Name: Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez l'évaluation de la bioactivité anticancéreuse des coumarines par culture 3D et xénogreffes de poisson-zèbre. Cette méthode permet d'étudier l'efficacité des composés OT48 sur les cellules A549 in vivo.

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Recherche au SNU est pris en charge par le National Research Foundation (NRF) par le MEST de Corée pour les subventions de tumeur microenvironnement Global Core Research Center (GCRC), [numéro de licence 2011-0030001] ; par la subvention de recherche de l’Université nationale Séoul et cerveau Corée (BK21) programme.

1. colonie Formation essais
<ol><li>Cellulaire de cellules A549 culture à une concentration de 20 000 cellules/cm2 dans 15 mL de RPMI1640 milieu de culture enrichi avec 10 % SVF (sérum de veau fœtal) et 1 % antibiotiques dans une fiole de2 75 cm dans un incubateur à CO2 à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Le jour de l’expérience, déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre. Recueillir 50 000 cellules par centrifugation à 400 g pendant 7 min dans un tube de microtubes de 1,5 mL et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de 1 x solution PBS stérile (Phosphate Buffered Saline) dans des tubes de 1,5 mL.</li>
	<li>Pipeter 1,1 mL de milieu semi-solide à base de methylcellulose (MCBM) dans des tubes de 15 mL avec un échantillon. Préparer un tube pour chaque condition.</li>
	<li>Ajouter 110 µL de FBS à 1,1 mL de MCBM à l’aide d’une micropipette P200.</li>
	<li>Cellules de graines à 1 000 cellules/mL. Prélever 2,4 µL de suspension cellulaire de la solution mère (50 000 cellules dans 100 µL de PBS 1 x) à l’aide d’une micropipette P2 et ajouter à 1,1 mL de MCBM additionné de 10 % FBS.</li>
	<li>Après avoir ajouté les cellules, vortex les tubes pendant 1 min, en les tenant verticalement à la vitesse maximale à bien mélanger MCBM et cellules.</li>
	<li>Ajouter des composés d’essai (OT48 seul ou en combinaison avec A1210477). Préparer une éprouvette sous forme de contrôle pour le solvant utilisé (ici le diméthylsulfoxyde (DMSO)). Selon la concentration des composés et le volume ajouté pour chaque condition, le solvant contrôle inclura la plus forte concentration de solvant utilisé pour les dilutions de la substance, à tester pour évaluer les effets néfastes causés par le solvant.</li>
	<li>Tubes vortex pendant 1 minute.</li>
	<li>Pour chaque essai, ajouter 1 mL du mélange avec une micropipette P1000 au centre d’une plaque de culture de cellules de 12 puits.</li>
	<li>Remplir les puits vides avec 1 mL d’eau stérile ou 1 x PBS pour stabiliser l’humidité.</li>
	<li>Incuber les boîtes de culture pendant 10 jours dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Après 10 jours d’incubation, ajouter 200 µL d’une solution mère de MTT (bromure de methylthiazolyldiphenyl-tétrazolium) (5 mg/mL) dans chaque puits pour atteindre une concentration finale de 1 mg/mL.</li>
	<li>Incuber 10 min dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2. Colonies viables tournera violet.</li>
	<li>Capturer l’image à l’aide d’un appareil photo numérique à l’aide de la plaque de fond blanc (plateau blanc dia de LAS). Utilisez les paramètres suivants : méthode, numériser ; Type d’exposition, précision ; Temps d’exposition, manuel, 1 seconde ; Résolution/sensibilité, haute résolution. Enregistrer l’image au format tiff.</li>
	<li>Quantifier les colonies viables à l’aide de logiciels ImageJ. Sélectionnez le menu « Image | Type | 8 bit ». Sélectionnez le menu « réglage | Seuil ». La valeur seuil contrôle et maintenir constant pour toutes les conditions ; Sélectionnez le menu « Analyze | Analyser les particules ». Enregistrer les données et les analyser avec un logiciel de statistiques pour la représentation graphique.</li>
</ol>2. test de Formation sphéroïde
<ol><li>Cellules A549 de culture à une concentration de 20 000 cellules/cm2 dans des flacons de2 75 cm avec 15 mL de milieu RPMI 1640 additionné d’antibiotiques de SVF et 1 % 10 %.</li>
	<li>Le jour de l’expérience, préparer un 96 bien U-plaque.</li>
	<li>Plaque de 10 000 cellules dans un puits qui contient déjà le composé d’intérêt (ici 50 µM de OT48) ou 20 µM de A1210477. Ajuster le volume final à 100 µL de milieu de culture cellulaire. Le nombre de cellules qui forment les sphéroïdes uniformes avec une bordure extérieure intact est considérée comme suffisant pour sphéroïdes de forme.</li>
	<li>Incuber pendant 3 jours dans un incubateur à 37 ° C et à 5 % de CO2.</li>
	<li>Après 3 jours d’incubation, capturer des images des sphéroïdes à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 4 x.</li>
</ol>3. dosage de xénogreffe de poisson-zèbre
Remarque : Cette approche technique est visualisée comme un schéma (Figure 1).
