espace dans l’enregistrement de la transmission synaptique. Enregistrements de courant-clamp des propriétés de la membrane musculaire, comme la constante de temps membranaire (τm) et la résistance d’entrée (Rde) sont facilement obtenus. En outre, ces propriétés peuvent être mesurées de fibres musculaires mêmes utilisés pour enregistrer la transmission neuromusculaire, ce qui permet une comparaison directe de la fonction synaptique pour les propriétés de la membrane musculaire. L’analyse de ces données peut fournir des clés mieux comprendre les mécanismes physiques de beaucoup de maladies neuromusculaires et d’États d’activité altérée.
Un aspect clé de la technique décrite ici est l’utilisation de voltage clamp pour enregistrements synaptiques, qui ne sont pas soumis les non-linéarités rencontrées en courant-clamp et sont indépendants des propriétés de la membrane musculaire. Avantages de l’utilisation de voltage clamp par opposition au courant-clamp pour étudier la transmission neuromusculaire ont été établis par le pionnier des efforts dans les années 19509. Sous courant-clamp, produits écologiques qui dépassent de 10 à 15 mV en amplitude ne sont pas un produit linéaire de la MAET amplitude9. Par exemple, si l’aménagement du territoire moyen est de 1 mV, un PPE de 5 mV peut être considérée comme le produit de 5 mEPPs (QC du 5) ; considérant que, un PPE de 40 mV sera le fruit de plus de 40 mEPPs. Cette non-linéarité à plus grandes EPPs se produit parce que la force motrice pour le PPE, qui est la différence entre le potentiel de membrane et le potentiel d’équilibre pour le récepteur de l’acétylcholine (~ -10 mV), diminue sensiblement pendant grands EPPs. Ce problème est évité dans les expériences de voltage clamp parce que le potentiel de membrane de muscle ne change pas au cours d’expériences de voltage clamp. Un inconvénient est que les expériences de voltage clamp sont techniquement plus difficiles à accomplir que l’enregistrement courant-clamp. Dans cette optique, McLachlan et Martin mis au point une simple correction mathématique qui prend en compte les non-linéarités en courant-clamp enregistrements EPPs10. Les corrections fonctionnent bien11,12,13, mais ce qui est important, supposent que les propriétés de la membrane musculaire n’ont pas été perturbées.
Les propriétés de la membrane musculaire sont particulièrement importantes à considérer si l’étude de conditions ou états pathologiques qui perturbent le muscle. Par exemple, le muscle squelettique du modèle transgénique R6/2 de la maladie de Huntington est hyperexcitables due à une réduction progressive dans le repos de chlorure et potassium courants14,15. En conséquence, mEPPs et EPPs sont amplifiés dans le muscle squelettique de la R6/2. Certes, d’autres facteurs peuvent modifier mEPPs et EPPs. Travailler avec un autre modèle de souris de la maladie de Huntington (R6/1) trouvé des modifications des produits écologiques qui semblent être associés à des protéines SNARE8. Afin d’évaluer les mécanismes provoquant l’altération de la transmission neuromusculaire, il serait avantageux d’éliminer les effets des propriétés de la membrane musculaire altéré en utilisant un voltage clamp. Dans une étude récente, la transmission neuromusculaire R6/2 a été étudiée dans les deux conditions de bride de tension et de courant en utilisant la technique décrite dans les présentes. L’intégralité des plateaux moteur étaient voltage clamp avec moins de 1 % d’erreur en plaçant deux microélectrodes dans la constante de la longueur de la plaque de serrage16. Il a été montré que la tension-pince et corrigé les documents courant-clamp ont donné des mesures contrastées de la transmission neuromusculaire dans le muscle R6/2. Ceci met en évidence qu’il peut être difficile à corriger EPPs pour les non-linéarités si les propriétés de la membrane musculaire ont été modifiées et montre les avantages d’obtenir des enregistrements de voltage clamp qui sont indépendants des propriétés de la membrane musculaire. Le protocole présenté ci-après est idéal pour l’examen des conditions ou des états pathologiques qui influent sur la transmission synaptique et les propriétés de la membrane postsynaptique.

