Name: Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Découvrez l'ablation neuronale par laser à deux photons chez les larves de Danio rerio pour étudier l'activité des circuits et les comportements de capture de proies. Cette méthode précise permet d'analyser les rôles fonctionnels des neurones prétectaux.

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Ces études ont été financées par des subventions provenance du MEXT, JSPS KAKENHI Grant numéros JP25290009, JP25650120, JP17K07494 et JP17H05984.

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts au rapport.

Bien que le deux photons laser a une excellente résolution spatiale pour spécifiquement l’ablation des neurones individuels, grande prudence convient pour éviter tout dommage non désiré sur le tissu cérébral en raison de la chaleur. L’étape la plus importante dans l’expérience d’ablation est de déterminer la quantité optimale d’irradiation laser. Irradiation insuffisante ne parvient pas à tuer les neurones. Trop d’irradiation sera endommagé par la chaleur le tissu environnant, ce qui donnera lieu à des effets indésirable...

Pour comprendre comment le comportement résulte de l’activité neuronale dans le cerveau, il est nécessaire d’identifier les circuits neurones qui sont impliqués dans la génération de ce comportement. Au stade larvaire, le poisson-zèbre fournit un modèle animal idéal pour étudier le fonctionnement du cerveau associées le comportement parce que leur cerveau petit, transparent permettre d’enquêter sur l’activité neuronale à une résolution cellulaire dans un vaste domaine de la cerveau tout en observant le comportement1. Imagerie de l’activité neuronale dans les neurones spécifiques est devenue possible grâce à l’invention des indicateurs génétiquement encodé calcium (Ca) (GECIs) comme GCaMP2. GCaMP zebrafish transgénique ont révélé utile permettant d’associer le circuit neuronal fonctionnel avec un comportement en procédant à l’imagerie Ca en se comportant des animaux3.
Alors que l’imagerie Ca peut démontrer les corrélations entre l’activité neuronale et comportement, pour montrer le lien de causalité, suppression de l’activité neuronale et les essais de ses conséquences sur le comportement sont des étapes importantes. Il existe différentes façons d’y parvenir : l’utilisation de la mutation génétique qui altère les circuits neuronaux spécifiques4, expression des neurotoxines de neurones spécifiques5,6, utilisation d’outils d’optogenetic comme halorhodopsin7, et laser ablation de neurones ciblés8,9. Ablation laser est particulièrement adaptée pour l’élimination de l’activité dans un relativement petit nombre de neurones spécifiques. Facilite l’élimination irréversible de l’activité neuronale en tuant les neurones évaluant les conséquences comportementales.
Un comportement intéressant que l'on peut observer au stade larvaire chez le poisson zèbre est la capture des proies (Figure 1A). Ce comportement guidé visuellement, ciblé fournit un système expérimental favorable pour l’étude de l’acuité visuelle10, visuomotor transformation11,12,13, perception visuelle et la reconnaissance des objets14,15,16,17,18et19de la prise de décision. Comment proies est reconnu par les prédateurs et comment la détection des proies mène à proie capture le comportement a été une question centrale dans la neuroéthologie20. Dans cet article, nous nous concentrons sur le rôle du circuit pretecto-hypothalamique formé par les saillies d’un noyau dans le prétectum (noyau pretectalis superficialis pars magnocellularis, ci-après, simplement remarqué que le prétectum) à la ILH. Ablation au laser de la prétectum a été montré pour réduire l’activité de capture des proies et d’abolir l’activité neuronale dans la ILH associé à la proie visual perception21. Ici, des protocoles pour l’exécution de laser ablation et tester son effet à l’aide de Ca2 + imagerie et enregistrement comportemental chez le poisson zèbre, les larves sont décrites.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>agarose à basse température de</td></tr><tr><td>fusion 6 cm boîte de Pétri</td><td>FALCON</td><td>Produit# :351007</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de dissection</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. N° 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Microscope à balayage laser à deux photons</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Objectif Carl Zeiss</td><td></td><td>63X</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>un microscope à épifluorescence</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Logiciel d’acquisition d’images Carl Zeiss</td><td></td><td>pour microscopes confocaux</td></tr> Joint <tr><td>de chambre d’hybridation Secure-Seal, 8 chambres, 9 mm de diamètre x 0,8 mm de profondeur</td><td>Sondes moléculaires</td><td>Catalogue # S-24732</td><td>Utilisé comme chambre d’enregistrement en imagerie Ca</td></tr><tr><td>Chambres d’imagerie</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell Chambres d’imagerie PCI-A-2.5</td><td>Utilisé comme chambre d’enregistrement comportemental</td></tr><tr><td>couteau chirurgical</td><td>MANI</td><td>Couteau ophtalmique MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>modèle :C11440-22CU</td><td>une caméra CMOS scientifique</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics Logiciel d’acuisition</td><td></td><td>d’image</td></tr><tr><td>Hard Disk Module Recording</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Un module logiciel qui permet d’enregistrer les fichiers vidéo sur un disque dur en peu de temps</td>SZX7 Olympus stéréoscope DF PL 0.5X Olympus <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>objectif pour SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>N° de produit GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>Caméra CMOS</td></tr><tr><td>XIMEA Caméra XIQ,</td><td>XIMEA</td><td>N° de produit. </td><td>Caméra CMOS</td>MQ042RG-CM</tr><tr><td>un anneau LED lumière</td><td>CCS</td><td>Modèle : LDR2-100SW2-LA</td><td>Blanc LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh 32&micro ; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Maille nylon 13&micro ; m</td><td>Écran Tokyo</td><td>N° 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Écran en métal 150 microns Écran</td><td></td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>en métal avec ouverture 75 microns</td><td>Écran</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td>en métal</tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Alimentation & Soins de santé, Co. Ltd.</td><td></td><td>levure de bière sèche</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td>, <td>un environnement de développement intégré pour la programmation</td></tr><tr><td>Mai-Tai, HP</td><td>Spectra Physics&nbsp ;</td><td></td><td>Laser à deux photons&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