<ol><li>
Préparation des réactifs stocks
	<ol>
<li>Préparer 1 L de 30 x solution de Danieau : 1740 mM NaCl, KCl 21 mM, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2et 150 mM HEPES. Ajuster le pH de la mémoire tampon à 7,6 à l’aide d’un pH-mètre.</li>
		<li>Préparer la solution à 1 % (50 x) tricaïne : dissoudre 20 mg de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (tricaïne) dans 2 mL d’eau distillée.</li>
		<li>Préparer la solution de rouge de phénol-PBS 1 % : ajouter 2 µL de solution de sel de sodium rouge de phénol à 198 µL de solution de PBS stérile dans un tube de 1,5 µL.</li>
		<li>Préparer 3 % de méthylcellulose : ajouter 3 g de méthylcellulose à 100 mL de solution de Danieau 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
L’incubation et la production d’oeufs de poisson-zèbre
	<ol>
<li>Séparer une femelle et un mâle poisson zèbre dans un réservoir de partition rempli avec l’eau du robinet filtrée et stérilisée par UV à 28,5 ° C dans l’obscurité. Après 24h de séparation, mélanger le poisson des deux sexes pour initier l’accouplement. Transfert des oeufs fécondés du réservoir d’accouplement à une boîte de Pétri contenant 5 mL de solution de frais Danieau.</li>
		<li>Laver les œufs trois fois avec 5 mL de solution de Danieau. Pour le lavage, soigneusement aspirer les oeufs avec une pipette et transfert à 5 mL de la solution fraîche. Incuber pendant 8 h à 28,5 ° C.<ol>
<li>Après 8 h d’incubation dans une solution de Danieau, changer de solution de Danieau contenant 0,03 % 1-phényl-2-thiourée (PTU) pour inhiber la pigmentation. Trier les oeufs opaques (non fécondés ou contenant des embryons sous-développés) pour empêcher la contamination.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embryon dechorionation
	<ol>
<li>24h après la fécondation (hpf), embryons de poisson zèbre de dechorionate avec une pincette forte. Incuber les embryons d’incubation dans une solution de Danieau avec 0,03 % PTU à 28,5 ° C jusqu'à 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de cellules traitées composé
	<ol>
<li>Cellules A549 de semences à 20 000 cellules/cm2 dans des flacons de culture 25 cm2 . Après 24 h d’ensemencement, ajouter des composés (ici OT48 à 50 µM et et/ou A1210477 à 20 µM) pendant 24 h dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2. Paramétrer la durée de traitement pour chaque composé à maintenir la viabilité des cellules, mais de les commettre vers la mort cellulaire. Cette fois point doit être configuré individuellement issu des marqueurs moléculaires, la morphologie et la viabilité des cellules.</li>
		<li>2 h avant la fin du traitement, cellules de tache avec 4 µM de traqueur de cellule fluorescente teignent CM-Dil à 37 ° C et 5 % de CO2. Après 2 h d’incubation, trypsinize cellules avec 0.05 % trypsine-EDTA et diluer 106 cellules dans 50 µL de solution de rouge de phénol-PBS avant l’injection.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micro injection de cellules cancéreuses pour formation de xénogreffe
	<ol>
<li>Anesthésier les poissons zèbres dans une solution de tricaïne 0,02 % pendant 5 min jusqu'à ce qu’ils s’installent sur une gélose.</li>
		<li>Tirez un 1,0 mm (hors verre diamètre capillaire) par un de micropipettes (paramètres du programme : P: 300, chaleur : 260, tirer : 60, VEL : 50 et l’heure : 200). Couper le microcapillaire avec une seringue pour produire une arête vive. Charger microcapillaries avec 20 µL de cellules/phénol rouge-solution de PBS. Régler la pression d’injection et le temps de distribuer 2 nL par injection.</li>