<table><tbody><tr><td>Microscope composé Olympus</td><td></td><td>Olympus BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 10x</td><td>Objectif Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x Olympus</td><td></td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Santa Barbara Instruments Group</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Générateur</td><td>Isolateur</td> de stimulus AMPI <td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex</td><td></td> Logiciel d’acquisition et d’analyse de données Logiciel <td></td><td></td></tr><tr><td>d’acquisition et d’analyse de données</td><td></td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Électrode bipolaire concentrique</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur à rotule</td><td>Narishige&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues non métalliques Calibre 34</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Nikon</td><td></td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>n° 5 Pinces</td><td>Outils</td><td></td><td></td>de science fine</tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td> Outils <td>de science fine 15006-09</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N° 2 Pince</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection Ciseaux</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Stimulator</td><td>Grass Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model P-1000 Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 Système d’acuisition de données à faible bruit</td><td>Dispositifs moléculaires Filtre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>passe-bas Bessell Warner</td><td>Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur gaucher</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur droitier</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Manette de mouvement unique</td><td>Siskiyou Corp.</td>Micromanipulateur à rouleaux croisés <td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>Il a été ajouté à l’axe Z des micromanipulateurs gauchers et droitiers pour permettre à l’axe Z d’être motorisé. Cette configuration personnalisée est moins chère et moins encombrante que l’achat d’un micromanipulateur motorisé à 4 axes. Il nous permet également de contrôler les deux micromanipulateurs avec un seul contrôleur</td></tr><tr><td>Tous les produits chimiques ont été commandés par Fisher, à l’exception</td><td></td><td></td><td></td> de</tr> <tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>Les sondes moléculaires ne sont plus une entreprise. Maintenant commandé par Fisher</td></tr></tbody></table>

levator auris longus préparation pour l’examen de la transmission neuromusculaire mammifères dans des conditions de tension de serrage

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Ce protocole décrit une technique d’enregistrement transmission synaptique de la jonction neuromusculaire dans des conditions de courant-clamp et voltage clamp. Une préparation ex vivo de la levator auris longus (LAL) est utilisée parce que c’est un muscle mince permettant de faciliter la visualisation de la jonction neuromusculaire impalement microélectrode à la plaque de serrage moteur. Cette méthode permet l’enregistrement des potentiels de plaque d’extrémité de miniatures spontanée et courants (mEPPs et avaient), évoquée par le nerf endplate potentiels et courants (EPPs et EPCs), ainsi que les propriétés de la membrane de la plaque de serrage moteur. Résultats obtenus par cette méthode incluent le contenu quantique (QC), nombre de sites de libération vésiculaire (n), les probabilités de la libération des vésicules (prel), facilitation synaptique et la dépression, ainsi que la constante de temps de membrane musculaire (τ m) et la résistance d’entrée. L’application de cette technique de modèles murins de la maladie humaine peut mettre en évidence les principales pathologies dans les états pathologiques et aider à identifier des stratégies de traitement novateur. Par tension-serrage entièrement une seule synapse, cette méthode fournit une des analyses plus détaillées de la transmission synaptique actuellement disponible.

Figure 8 montre un exemple de l’impulsions de courant (Figure 8 a) et les réponses de la tension (Figure 8 b) d’une fibre LAL sous courant-clamp d’un type sauvage de 12 semaines R6/2 souris. La présence de mEPPs indique que ces documents proviennent de la plaque de serrage moteur. Les enregistrements ont été obtenus dans une solution physiologique normale. Ces enregistrements de courant-clamp peuvent...

Le protocole décrit dans cet article utilise le muscle levator auris longus (LAL) souris pour enregistrer spontanée et évoquée par le nerf des potentiels post-synaptiques (courant-clamp) et des courants (voltage clamp) à la jonction neuromusculaire. Utilisation de cette technique peut éclairer les clés dans les mécanismes de la transmission synaptique dans des conditions normales et la maladie.

