Name: Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Apprenez à générer des sphéroïdes épithéliaux nasaux humains pour étudier la fonction CFTR dans la mucoviscidose. Cette méthode permet d'évaluer rapidement les réponses individuelles aux médicaments modulateurs CFTR ex vivo.

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Ce travail a été soutenu par la Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, octroyer le numéro CLANCY14XX0 et par le biais de la Fondation de la fibrose kystique, octroyer le numéro CLANCY15R0. Les auteurs tiennent à remercier Kristina Ray pour son aide dans le recrutement de patients et de la surveillance réglementaire. Les auteurs tiennent également à remercier le groupe de travail HNE, soutenu par la Fondation de la fibrose kystique, qui ont aidé à la génération des capacités de culture HNE : Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomon Marty et Katherine Tuggle.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit la génération dérivé de patient nasal sphéroïde de cultures de cellules capables de produire un modèle de fonction CFTR individualisé, spécifique. Il y a plusieurs étapes clés dans le processus qui doit être étroitement assisté pour éviter les difficultés. Tout d’abord est une acquisition bon échantillon du nez du patient. Doit avoir un bon échantillon > 50 000 cellules, limitée glaire/débris et être prêt pour le traitement de moins de 4 h (même si le succès est aussi facilement réalisable avec nuit e...

Fibrose kystique (FK) est une maladie récessive autosomique fatale affectant plus de 70.000 personnes dans le monde1. Cette maladie génétique de la vie-raccourcissement est dû à des mutations la Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) de protéines2. CFTR est membre de la famille de triphosphate d’adénosine-binding cassette et fonctions comme un canal ionique permettant le mouvement du chlorure et du bicarbonate à travers les membranes apicales de l’épithélium polarisé multiples, y compris le tube digestif, glandes sudoripares, respiratoire et des arbres, entre autres3,4. À ce titre, dysfonctionnelle CFTR entraîne multisystémique dysfonction épithéliale, avec la mortalité découlant de la maladie respiratoire1. Dans le poumon CF, perte du CFTR-conduit des voies respiratoires surface liquide (ASL) Règlement et du mucus libération conduit à mucus épaissi, obstruction des voies respiratoires, infection chronique et remodelage des voies aériennes progressive et poumon fonction1,5.
Malgré l’identification des dysfonctionnement CFTR comme étant la cause de la maladie, thérapies dans FC traditionnellement concentré sur l’atténuation des symptômes (par exemple, thérapie de remplacement d’enzymes pancréatiques, thérapies de dégagement des voies respiratoires)1. Cette approche a été récemment révolutionnée par l’apparition de nouveaux médicaments, appelés « Modulateurs CFTR, » qui ciblent directement dysfonctionnelle CFTR. Cette approche a changé le paysage clinique de gestion des symptômes de modificateurs de la maladie en charge, mais comporte plusieurs limites6,7,8,9,10. Activité de modulateur est spécifique à la défectuosité de la protéine qui accompagne chaque mutation CFTR et limité à sélectionner en génétique des populations,11. Cette limitation est entraînée par l’hétérogénéité des défauts de la protéine, mais aussi par l’impraticabilité des essais cliniques dans les groupes de mutation rare. En outre, chez les sujets présentant des génotypes bien étudiés (par exemple, F508del/F508del CFTR, la mutation CFTR la plus courante), il est grande variabilité en maladie fardeau et modulateur réponse6,7,8 ,9,11.