		<li>Injecter 100 – 200 cellules dans le sac vitellin par injection 6 à 10 nL par l’intermédiaire de 3 à 5 injections. Après l’injection, permettre aux poissons de récupérer pendant 10 à 30 min dans 5 mL de solution de frais Danieau contenant une solution PTU. Expédition de poissons en plaques 24 puits avec 1 mL de solution de Danieau contenant PTU solution sont et incuber pendant 72 h à 28,5 ° C.</li>
		<li>Après 72 h d’incubation, anesthésier les poissons dans une solution de tricaïne 0,02 % et immobiliser sur une lame de verre, avec une baisse de 3 % de méthylcellulose. Prendre 5 x images en microscopie à fluorescence à une longueur d’onde de 620 à 750 nm.</li>
		<li>Quantifier la taille des tumeurs fluorescentes de logiciels ImageJ. Sélectionnez le menu « Analyze | Mesure ». Enregistrer les valeurs correspondant au signal fluorescent et d’analyser avec un logiciel de statistiques pour la représentation graphique.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les tarifs de la formation de colonies obtenues avec MCBM dépend du type de cellule. Généralement, pour les cellules non adhérentes, le nombre de colonies est beaucoup plus élevé par rapport aux cellules adhérentes. Nous avons observé que les cellules A549 forment des colonies de 30 à 40 après 10 jours. Précédemment, nous avons rapporté des cellules leucémiques différents que le nombre de colonies est entre 200 et 2509. Nos résultats ont montré que OT48 seul n’a pas produit une diminution signific...

Le cancer est causé par des mutations cellulaires et par conséquent les voies biochimiques de signalisation sont perturbées déclenchant la division cellulaire incontrôlée et la résistance à la mort cellulaire. Les tumeurs interfèrent avec les fonctions physiologiques de l’appareil digestif, nerveux, circulatoire et par la suite voisine tissus1. Malgré les efforts de recherches approfondies, le cancer reste la maladie mortelle la plus répandue dans le monde2. Médecine de précision a été reconnue comme la Fondation de l’avenir thérapeutique anticancéreuse. Nouvelles entités moléculaires sont systématiquement testées en association avec les médicaments existants pour améliorer les résultats cliniques.
Cependant, une des limitations importantes associées au développement de nouvelles thérapies ciblées efficaces est l’échec des tests couramment utilisés pour simuler les résultats biologiques exacte de drogue exposition3. Découverte de drogue de cancer repose encore principalement sur l’évaluation de l’efficacité des agents thérapeutiques dans des lignées de cellules cancéreuses cultivées dans des cultures monocouches 2D, qui sont difficiles à valider dans les essais cliniques4. Par conséquent, il y a un intérêt croissant pour développer des modèles de cancer mieux que mieux imitent les fonctionnalités natives de tumeurs in vivo5. Ces dernières années, un intérêt croissant pour les modèles 3D de la culture a mené à l’élaboration de méthodologies améliorées pour produire la tumeur 3D modèles5.
Ici, nous présentons une méthode avec trois techniques de culture cellulaire 3D différents permettant d’améliorer la compréhension de la puissance de l’hydroxycoumarine OT486 en combinaison avec BH3 mimétiques avant plus en profondeur des essais in vivo sur. Notre méthode se compose de la combinaison de la colonie et SFAs avec un in vivo tumeur formation test basé sur un modèle de poisson zèbre pour valider l’efficacité de la combinaison de OT48 et BH3 mimétiques dans les cellules cancéreuses du poumon et surveiller la progression du cancer dans sa vie organisme.