Levator Auris Longus Préparation pour l’examen de la Transmission neuromusculaire mammifères dans des Conditions de tension de serrage

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler le muscle releveur de l’auris long et son nerf afin d’enregistrer les courants synaptiques à la jonction musculaire neurale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de la physiologie synaptique telles que la taille du courant de la plaque d’extrémité, le contenu quantal, la probabilité de libération et les relations entre la neurotransmission et l’excitabilité musculaire. Le principal avantage de cette technique est que les enregistrements électrophysiologiques détaillés d’une seule synapse peuvent facilement être combinés avec des expériences optiques de cellules vivantes.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la fonction synaptique et de la communication en retour entre les nerfs et les muscles, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes allant de la drosophile aux mammifères. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés parce que la préparation des muscles nerveux des mammifères est fragile, en particulier le nerf. L’acquisition et l’interprétation minutieuses des données de la pince de tension ultérieures peuvent également s’avérer difficiles.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Steve Burke, de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, faites sous un microscope à stéréo-dissection une petite incision dans la peau sur le dos de la souris au niveau des omoplates.Utilisez une paire de ciseaux de microdissection. Coupez la peau sur la tête et le dos. Ensuite, tirez la peau vers le haut le long de l’incision près des omoplates.Coupez les muscles qui sont inférieurs à la LAL en commençant par l’omoplate droite. Ensuite, soulevez doucement le tissu coupé immédiatement à droite de la ligne médiane. Faites une incision vers l’oreille gauche avec les lames des ciseaux pressées contre le crâne pour enlever plusieurs couches de muscle qui sont inférieures à la LAL gauche.Évitez de couper le nerf qui innerve le LAL qui s’enroule autour du conduit auditif et pénètre dans les muscles du côté médial de l’oreille. Continuez à couper à travers le conduit auditif en gardant autant de nerf attaché que possible. Ensuite, coupez le tissu adipeux derrière le conduit auditif le long de la partie ventrolatérale de l’oreille.Coupez le long de l’omoplate gauche de la même manière que les procédures effectuées sur le côté droit pour retirer complètement le muscle de la souris. Ensuite, coupez le pavillon de l’oreille le long de la base en laissant la partie cartilagineuse de l’oreille attachée au LAL. Retournez le muscle de manière à ce que le côté inférieur soit tourné vers le haut.Pour isoler le muscle LAL, placez le LAL et le tissu environnant dans une boîte de Pétri avec un fond en élastomère de silicium et épinglez le tissu disséqué au fond. Lavez fréquemment les tissus dans une solution saline physiologique. Ensuite, placez une épingle à insectes dans le conduit auditif pour maintenir la préparation en place.À l’aide de broches plus petites, épinglez le tissu restant du côté opposé de la ligne médiane de la LAL. Utilisez une paire de pinces. Tirez doucement la peau vers le haut sur la partie latérale de l’oreille pour étirer le muscle et placez une petite épingle à travers la peau.Répétez cette étape jusqu’à ce que le mouchoir soit bien fixé au plat. Retirez les muscles qui recouvrent la LAL et ceux qui sont liés à la LAL par le tissu conjonctif et qui sont particulièrement tendus près de la ligne médiane. Par la suite, tirez vers le haut la couche musculaire sus-jacente et coupez le tissu conjonctif avec les lames orientées vers la couche musculaire tirée.Coupez vers la ligne médiane jusqu’à environ 3/4 de la ligne médiane et continuez à retirer les couches musculaires jusqu’à ce qu’il ne reste que le LAL. Pendant le processus de nettoyage, assurez-vous que les nerfs ne sont pas endommagés. Ensuite, retirez une partie du tissu conjonctif restant qui recouvre le LAL pour aider à l’empalement des électrodes.N’enlevez que les tissus qui peuvent être faits facilement sans risquer d’endommager le LAL dans le processus. Pour identifier le nerf qui