Évaluation préclinique de la bioactivité de la OT48 de coumarine anticancéreux par sphéroïdes, colonie Formation essais et xénogreffes de poisson-zèbre

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments afin d’identifier l’effet anticancéreux et d’obtenir une meilleure compréhension mécaniste de nouvelles molécules à l’aide de systèmes de culture 3D in vitro et in vivo. Le principal avantage de cette technique est la variété de l’effet pharmacologique des composés dans un modèle in vivo plus pertinent sur le plan physiologique. Pour commencer, plaquez 20 000 cellules A549 par centimètre carré dans 15 millilitres de milieu de culture cellulaire RPMI 1640, complété par 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques, dans une fiole de 75 centimètres carrés.

Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Le jour de l’expérience, utilisez un hémocytomètre pour déterminer la concentration cellulaire. Collectez 50 000 cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre par centrifugation à 400 g pendant sept minutes et remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBS stérile.

À l’aide d’un multipipette, versez 1,1 millilitre de milieu semi-solide à base de méthylcellulose (MCBM) dans des tubes, en préparant un tube pour chaque condition. Ensuite, ajoutez 110 microlitres de FBS dans chaque tube. Ensuite, économisez 1000 cellules par millilitre.

Ensuite, pipetez 2,4 microlitres de la solution de cellule mère dans les tubes de MCBM et FBS. Après avoir ajouté les cellules, tenez les tubes verticalement et tourbillonnez-les à la vitesse la plus élevée pendant une minute pour bien mélanger le MCBM et les cellules. Ajoutez maintenant le composé de test OT48 seul ou en combinaison avec A1210477 aux échantillons.

Préparez un tube séparé comme contrôle pour le solvant utilisé, tel que le DMSO. Ensuite, faites tourbillonner les échantillons pendant une minute. Pour chaque dosage, pipetez un millilitre du mélange dans le puits central d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits.

Ensuite, utilisez un millilitre d’eau stérile ou de PBS pour remplir les puits vides. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 10 jours. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’une solution mère de MTT de cinq milligrammes par millilitre dans chaque puits.

Après avoir incubé les plaques pendant dix minutes, vérifiez s’il y a des colonies viables qui deviendront violettes. À l’aide d’une plaque d’arrière-plan blanche, capturez des images à l’aide des paramètres suivants :Pour la méthode, choisissez numériser. Pour le type d’exposition, choisissez précision.

Pour le temps d’exposition, choisissez manuel et une seconde. Pour la sensibilité et la résolution, choisissez haute résolution. Ensuite, enregistrez les images capturées au format TIFF.

Avec le logiciel ImageJ, quantifiez les colonies viables en sélectionnant le menu image, type, 8 bits. Sélectionnez le menu adjust et threshold. Définissez le seuil à contrôler et maintenez-le constant pour toutes les conditions.

Ensuite, sélectionnez le menu analyser, analyser les particules. Enregistrez les données et analysez-les à l’aide d’un logiciel de statistiques pour la représentation graphique. Après avoir préparé les réactifs de base selon le protocole de texte, séparez un poisson zèbre femelle et un poisson zèbre mâle dans un réservoir de séparation rempli d’eau du robinet stérilisée aux UV et filtrée à 28,5 degrés Celsius et placez-les dans l’obscurité.

Après 24 heures de séparation, retirez la cloison pour lancer l’accouplement. Transférez les œufs fécondés de la cuve d’accouplement dans une boîte de Pétri contenant cinq millilitres de solution fraîche de Danios. Utilisez cinq millilitres de solution Danios pour laver les œufs trois fois en utilisant une pipette pour aspirer soigneusement les œufs et les transférer dans cinq millilitres de solution fraîche.

Ensuite, incubez les œufs à 28,5 degrés Celsius pendant huit heures. Passez à une solution de Danios contenant 0,03 % de PTU pour inhiber la pigmentation et trier les œufs opaques non fécondés pour éviter la contamination. 24 heures après la fécondation, utilisez des pinces tranchantes pour déchorionner les embryons.

Ensuite, incubez les embryons dans une solution Danios avec du PTU jusqu’à 48 heures après la fécondation. Après avoir ensemencé les cellules A549 et les avoir incubées avec des composés conformément au protocole de texte, 24 heures avant la fin du traitement, ajoutez quatre micromolaires du colorant fluorescent de suivi cellulaire, CM-Dil, pour colorer les cellules et les incuber pendant deux heures. Après l’incubation, utilisez 0,05 % de trypsine-EDTA pour trypsiniser les cellules.

Ensuite, diluez dix à six cellules dans 50 microlitres de solution de PBS rouge de phénol avant l’injection. Pour effectuer une micro-injection de cellules cancéreuses, tirez un capillaire en verre de 1,0 millimètre à l’aide des paramètres de programme suivants :Utilisez une seringue pour couper le capillaire afin de produire un bord tranchant. Ensuite, chargez le microcapillaire avec 20 microlitres de la solution de rouge de phénol cellulaire.

Après avoir anesthésié le poisson-zèbre selon le protocole textuel, injectez 100 à 200 cellules dans le sac vitellin en injectant six à dix nanolitres via trois à cinq injections. Les micro-injections doivent être effectuées avec beaucoup de soin et de précision pour s’assurer que le volume correct des cellules est injecté et que les lésions dues à l’injection sont minimes et que la pression du dioxyde de carbone doit être optimale pour éviter une fissure latérale. Après l’injection, laissez le poisson récupérer pendant dix à 30 minutes dans cinq millilitres de solution fraîche de Danios contenant du PTU.

Transférez le poisson dans des plaques à 24 puits avec un millilitre de solution de PTU Danios et incubez-les à 28,5 degrés Celsius pendant 72 heures. Suite à l’incubation, après avoir anesthésié les poissons selon le protocole de texte, immobilisez-les sur une lame de verre avec une goutte de méthylcellulose à 3 %. Prenez 5 images fluorescentes à une longueur d’onde de 620 à 750 nanomètres.

Utilisez le logiciel ImageJ pour quantifier la taille des tumeurs de fluorescence en sélectionnant, analyser et mesurer. Ensuite, enregistrez les valeurs de fluorescence et analysez-les avec un logiciel de statistiques pour la représentation graphique. Dans cette expérience, la lignée cellulaire de cancer du poumon A549 a été ensemencée dans du MCBM pour former des colonies après traitement avec OT48 seul ou en association avec un mimétique BH3, A1210477, à la concentration observée ici.

Les résultats ont montré que la combinaison réduisait significativement le nombre, la taille et la surface totale des colonies après dix jours d’incubation. Ici, après un traitement avec OT48 seul ou en combinaison avec un mimétique de BH3, A1210477, les cellules ont été autorisées à former des sphéroïdes en utilisant la technique de la plaque inférieure en U. Après une incubation de trois jours, les sphéroïdes ont été imagés et quantifiés, et des images 3D ont été générées.

Cette figure illustre le potentiel inhibiteur d’OT48 et/ou de A1210477 sur la formation tumorale à partir de la quantification des tumeurs fluorescentes générées lorsque des cellules traitées ont été injectées dans le sac vitellin de poisson zèbre. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir le nombre de poissons pour chaque condition autour de dix ou plus afin d’éviter les variations importantes affectant l’évaluation statistique des données. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse histologique peuvent être effectuées afin d’évaluer l’expression de la protéine cible dans la xénogreffe de poisson zèbre.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la découverte de médicaments pour explorer l’efficacité de composés dans un micro-environnement in vivo dans la xénogreffe de poisson-zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de valider l’efficacité d’un médicament dans un environnement de culture 3D.