Tests de formation de colonie sont couramment utilisés pour évaluer l’efficacité des agents anticancéreux cancers solides tant que hématopoïétiques. Le test détermine la capacité d’une cellule à proliférer indéfiniment et forment des colonies7. L’effet d’un agent anticancéreux sur la colonie formant la capacité des cellules est déterminée par la diminution du nombre ou de la taille des colonies.
Sphéroïdes représentent des modèles in vitro de tumeur et servent de plateforme de dépistage peu coûteux pour les agents anticancéreux. Sphéroïdes sont des agrégats de cellules cultivées en suspension ou noyées dans une matrice 3D. Cette approche est largement utilisée pour le dépistage des drogues et des études de tumeur immunitaire, la prolifération et la croissance interaction8.
Pour bien comprendre les propriétés d’un nouveau médicament, il est essentiel de mener des expériences in vivo sur des rongeurs. Toutefois, cette méthode traditionnelle est coûteux et prend du temps. Ces dernières années, poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme de laboratoire étudiés qui est moins cher et plus rapide d’élever. Tumeurs développées dans l’approche de la culture cellulaire zebrafish représentent un 3D mais dans le cadre de in vivo d’un vertébré9.
Au total, on utilise ici trois approches différentes culture 3D y compris SCFA, SFAs et poisson-zèbre in vivo la formation de tumeurs pour démontrer la capacité anticancéreuse de hydroxycoumarine OT48 dans un modèle de cellules A549 le cancer pulmonaire en combinaison avec BH3 mimétiques.

<table><tbody><tr><td><fort>Matériaux nécessaires aux essais de formation de colonies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg ;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg ;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg ;</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg ;</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tube de 1,5 ml</td><td></td><td>Extragene Tube-170-C</td><td>Tube de</td></tr><tr><td>15 ml</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 plaque de puits</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230-20</td> <td>C&deg ;</td></tr><tr><td>Bromure de tétrazolium bleu de thiazolyle (poudre MTT)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&deg ;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Matériaux requis pour le dosage de la formation de sphéroïdes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg ;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg ;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg ;</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg ;</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg ;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopie</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><tr><td>Matériaux requis pour les xénogreffes de poisson-zèbre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg ;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg ;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg ;</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg ;</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tube de 1,5 ml</td><td></td><td>Extragene Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 plaque de puits</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Pétridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solution</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg ;</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Nitrate de calcium tétrahydraté (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfonate (Tricaïne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Solution de rouge de phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-phényl-2-thiourée (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil colorant</td><td>Invitrogen</td><td>C7001-20</td> <td>C&deg ;</td></tr><tr><td>Capillaire en verre</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Instrument à obturateur, États-Unis</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro-injecteur</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro chargeur</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Lame en verre</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopie à fluorescence</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

Évaluation préclinique de la bioactivité de la ot48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Projection pré-cliniques in vitro et in vivo de nouveaux agents thérapeutiques sont un outil essentiel dans la découverte de médicaments du cancer. Bien que les lignées cellulaires cancéreuses humaines répondent à des composés thérapeutiques en culture cellulaire monocouche (dimensionnelle) 2D, systèmes de culture 3D ont été développés pour comprendre l’efficacité des médicaments dans des modèles plus physiologiquement pertinents. Ces dernières années, un changement de paradigme a été observé dans la recherche préclinique pour valider l’efficacité de nouvelles molécules dans les systèmes de culture 3D, plus précisément imitant le microenvironnement tumoral. Ces systèmes de caractérisent l’état de la maladie d’une manière plus physiologiquement pertinente et aident à gagner mieux mécaniste perspicacité et la compréhension de l’activité pharmacologique d’une molécule donnée. En outre, avec la tendance actuelle dans l’amélioration des modèles de cancer en vivo , poisson zèbre est devenue un important modèle de vertébrés pour évaluer in vivo la formation de tumeurs et d’étudier l’effet des agents thérapeutiques. Ici, nous avons étudié l’efficacité thérapeutique de hydroxycoumarine OT48 seul ou en combinaison avec BH3 mimétiques dans la lignée de cellules cancéreuses du poumon A549 à l’aide de trois systèmes de culture 3D différente, y compris les essais de formation de colonie (CFA), essai de formation sphéroïde (SFA) et en vivo zebrafish xénogreffes.