ablation d’une population neuronale à l’aide d’un laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Pour identifier le rôle d’une sous-population de neurones dans le comportement, il est essentiel de tester les conséquences du blocage de son activité dans les animaux vivants. Ablation par laser de neurones est une méthode efficace à cet effet lorsque les neurones sont sélectivement marquées avec des sondes fluorescentes. Dans la présente étude, les protocoles pour laser ablation une sous-population de neurones à l’aide d’un microscope biphotonique et l’essai de ses conséquences fonctionnelles et comportementales sont décrits. Dans cette étude, le comportement de capture des proies chez les larves de poisson zèbre est utilisé comme un modèle d’étude. Le circuit pretecto-hypothalamique est connu pour sous-tendre cette proie pilotée par visuellement capture le comportement. Poisson zèbre prétectum étaient ablation au laser, et l’activité neuronale dans le lobe inférieur de l’hypothalamus (ILH ; la cible de la projection pretectal) a été examinée. Comportement de capture des proies après ablation pretectal a également été testé.

Neurones spécifiques ont été génétiquement marquées avec EGFP ou GCaMP6s, dont l’expression furent chassés dans les lignées Gal4. Un gSAIzGFFM119B de ligne de Gal4 a été utilisé pour étiqueter un noyau dans la zone pretectal (magnocellulaire superficiel pretectal noyau) et une sous-population de neurones du bulbe olfactif. Une autre ligne de Gal4, hspGFFDMC76A, a été utilisée pour marquer la ILH. Nous laser-ablation des neurones pretectal sur le plan bilatéral (panneau de gauche de<strong...

Nous présentons ici un protocole pour l’ablation d’une sous-population génétiquement marquée de neurones par un laser à deux photons de larves de poisson zèbre.

Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

L’objectif global de cette expérience est de tester l’effet de l’ablation laser de certains neurones sur l’activité et le comportement des circuits. Grâce à cette technique expérimentale, nous pouvons examiner la nécessité d’avoir des neurones dans un circuit sous-jacent au comportement. Cette méthode peut aider à répondre à nos questions clés dans le domaine du comportement et des neurosciences, telles que la façon dont les proies sont perçues et comment le comportement capturé par les proies est généré par l’activité neuronale.Le principal avantage de cette technique est que les neurones peuvent être spécifiquement ablatés en raison du marquage génétique de ces neurones et de la haute résolution spatiale du laser. Après avoir élevé les larves et les avoir montées dans de l’agarose à faible point de fusion à 2 %, selon le protocole de texte, placez les larves incrustées dans l’agarose sous un microscope à balayage laser à deux photons et démarrez le système de microscopie. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et, sous l’onglet laser, cliquez sur le bouton activé pour allumer le laser.Attendez que l’état du laser passe du mode occupé au mode verrouillé. Dans l’onglet canaux, r

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Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d'imagerie, l'imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Cette vidéo décrit le test de capture de proies. La vidéo traite de la méthode d’étude du comportement de capture de proies des larves de poisson-zèbre après l’ablation au laser de neurones spécifiques.

