Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

L’objectif global de cette expérience est de tester l’effet de l’ablation laser de certains neurones sur l’activité et le comportement des circuits. Grâce à cette technique expérimentale, nous pouvons examiner la nécessité d’avoir des neurones dans un circuit sous-jacent au comportement. Cette méthode peut aider à répondre à nos questions clés dans le domaine du comportement et des neurosciences, telles que la façon dont les proies sont perçues et comment le comportement capturé par les proies est généré par l’activité neuronale.

Le principal avantage de cette technique est que les neurones peuvent être spécifiquement ablatés en raison du marquage génétique de ces neurones et de la haute résolution spatiale du laser. Après avoir élevé les larves et les avoir montées dans de l’agarose à faible point de fusion à 2 %, selon le protocole de texte, placez les larves incrustées dans l’agarose sous un microscope à balayage laser à deux photons et démarrez le système de microscopie. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et, sous l’onglet laser, cliquez sur le bouton activé pour allumer le laser.

Attendez que l’état du laser passe du mode occupé au mode verrouillé. Dans l’onglet canaux, réglez la longueur d’onde du laser sur 880 nanomètres pour l’ablation EGFP ou 800 nanomètres pour l’ablation GCaMP. Sélectionnez l’objectif subjectif 20X en déplaçant manuellement le revolver de l’objectif.

Ensuite, cliquez sur l’onglet de localisation, cliquez sur GFP pour modifier les chemins optiques et visualiser directement la fluorescence à l’œil nu. Centrez le cerveau de la larve de poisson-zèbre dans le champ de vision, puis cliquez sur l’onglet d’acquisition pour revenir à la microscopie à deux photons et régler la puissance et le gain du laser. Pour enregistrer la condition avant l’ablation, cliquez sur Pile Z pour sélectionner l’option Pile Z.

Ensuite, après s’être concentré sur l’extrémité ventrale du cerveau larvaire, cliquez sur le bouton set first pour définir la limite inférieure et après vous être concentré sur la surface la plus dorsale du cerveau, cliquez sur le dernier bouton set pour définir la limite supérieure. Enfin, cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience pour exécuter l’acquisition d’images de la pile Z. Ensuite, sélectionnez l’objectif subjectif 63X en déplaçant manuellement le revolver de l’objectif.

Ensuite, cliquez sur l’onglet Localiser pour passer à la microscopie à épifluorescence. Centrez les cellules à ablater à l’œil puis cliquez sur l’onglet d’acquisition pour revenir à la microscopie à balayage laser. Dans l’onglet Mode d’acquisition, définissez la taille du cadre sur 256 par 256.

Cliquez sur live et observez les neurones qui vous intéressent. Ensuite, en partant du côté le plus dorsal, trouvez un plan focal dans lequel les cellules à ablater sont focalisées. À l’aide de la fonction regions, marquez une petite zone circulaire d’environ 1/3 du diamètre de la cellule sur chaque neurone en tant que ROI.

Réglez la vitesse de balayage sur 13,9 secondes par 256 par 256 pixels, ce qui correspond à un temps de séjour laser d’environ 200 microsecondes par pixel ou 200 microsecondes par demi-micron. Définissez également le cycle d’itération sur quatre répétitions. Cliquez sur Démarrer l’expérience pour exécuter les fonctions de séries chronologiques et de blanchiment.

Comparez l’image avant l’ablation à l’image après l’ablation dans le cycle de série chronologique pour vous assurer que la fluorescence dans les cellules ciblées a disparu. Ensuite, déplacez le plan focal légèrement plus profondément et choisissez le plan focal suivant où les cellules non ablatées apparaissent. Effectuez la fonction de blanchiment comme nous venons de le démontrer et répétez le processus jusqu’à ce que toutes les cellules de la structure neurale d’intérêt aient été ablatées.

Après l’ablation, vérifiez que les cellules n’ont pas atteint la fluorescence abolie et répétez l’irradiation laser si nécessaire. Après l’irradiation, les larves doivent être récupérées. Faites soigneusement de minuscules coupes perpendiculaires dans l’agarose autour des larves.

Ensuite, attendez que le poisson sorte de l’agarose de lui-même lorsque l’anesthésique se dissipe. Après avoir élevé une paramécie et anesthésié une larve de poisson zèbre selon le protocole de texte, placez les larves dans de l’agarose à 2 % de point de fusion bas et retirez immédiatement tout excès d’agarose de sorte que la surface de l’agarose semble légèrement convexe. À l’aide d’une aiguille de dissection, orientez rapidement les larves en position verticale.