Pour résoudre ces deux problèmes, les chercheurs ont proposé l’utilisation de modèles personnalisés pour les essais précliniques12. Ce concept utilise des tissus spécifiques au patient pour générer un système de modèle individualisé ex vivo pour les essais en enclos, prédiction en vivo sujet réaction aux traitements de façon personnalisée. Une fois validé, un tel modèle pourrait servir par les cliniciens à la thérapie de précision lecteur quel que soit le génotype CFTR sous-jacent du patient.
Humaine (HBE) les cellules épithéliales bronchiques provenant du tissu de l’explant au moment de la transplantation pulmonaire a créé la possibilité d’un tel modèle pour CF13,14. HBEs cultivées à l’interface air-liquide (ALI) permettant de quantification fonctionnelle de CFTR directement par des tests électrophysiologiques, ou indirectement par le biais de mesures d’ASL homéostasie13,15. Ce modèle a été essentiels à la compréhension de la biologie CFTR et a été un facteur clé dans le développement de CFTR modulateurs16. Malheureusement, les modèles d’HBE ne sont pas tenable comme un modèle personnalisé en raison de la nature invasive de l’acquisition (transplantation pulmonaire ou brossage bronchique) et des échantillons pour ceux qui ont des mutations rares ou maladie bénigne. À l’inverse, tissu intestinal, obtenu à partir des spécimens de biopsie rectale ou duodénal, peut être utilisé pour la mesure de courant intestinale (ICM) ou une analyse axée sur l’enflure organoïde pour étude individualisée CFTR fonction17,18, 19. organoïde essais, en particulier, sont des modèles très sensibles du CFTR activité20,21,22. Les deux modèles sont limités par la source de tissu (tissu intestinal, tandis que la plupart pathologie de la maladie est respiratoire) et la méthode semi-invasive de l’acquisition. Par ailleurs, plusieurs chercheurs ont étudié nasale (HNE) les cellules épithéliales humaines au modèle CFTR restauration23,24,25. HNEs peuvent être récoltées en toute sécurité au pinceau ou curetage chez les sujets de tout âge et, lorsqu’il est cultivé dans la région ALI, récapituler beaucoup de caractéristiques de HBEs25,26,27,28. Des cultures monocouches HNE ont traditionnellement été limités par transformation squameuse et beaucoup de temps à maturité29. En outre, indiqué de court-circuit mesurer le courant dans HNEs est plus petits que ceux de HBEs, suggérant une petite fenêtre pour détecter l’efficacité thérapeutique25.
Compte tenu de la nécessité d’un modèle de culture de tissus personnalisés, non invasif, respiratoire de fonction CFTR, nous avons cherché à fusionner la sensibilité d’un gonflement, organoïde test avec le caractère non invasif et respiratoire de HNEs. Nous décrivons ici, notre méthode de production de cultures 3 dimensions « sphéroïde » de HNEs pour étude individualisée de CFTR dans un essai gonflement30. Sphéroïdes HNE polarisent de manière fiable avec l’apex épithélial vers le centre de la sphère, ou lumen. Ce modèle reprend de nombreuses caractéristiques d’un épithélium respiratoire inférieur et arrive à maturité plus rapidement que les cultures d’ALI. Comme un test fonctionnel, sphéroïdes HNE quantifient fiablement une fonction plage de CFTR, mais aussi modulation dans les groupes de mutation bien étudiés (par exemple, F508del CFTR). Cette analyse axée sur l’enflure capitalise sur les propriétés de transport des ions/sel de CFTR, mesurer indirectement afflux fluide dans l’ellipsoïde comme l’eau suit l’efflux sel apicale. De cette façon, des sphéroïdes stimulées avec CFTR entièrement fonctionnel gonflent robuste, tandis que ceux avec dysfonctionnelle CFTR moins gonflent ou rétrécissement. C’est quantifiée par analyse d’image des prébiotiques et sphéroïdes de stimulation après 1 h, zone luminale de mesure et de déterminer le pourcentage de changement. Cette mesure peut alors être comparée à travers des groupes expérimentaux à l’écran pour la bioactivité de la drogue de façon spécifique au patient.