innerve le LAL, à l’aide d’un stimulateur nerveux, touchez les nerfs avec le stimulateur nerveux. Lorsque le muscle se contracte, le bon nerf a été identifié.Ensuite, saisissez soigneusement le tissu près du nerf et utilisez des ciseaux à ressort pour séparer le nerf du tissu entourant l’oreille. Pour minimiser les dommages, gardez la majeure partie du nerf incrustée dans un tissu environnant qui sera utilisé plus tard pour fixer le nerf à la boîte d’enregistrement. À ce stade, l’enquêteur peut prendre une pause d’une heure à condition que le LAL soit baigné dans 20 millilitres ou plus d’une solution saline physiologique.Ensuite, détachez et transférez le muscle dans un insert de platine sous le microscope de dissection pour les expériences d’électrophysiologie. Épinglez le muscle aux extrémités et le long de son bord. Positionnez le nerf perpendiculairement aux fibres musculaires et épinglez-le au fond de la boîte à travers un excès de tissu qui a été laissé intact à l’extrémité du nerf.Gardez le tissu baigné dans une solution saline physiologique en tout temps. Pour les expériences d’électrophysiologie, fixez la chambre de perfusion avec le LAL à la platine du microscope. Placez l’électrode de référence dans une coupelle remplie de chlorure de potassium à trois molaires qui est reliée à la chambre d’enregistrement par un pont de gélose.À ce stade, positionnez l’électrode de stimulation nerveuse sur le nerf. Exposez la préparation LAL à 4-Di-2-Asp pendant 10 minutes pour obtenir une florescence adéquate pour la visualisation des jonctions neuromusculaires. Après 10 minutes, remplacez la solution de 4-Di-2-Asp par la solution de calcium normale.Pendant ce temps, remplissez les capillaires en verre avec les solutions appropriées pour les électrodes de détection de tension et de passage de courant. Tapotez doucement le capillaire pour éliminer les bulles d’air et fixez le capillaire rempli dans le porte-électrode sur la tête. À l’aide d’un microscope vertical avec un éclairage standard en champ clair et en fluorescence, recherchez une bande brillante de jonctions neuromusculaires vertes fluorescentes perpendiculaires aux fibres musculaires le long de la préparation avec un objectif d’immersion dans l’eau à faible grossissement.Ensuite, passez à un objectif d’immersion dans l’eau à plus fort grossissement pour identifier une jonction neuromusculaire sur la couche supérieure du muscle afin de l’examiner par électrophysiologie. En utilisant principalement un champ clair, positionnez l’électrode au-dessus de la membrane musculaire à moins de 100 microns de la jonction neuromusculaire identifiée. Cette figure montre un exemple des impulsions de courant et des réponses en tension d’une fibre LAL sous pince ampèremétrique d’une souris R62 de type sauvage âgée de 12 semaines.Les enregistrements ont été obtenus dans une solution saline physiologique normale et la présence de mEPPs indique que ces enregistrements ont été prélevés sur la plaque d’extrémité du moteur. Voici un enregistrement représentatif d’un EPC et de deux mEPC obtenus à la condition d’une pince de tension. Cette figure montre les EPC et mEPC superposés à partir d’une fibre représentative.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie de cellules vivantes avec des colorants membranaires tels que FM143 ou l’histologie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions liées à l’absorption de la libération des vésicules ou aux changements morphologiques. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la physiologie pour explorer la transmission synaptique et la communication nerveuse-cellulaire dans des organismes allant de la drosophile aux mammifères.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler le muscle releveur innervé de l’auris long afin d’enregistrer les courants synaptiques à la jonction neuromusculaire. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre grand soin de retirer le tissu musculaire attaché au LAL et d’isoler le nerf.

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Levator Auris Longus Préparation pour l’examen de la Transmission neuromusculaire mammifères dans des Conditions de tension de serrage (Vidéo) | JoVE Journal

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