Ensuite, à l’aide d’un couteau chirurgical, faites quelques petites entailles dans l’agarose pour enlever l’agarose autour de la tête du poisson zèbre, ce qui laisse de l’espace pour que la paramécie puisse nager. Retirez soigneusement l’agarose résiduelle en versant doucement l’eau du système sur la chambre. Ensuite, mettez une paramécie dans la chambre d’enregistrement pour servir de stimulus visuel.

Placez ensuite la chambre d’enregistrement sous un microscope à épifluorescence équipé d’une caméra scientifique CMOS et sélectionnez un objectif 2,5X. Démarrez l’application d’acquisition d’images pour l’appareil photo équipé. Cliquez sur le volet de séquence et sélectionnez Enregistrement de disque dur dans le volet.

Dans la section des paramètres de numérisation, réglez le nombre d’images sur 900 ou tout autre nombre total d’images souhaité. Dans le volet de capture, réglez le temps d’exposition sur 30 millisecondes et le binning sur deux par deux. Cliquez sur en direct dans le volet de capture pour localiser les larves dans la vue et la mise au point de la caméra, puis cliquez sur arrêter en direct et cliquez sur le bouton de démarrage.

Enregistrez le film au format cxd et analysez les données selon le protocole texte. Après avoir configuré le système d’enregistrement comportemental et placé une larve dans une chambre d’enregistrement conformément au protocole textuel, utilisez une micro-pipette pour collecter 50 paramécies et les placer dans la chambre d’enregistrement. Pour placer une lamelle sur le dessus de la chambre d’enregistrement, mettez une petite goutte d’eau sur la lamelle avant de la placer sur la surface de l’eau de la chambre d’enregistrement pour éviter d’introduire de l’air dans la chambre.

Placez la chambre d’enregistrement dans le système d’éclairage. Ensuite, démarrez l’enregistrement en accéléré à 10 images par seconde pendant 11 minutes. Enfin, effectuez l’analyse selon le protocole texte.

Dans cette expérience avec la raie Gal4 qui marque les noyaux dans la zone prétectale et une sous-population de neurones du bulbe olfactif. Les neurones prétectaux ont été ablatés au laser bilatéralement. Les neurones olfactifs ont été ablatés en tant que contrôle.

Les résultats montrent que le laser à deux photons peut ablater les cellules ciblées tout en laissant les neurites adjacentes intactes. Dans cette expérience, la connectivité fonctionnelle des neurones prétectaux qui projettent leurs axones vers l’ILH ipsilatéralement a été étudiée. Le prétectum et l’ILH ont tous deux montré une activité neuronale en présence proximale de proie, ce qui suggère que les deux activités neuronales sont pilotées visuellement.

L’imagerie calcique a également été utilisée pour observer l’activité neuronale dans le prétectum et l’ILH chez les larves ablatées par les neurones prétectal. Le prétectum gauche qui a été ablaté au laser a montré une activité neuronale résiduelle ou nulle. De plus, l’ILH ipsilatérale présentait une activité neuronale considérablement déplacée, ce qui suggère que l’apport majeur à l’ILH provient du prétectum ipsilatéral.

En revanche, l’ILH de l’autre côté du prétectum ablaté au laser a montré une activité neuronale comparable à l’activité neuronale du prétectum ipsilatéral, ce qui suggère que l’ILH droite reçoit des informations du prétectum droit. Une fois maîtrisée, l’ablation au laser peut être effectuée en environ une heure pour chaque larve de poisson zèbre. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de n’ablater que les neurones ciblés avec une irradiation laser appropriée, en évitant les dommages causés par la chaleur du laser.

Suite à cette procédure, l’ablation des neurones dans d’autres zones du cerveau comme le cerveau antérieur ou le cerveau postérieur peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont ces neurones sont impliqués dans les fonctions cognitives ou les fonctions motrices. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences comportementales pour explorer les circuits neuronaux fonctionnels dans des modèles de poissons zèbres. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’ablater spécifiquement au laser les neurones dans le cerveau des larves de poisson zèbre et d’évaluer les conséquences fonctionnelles et comportementales.

N’oubliez pas que travailler avec un laser peut être extrêmement dangereux et respectez toujours les instructions du fabricant lors de la mise en œuvre de cette procédure.