Dans la Figure 2, le cancer du poumon cellules ligne A549 a été ensemencé dans MCBM à former des colonies après le traitement avec OT48 seul ou en combinaison avec BH3 A1210477 mimétique aux concentrations indiquées. Les résultats ont montré que la combinaison significativement réduit nombre, la taille et la surface totale des colonies, après 10 jours d’incubation.
Dans la Figur...

Nous présentons ici la projection préclinique des coumarines anticancéreux à l’aide de poisson-zèbre et la culture 3D.

Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments afin d’identifier l’effet anticancéreux et d’obtenir une meilleure compréhension mécaniste de nouvelles molécules à l’aide de systèmes de culture 3D in vitro et in vivo. Le principal avantage de cette technique est la variété de l’effet pharmacologique des composés dans un modèle in vivo plus pertinent sur le plan physiologique. Pour commencer, plaquez 20 000 cellules A549 par centimètre carré dans 15 millilitres de milieu de culture cellulaire RPMI 1640, complété par 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques, dans une fiole de 75 centimètres carrés.Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le jour de l’expérience, utilisez un hémocytomètre pour déterminer la concentration cellulaire. Collectez 50 000 cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre par centrifugation à 400 g pendant sept minutes et remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS stérile.À l’aide d’un multipipette, versez 1,1 millilitre de milieu semi-solide à base de méthylcellulose (MCBM) dans des tubes, en préparant un tube pour chaque condition. Ensuite, ajoutez 110 microlitres de FBS dans chaque tube. Ensuite, économisez 1000 cellules par millilitre.Ensuite, pipetez 2,4 microlitres de la solution de cellule mère dans les tubes de MCBM et FBS. Après avoir ajouté les cellules, tenez les tubes verticalement et tourbillonnez-les à la vitesse la plus élevée pendant une minute pour bien mélanger le MCBM et les cellules. Ajoutez maintenant le composé de test OT48 seul ou en combinaison avec A1210477 aux échantillons.Préparez un tube séparé comme contrôle pour le solvant utilisé, tel que le DMSO. Ensuite, faites tourbillonner les échantillons pendant une minute. Pour chaque dosage, pipetez un millilitre du mélange dans le puits central d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits.Ensuite, utilisez un millilitre d’eau stérile ou de PBS pour remplir les puits vides. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 10 jours. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’une solution mère de MTT de cinq milligrammes par millilitre dans chaque puits.Après avoir incubé les plaques pendant dix minutes, vérifiez s’il y a des colonies viables qui deviendront violettes. À l’aide d’une plaque d’arrière-plan blanche, capturez des images à l’aide des paramètres suivants :Pour la méthode, choisissez numériser. Pour le type d’exposition, choisissez précision.Pour le temps d’exposition, choisissez manuel et une seconde. Pour la sensibilité et la résolution, choisissez haute résolution. Ensuite, enregistrez les images capturées au format TIFF.Avec le logiciel ImageJ, quantifiez les colonies viables en sélectionnant le menu image, type, 8 bits. Sélectionnez le menu adjust et threshold. Définissez le seuil à contrôler et maintenez-le constant pour toutes les conditions.Ensuite, sélectionnez le menu analyser, analyser les particules. Enregistrez les données et analysez-les à l’aide d’un logiciel de statistiques pour la représentation graphique. Après avoir préparé les réactifs de base selon le protocole de texte, séparez un poisson zèbre femelle et un poisson zèbre mâle dans un réservoir de séparation rempli d’eau du robinet stérilisée aux UV et filtrée à 28,5 degrés Celsius et placez-les dans l’obscurité.Après 24 heures de séparation, retirez la cloison pour lancer l’accouplement. Transférez les œufs fécondés de la cuve d’accouplement dans une boîte de Pétri contenant cinq millilitres de solution fraîche de Danios. Utilisez cinq millilitres de solution Danios pour laver les œufs trois fois en utilisant une pipette pour aspirer soigneusement les œufs et les transférer dans cinq millilitres de solution fraîche.Ensuite, incubez les œufs à 28,5 degrés Celsius pendant huit heures. Passez à une solution de Danios contenant 0,03 % de PTU pour inhiber la pigmentation et trier les œufs opaques non fécondés pour éviter la contamination. 