<table><tbody><tr><td>Tube Eppendorf de 1,5 ml</td><td>USA Scientific&nbsp ;</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Fiole filtrante de 150 mL</td><td>Midsci&nbsp ;</td><td>TP99150</td><td>Pour filtrer le média</td></tr><tr><td>15 mL Tube conique</td><td>Midsci&nbsp ;</td><td></td><td></td>TP91015</tr><tr><td>Flacon filtrant de 1 l</td><td>à mi-parcours</td><td>TP99950</td><td>Média filtrant Antenne</td></tr><tr><td>parabolique à fond de verre de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-Méthylxanthine (IBMX)</td> en <td>optionFisher Scientific&nbsp ;</td><td>AC228420010</td><td>Préparez une solution mère de 100 mM de 22,0 mg dans 1 mL de DMSO</td></tr><tr><td>50 mL Tube conique</td><td>Midsci&nbsp ;</td><td>&nbsp ; </td><td></td>TP91050</tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AT-104</td><td>Solution de détachement cellulaire</td></tr><tr><td>Adénine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786-25G</td><td>Voir le tableau 1</td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>Voir le tableau 1</td></tr><tr><td>Extrait de cerveau bovin (9mg/mL)</td><td>Lonza&nbsp ;</td><td>CC-4098</td><td>Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Hydrate de ceftazidime</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3809-1G</td><td>Voir le tableau 1</td></tr><tr><td>Racleurs cellulaires 20 cm&nbsp ;</td><td>Midsci&nbsp ;</td><td></td><td></td>TP99010</tr><tr><td>CFTR Inh172</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3430</td><td>Préparez une solution mère de 10 mM de 4,0 mg dans 1 mL de DMSO</td></tr><tr><td>Toxine cholérique B (de Vibrio cholerae)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Voir le tableau 1</td></tr><tr><td>CYB-1</td><td>Medical Packaging Corporation</td><td>CYB-1</td><td>Brosse de cytologie</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Média Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes&nbsp ;</td><td>Technologies de la vie&nbsp ;</td><td>11330-057</td><td>Base Moyenne ; Voir tableaux 1 et 2</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (protéine humaine recombinante, sans origine animale)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG6045</td><td>Voir tableau 1</td></tr><tr><td>Épinéphrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4250-1G</td><td>Voir Tableau 2</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Éthanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135-500ML</td><td>16,6 mM solution ; Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>TCI America&nbsp ;</td><td>E0084</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS haute performance)</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>10082147</td><td>Voir le tableau 1</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886-50</td><td>Préparez une solution mère de 10 mM de 4,1 mg dans 1 mL de DMSO</td></tr><tr><td>Growth-Factor Shrink</td><td>Matrigel Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>Matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (DFG) de Corning, sans rouge de phénol, sans LDV, 10 mL.</td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Solution de collagène humain, type I (VitroCol ; 3 mg/mL)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5007-A</td><td>Solution de collagène</td></tr><tr><td>HyClone (alias FetalClone II)&nbsp ;</td><td>GE Healthcare&nbsp ;</td><td>SH30066.03HI</td><td>Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>StemCell Technologies</td><td>07904</td><td>Voir les tableaux 1 et 2</td></tr><tr><td>Insuline recombinante humaine, solution de zinc</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td></td><td>12585014 solution à 4 mg/mL ; voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Boîte de FIV à 4 puits,</td><td>NUNC non traité (via Fisher Scientific)</td> <td>12566350</td><td>plaque à 4 puits pour les sphéroïdes ; taille de puits similaire à une plaque à 24 puits</td></tr><tr><td>MEF-CF1-IRR</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6001G</td><td>Fibroblastes embryonnaires murins irradiés</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7</td><td>Dispositifs</td><td></td> <td>moléculairesLogiciel d’analyse ; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software pour un devis</td></tr><tr><td>Olympus IX51 Microscope inversé</td><td>Olympus Corporation</td><td>Discontinued</td><td>Imaging Microscope. Remplacement : Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&nbsp ; pour un devis</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>15140122</td><td>Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Phsophoryléthéanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503-5G</td><td>Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Rhinoprobe</td><td>Arlington Scientific, Inc.</td><td>96-0905</td><td>Curette nasale</td></tr><tr><td>Slidebook 5.5</td><td>3i, Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>Logiciel d’imagerie abandonné. Remplacement : Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook pour un devis</td></tr><tr><td>Saline stérile tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Eau stérile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture tissulaire 100</td><td>Techno Plastic Products</td><td>93100</td><td>Plat de culture tissulaire pour expansion</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Voir le tableau 1</td></tr><tr><td>Transferrine (Transferrine humaine 0,5 mL)</td><td>Lonza&nbsp ;</td><td>CC-4205</td><td>Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Triiodothryonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397-1G</td><td>3,3&prime ;,5-Triiodo-L-thyronine sel sodique&nbsp ; [T3] ; Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Trypsine du pancréas porcin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser-G</td><td>Crescent Chemical (via Fisher Scientific)</td> <td>NC0393024</td><td>20 mL de poudre lypophilisée ; Voir le tableau 2</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de vancomycine de Streptomyces orientalis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2002-5G</td><td>Voir le tableau 1</td></tr><tr><td>VX770</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td>Préparer une solution mère de 1 mM de 0,4 mg dans 1 mL de DMSO</td></tr><tr><td>VX809</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1565</td><td>Acheter ou préparer une solution mère de 10 mM de 4,5 mg dans 1 mL de chlorhydrate de DMSO</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp ; Inhibiteur de ROCK&nbsp ;</td><td>Enzo LifeSciences&nbsp ;</td><td>ALX-270-333-M025&nbsp ;</td><td>Voir le tableau 1</td></tr></tbody></table>

génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé transmembrane conductance regulator étude

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Alors que l’introduction de médicaments modulateur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) a révolutionné les soins dans la fibrose kystique (FK), le modèle de thérapie axée sur le génotype en cours d’utilisation présente plusieurs limites. Groupes de mutation premier, rares ou peu étudiée sont exclus des essais cliniques définitives. En outre, comme drogues de modulateur supplémentaires entrer sur le marché, il deviendra difficile d’optimiser les choix de modulateur pour un sujet individuel. Ces deux problèmes sont abordés avec l’utilisation de systèmes individualisés, dérivé de patient modèle préclinique de fonction CFTR et modulation. Cellules épithéliales nasales humaines (HNEs) constituent une source facilement accessible du tissu respiratoire pour un tel modèle. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle tridimensionnel sphéroïde de fonction CFTR et modulation en utilisant HNEs primaires. HNEs sont isolés des sujets de façon mini-invasive, élargi dans les conditions de reprogrammation conditionnelles et ensemencé dans la culture de l’ellipsoïde. Dans les 2 semaines des semis, cultures de sphéroïde génèrent des sphéroïdes HNE qui peuvent être stimulés avec 3', 5'-l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc)-générer des agonistes pour activer la fonction CFTR. Gonflement de sphéroïde est ensuite quantifié comme indicateur d’activité CFTR. Sphéroïdes HNE capitaliser sur l’origine peu invasive, mais respiratoire de cellules nasales pour générer un modèle accessible, personnalisé, pertinent à un épithélium reflétant la mortalité et la morbidité de la maladie. Par rapport aux cultures HNE interface air-liquide, sphéroïdes sont relativement rapides à maturité, ce qui réduit le taux global de contamination. Dans sa forme actuelle, le modèle est limité par un débit faible, mais cela est compensé par la facilité d’acquisition de tissu. Sphéroïdes HNE permet de quantifier et de caractériser l’activité CFTR au niveau individuel de façon fiable. Une étude en cours de lier cette quantification à in vivo la réaction aux médicaments déterminera si les sphéroïdes HNE sont un vrai prédicteur préclinique de la réponse du patient à la modulation de CFTR.

HNEs devrait fixer à la boîte de Petri et forment des îlots de cellules dans les 72 h d’ensemencement ; exemples de formation de l’île de bonne et mauvaise à une semaine sont présentés dans la Figure 1bis et 1 b, respectivement. Ces îles doivent se développer pour couvrir le plat au cours de 15 à 30 jours. Petits ou sous-optimal des échantillons peuvent prendre plus de temps et souvent ne donneront pas utiles sphéroïdes. Contamination par des...

Nous décrivons ici une méthode pour générer des cultures sphéroïde en trois dimensions des cellules épithéliales nasales humaines. Sphéroïdes sont alors stimulés au lecteur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-ion charge et sécrétion de liquide, quantifier le changement de la taille de luminal sphéroïde comme approximation de fonction CFTR.

Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

L’ensemble de cette procédure consiste à générer des sphéroïdes de cellules nasales humaines qui peuvent finalement être utilisés comme test pour les études fonctionnelles de CFTR. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la fibrose kystique, telles que l’évaluation de la réponse d’un sujet individuel à des médicaments modifiant CFTR dans un système modèle ex vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’un grand nombre de sphéroïdes sont générés dans un délai relativement rapide à partir d’un petit échantillon de cellules nasales, ce qui permet des tests approfondis.Lauren Strecker et Jessica Moncivaiz, techniciennes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Après avoir traité et développé des cellules épithéliales nasales humaines ou HNE sur des fibroblastes nourriciers conformément au protocole de texte, apportez le milieu d’expansion préalablement préparé, le milieu de différenciation, la solution de trypsine EDTA à 0,1 % et le PBS stérile à température ambiante pendant 30 minutes. Utilisez ensuite de l’éthanol à 70 % pour nettoyer les récipients et transférez-les dans une enceinte de biosécurité propre.Dans l’enceinte de biosécurité, utilisez une pipette Pasteur fixée à une conduite de vide pour aspirer et jeter le milieu de la culture de HNE. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique propre, utilisez cinq millilitres de PBS pour laver la parabole en ajoutant, en remuant et en aspirant le tampon. Ajoutez cinq millilitres de solution de trypsine EDTA à 0,1 % dans la culture et remettez-la dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes.Puis sous un microscope inversé à quatre à 10X, vérifiez que les cellules se détachent de la parabole, deviennent rondes et flottent. Tapotez doucement le côté de la boîte de culture pour déloger les cellules et, si nécessaire, réincubez la boîte pendant cinq minutes supplémentaires jusqu’à ce que la plupart des cellules soient détachées. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, ajoutez cinq millilitres de milieu d’expansion dans la boîte et recueillez tout le liquide dans un tube conique stérile de 50 millilitres étiqueté.Si les cellules restent adhérentes à la boîte de culture après trois cycles de trypsinisation, utilisez un grattoir cellulaire stérile pour libérer doucement les cellules restantes et avec cinq millilitres de milieu d’expansion, lavez le grattoir et la boîte et recueillez le contenu dans le même tube conique étiqueté. Centrifugez le tube à 360 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et utilisez un millilitre de milieu d’expansion pour remettre en suspension la pastille cellulaire.Utilisez ensuite un hémocytomètre pour compter les cellules. Décongelez la matrice de la membrane basale sur de la glace selon les instructions du fabricant. Séparer un nombre approprié de cellules de passage trypsinisées différentiellement pour une concentration finale de 500 000 cellules par millilitre de matrice.Pour une plaque à quatre puits, utilisez 200 000 cellules et rassemblez-les dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez le mélange cellulaire à un maximum de 360 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, aspirez et jetez complètement et soigneusement le fluide, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire.Gardez le tube de cellules sur de la glace lorsque vous ne le manipulez pas activement. À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, ajoutez 100 microlitres de matrice de membrane basale par puits prévu dans les cellules. Sans vider complètement l’embout de la pipette pour éviter l’introduction de bulles d’air, pipette de haut en bas pour remettre soigneusement et complètement les cellules en suspension.Déplacez-vous rapidement pour éviter la solidification de la matrice. Pour ensemencer des aliquotes de matrice de 100 millilitres dans chaque puits d’une plaque de culture de FIV à quatre puits, utilisez une paire de ciseaux propres pour couper le distal de trois à quatre millimètres d’une pointe de pipette de 200 microlitres. Pipetez soigneusement et lentement une goutte de 100 microlitres de mélange de matrice cellulaire au centre de chaque puits, en veillant à ce que la goutte reste sphérique et ne touche pas les côtés du puits.