Essai de capture de proies : une méthode pour étudier le comportement de capture de proies de larves de poisson-zèbre

Cette vidéo décrit la méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant l’axotomie laser à deux photons et en observant la récupération axonale après une blessure.

L’axotomie laser à deux photons : une méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre et observer la récupération axonale

Cette vidéo montre la méthode d’étude de la détection visuelle des proies chez les larves de poisson-zèbre transgénique à l’aide de l’imagerie fluorescente basée sur des indicateurs calciques avec leurs neurones exprimant des complexes indicateurs de calcium fluorescents.

Analyse de l’activité neuronale évoquée par la proie chez une larve de poisson-zèbre transgénique

Source : Morsch, M.,  et al., Déclenchement du stress cellulaire et de la mort à l’aide de la microscopie confocale laser UV conventionnelle. J. Vis. Exp. (2017) &lt;p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'&gt;Dans cette vidéo, nous explorons la technique de l’ablation au laser UV de haute intensité pour cibler et étudier avec précision les neurones individuels chez le poisson-zèbre transgénique. Nous montrons comment...

Ablation sélective au laser d’un seul neurone chez une larve de poisson-zèbre à l’aide d’un microscope confocal

Source : Muto, A., et al. Ablation d’une population neuronale à l’aide d’un laser à deux photons et son évaluation à l’aide de l’imagerie calcique et de l’enregistrement comportemental chez les larves de poisson-zèbre. J. vis. exp. (2018) Dans cette vidéo, une procédure d’ablation laser à deux photons est démontrée, permettant la destruction sélective des neurones fluorescents chez les larves de poisson-zèbre immobilisées par l’agarose. L’imagerie à haute résolution avant et après...

Ablation neuronale ciblée par microscopie à deux photons dans un larava de poisson-zèbre

Bien que le système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes après une blessure, on en sait peu sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. L'utilisation en direct, le poisson-zèbre transgénique et un essai de section du nerf reproductible, nous pouvons étudier les comportements des cellules gliales dynamiques au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération.

Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

L’ablation au laser est une technologie largement applicable pour étudier la régénération dans les systèmes biologiques. Le protocole présenté décrit l’utilisation d’un microscope confocal standard de laser-balayage pour l’ablation de laser et la formation image time-lapse suivante des cellules interuromast régénérantes dans la ligne latérale de zebrafish.

Essai confocal d’ablation et de régénération au microscope dans les cellules interuromast de Zebrafish

Nous présentons ici un protocole permettant d’effectuer une imagerie calcique à deux photons dans le cerveau antérieur dorsal du poisson-zèbre adulte.

Imagerie calcique à deux photons de l’activité du cerveau antérieur chez le poisson-zèbre adulte

Ce protocole décrit une approche d’ablation laser à deux photons réalisée chez des larves de poisson-zèbre, qui sert de modèle pour étudier la régénération osseuse et les effets de la réponse immunitaire à l’ablation.

Ablation par laser à deux photons d’ostéoblastes chez des larves de poisson-zèbre en développement

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour examiner l’activité neuronale dans les régions cérébrales du poisson-zèbre transgénique qui expriment des indicateurs calciques GCaMP à l’aide de la microscopie confocale.

In vivo Imagerie confocale par fluorescence de l’activité neuronale induite par la stimulation sensorielle chez des larves de poisson-zèbre partiellement restreintes

Découvrez l'ablation neuronale par laser à deux photons chez les larves de Danio rerio pour étudier l'activité des circuits et les comportements de capture de proies. Cette méthode précise permet d'analyser les rôles fonctionnels des neurones prétectaux.

Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal

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