24 heures après la fécondation, utilisez des pinces tranchantes pour déchorionner les embryons.Ensuite, incubez les embryons dans une solution Danios avec du PTU jusqu’à 48 heures après la fécondation. Après avoir ensemencé les cellules A549 et les avoir incubées avec des composés conformément au protocole de texte, 24 heures avant la fin du traitement, ajoutez quatre micromolaires du colorant fluorescent de suivi cellulaire, CM-Dil, pour colorer les cellules et les incuber pendant deux heures. Après l’incubation, utilisez 0,05 % de trypsine-EDTA pour trypsiniser les cellules.Ensuite, diluez dix à six cellules dans 50 microlitres de solution de PBS rouge de phénol avant l’injection. Pour effectuer une micro-injection de cellules cancéreuses, tirez un capillaire en verre de 1,0 millimètre à l’aide des paramètres de programme suivants :Utilisez une seringue pour couper le capillaire afin de produire un bord tranchant. Ensuite, chargez le microcapillaire avec 20 microlitres de la solution de rouge de phénol cellulaire.Après avoir anesthésié le poisson-zèbre selon le protocole textuel, injectez 100 à 200 cellules dans le sac vitellin en injectant six à dix nanolitres via trois à cinq injections. Les micro-injections doivent être effectuées avec beaucoup de soin et de précision pour s’assurer que le volume correct des cellules est injecté et que les lésions dues à l’injection sont minimes et que la pression du dioxyde de carbone doit être optimale pour éviter une fissure latérale. Après l’injection, laissez le poisson récupérer pendant dix à 30 minutes dans cinq millilitres de solution fraîche de Danios contenant du PTU.Transférez le poisson dans des plaques à 24 puits avec un millilitre de solution de PTU Danios et incubez-les à 28,5 degrés Celsius pendant 72 heures. Suite à l’incubation, après avoir anesthésié les poissons selon le protocole de texte, immobilisez-les sur une lame de verre avec une goutte de méthylcellulose à 3 %. Prenez 5 images fluorescentes à une longueur d’onde de 620 à 750 nanomètres.Utilisez le logiciel ImageJ pour quantifier la taille des tumeurs de fluorescence en sélectionnant, analyser et mesurer. Ensuite, enregistrez les valeurs de fluorescence et analysez-les avec un logiciel de statistiques pour la représentation graphique. Dans cette expérience, la lignée cellulaire de cancer du poumon A549 a été ensemencée dans du MCBM pour former des colonies après traitement avec OT48 seul ou en association avec un mimétique BH3, A1210477, à la concentration observée ici.Les résultats ont montré que la combinaison réduisait significativement le nombre, la taille et la surface totale des colonies après dix jours d’incubation. Ici, après un traitement avec OT48 seul ou en combinaison avec un mimétique de BH3, A1210477, les cellules ont été autorisées à former des sphéroïdes en utilisant la technique de la plaque inférieure en U. Après une incubation de trois jours, les sphéroïdes ont été imagés et quantifiés, et des images 3D ont été générées.Cette figure illustre le potentiel inhibiteur d’OT48 et/ou de A1210477 sur la formation tumorale à partir de la quantification des tumeurs fluorescentes générées lorsque des cellules traitées ont été injectées dans le sac vitellin de poisson zèbre. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir le nombre de poissons pour chaque condition autour de dix ou plus afin d’éviter les variations importantes affectant l’évaluation statistique des données. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse histologique peuvent être effectuées afin d’évaluer l’expression de la protéine cible dans la xénogreffe de poisson zèbre.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments pour explorer l’efficacité de composés dans un micro-environnement in vivo dans la xénogreffe de poisson-zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de valider l’efficacité d’un médicament dans un environnement de culture 3D.

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Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre

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