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes jusqu’à ce qu’elle soit solide. Ensuite, pipetez soigneusement 500 microlitres de milieu de différenciation dans chaque puits, en prenant soin de ne pas perturber la chute de la matrice. Assurez-vous que le milieu ne couvre que la goutte et ajoutez-en plus si nécessaire.Pour cultiver des sphéroïdes HNE, à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, aspirez doucement tout le milieu du puits tout en évitant la matrice qui détruira les sphéroïdes. Ensuite, avec une pointe de pipette fraîche d’un millilitre et tout en évitant de toucher ou de perturber la matrice, ajoutez doucement 500 microlitres de milieu de différenciation dans le puits autour de la matrice. Continuez à incuber les sphéroïdes, en remplaçant le milieu de différenciation trois fois par semaine comme nous venons de le démontrer.Sous un microscope inversé à un grossissement de 20X, évaluez quotidiennement la morphologie des sphéroïdes. Les sphéroïdes doivent se former dans les trois à cinq jours suivant le placage et atteindre leur maturité dans environ 10 jours. Les HNE doivent se fixer à la boîte de culture et former de petits îlots dans les 72 heures suivant l’ensemencement.Des exemples de bonne et de mauvaise formation d’îles en une semaine sont présentés ici. Les îles devraient s’étendre pour couvrir le plat sur une période de 15 à 30 jours. Au cours des trois à quatre premiers jours de culture, de petites structures kystiques devraient commencer à se former dans la matrice et à mûrir sur environ 10 jours.Si elles sont plaquées à la densité décrite, les cultures réussies contiendront 50 à 100 sphéroïdes par goutte de matrice. Les lumières peuvent être relativement claires comme chez les CFTR de type sauvage ou remplies de débris cellulaires et de mucus comme chez les sphéroïdes de la mucoviscidose. Le masquage pour délimiter la zone luminale des sphéroïdes est démontré dans ces deux panneaux.Voici des exemples de cultures de sphéroïdes mal formées et infructueuses. Comme l’illustrent ces graphiques d’essais fonctionnels, les sphéroïdes de sujets atteints de CFTR de type sauvage devraient gonfler pendant plus d’une heure lorsqu’ils sont stimulés et devraient gonfler moins ou rétrécir s’ils sont stimulés en présence de l’inhibiteur de CFTR inh-172. Les sphéroïdes d’un sujet homozygote pour F508del-CFTR doivent rétrécir ou gonfler très légèrement avec l’augmentation du gonflement ou moins de rétrécissement lorsqu’ils sont corrigés pharmacologiquement avec les modulateurs CFTR VX809 et VX770.Une fois maîtrisé, l’ensemencement des sphéroïdes des cellules nasales peut se faire en 15 à 20 minutes s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des procédures de fonctionnement propres à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité afin de minimiser le risque de contamination de l’échantillon et d’éviter tout risque pour votre propre santé. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la fixation, la coloration et la microscopie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la morphologie et la composition cellulaires.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des sphéroïdes de cellules nasales humaines primaires qui peuvent être utilisés comme un test personnalisé de la fonction CFTR. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains primaires peut être dangereux et que des précautions telles que l’utilisation appropriée d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Cellules épithéliales nasales, obtenues par grattage superficiel de la biopsie des volontaires humains, sont expansées et transférées sur des inserts de culture tissulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont cultivées à l'interface air-liquide, ce qui donne des cultures de cellules ciliées et non ciliées. Cultures de cellules épithéliales nasales différenciées fournissent des modèles expérimentaux viables pour l'étude de la muqueuse respiratoire.

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

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Forskoline induite par Gonflement dans Intestinal organites: Un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer la réponse des médicaments dans les patients atteints de fibrose kystique

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Organoïdes épithéliales mucociliaires des cellules embryonnaires de Xenopus : génération, culture et imagerie vivante haute résolution

Un protocole détaillé est présenté ici pour décrire un modèle organoïde in vitro à partir de cellules épithéliales nasales humaines. Le protocole propose des options pour les mesures nécessitant un équipement de laboratoire standard, avec des possibilités supplémentaires pour l’équipement et les logiciels spécialisés.

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Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

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