Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

L’ensemble de cette procédure consiste à générer des sphéroïdes de cellules nasales humaines qui peuvent finalement être utilisés comme test pour les études fonctionnelles de CFTR. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la fibrose kystique, telles que l’évaluation de la réponse d’un sujet individuel à des médicaments modifiant CFTR dans un système modèle ex vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’un grand nombre de sphéroïdes sont générés dans un délai relativement rapide à partir d’un petit échantillon de cellules nasales, ce qui permet des tests approfondis.

Lauren Strecker et Jessica Moncivaiz, techniciennes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Après avoir traité et développé des cellules épithéliales nasales humaines ou HNE sur des fibroblastes nourriciers conformément au protocole de texte, apportez le milieu d’expansion préalablement préparé, le milieu de différenciation, la solution de trypsine EDTA à 0,1 % et le PBS stérile à température ambiante pendant 30 minutes. Utilisez ensuite de l’éthanol à 70 % pour nettoyer les récipients et transférez-les dans une enceinte de biosécurité propre.

Dans l’enceinte de biosécurité, utilisez une pipette Pasteur fixée à une conduite de vide pour aspirer et jeter le milieu de la culture de HNE. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique propre, utilisez cinq millilitres de PBS pour laver la parabole en ajoutant, en remuant et en aspirant le tampon. Ajoutez cinq millilitres de solution de trypsine EDTA à 0,1 % dans la culture et remettez-la dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes.

Puis sous un microscope inversé à quatre à 10X, vérifiez que les cellules se détachent de la parabole, deviennent rondes et flottent. Tapotez doucement le côté de la boîte de culture pour déloger les cellules et, si nécessaire, réincubez la boîte pendant cinq minutes supplémentaires jusqu’à ce que la plupart des cellules soient détachées. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, ajoutez cinq millilitres de milieu d’expansion dans la boîte et recueillez tout le liquide dans un tube conique stérile de 50 millilitres étiqueté.

Si les cellules restent adhérentes à la boîte de culture après trois cycles de trypsinisation, utilisez un grattoir cellulaire stérile pour libérer doucement les cellules restantes et avec cinq millilitres de milieu d’expansion, lavez le grattoir et la boîte et recueillez le contenu dans le même tube conique étiqueté. Centrifugez le tube à 360 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et utilisez un millilitre de milieu d’expansion pour remettre en suspension la pastille cellulaire.

Utilisez ensuite un hémocytomètre pour compter les cellules. Décongelez la matrice de la membrane basale sur de la glace selon les instructions du fabricant. Séparer un nombre approprié de cellules de passage trypsinisées différentiellement pour une concentration finale de 500 000 cellules par millilitre de matrice.

Pour une plaque à quatre puits, utilisez 200 000 cellules et rassemblez-les dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez le mélange cellulaire à un maximum de 360 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, aspirez et jetez complètement et soigneusement le fluide, en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire.

Gardez le tube de cellules sur de la glace lorsque vous ne le manipulez pas activement. À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, ajoutez 100 microlitres de matrice de membrane basale par puits prévu dans les cellules. Sans vider complètement l’embout de la pipette pour éviter l’introduction de bulles d’air, pipette de haut en bas pour remettre soigneusement et complètement les cellules en suspension.

Déplacez-vous rapidement pour éviter la solidification de la matrice. Pour ensemencer des aliquotes de matrice de 100 millilitres dans chaque puits d’une plaque de culture de FIV à quatre puits, utilisez une paire de ciseaux propres pour couper le distal de trois à quatre millimètres d’une pointe de pipette de 200 microlitres. Pipetez soigneusement et lentement une goutte de 100 microlitres de mélange de matrice cellulaire au centre de chaque puits, en veillant à ce que la goutte reste sphérique et ne touche pas les côtés du puits.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes jusqu’à ce qu’elle soit solide. Ensuite, pipetez soigneusement 500 microlitres de milieu de différenciation dans chaque puits, en prenant soin de ne pas perturber la chute de la matrice. Assurez-vous que le milieu ne couvre que la goutte et ajoutez-en plus si nécessaire.

Pour cultiver des sphéroïdes HNE, à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, aspirez doucement tout le milieu du puits tout en évitant la matrice qui détruira les sphéroïdes. Ensuite, avec une pointe de pipette fraîche d’un millilitre et tout en évitant de toucher ou de perturber la matrice, ajoutez doucement 500 microlitres de milieu de différenciation dans le puits autour de la matrice. Continuez à incuber les sphéroïdes, en remplaçant le milieu de différenciation trois fois par semaine comme nous venons de le démontrer.

Sous un microscope inversé à un grossissement de 20X, évaluez quotidiennement la morphologie des sphéroïdes. Les sphéroïdes doivent se former dans les trois à cinq jours suivant le placage et atteindre leur maturité dans environ 10 jours. Les HNE doivent se fixer à la boîte de culture et former de petits îlots dans les 72 heures suivant l’ensemencement.

Des exemples de bonne et de mauvaise formation d’îles en une semaine sont présentés ici. Les îles devraient s’étendre pour couvrir le plat sur une période de 15 à 30 jours. Au cours des trois à quatre premiers jours de culture, de petites structures kystiques devraient commencer à se former dans la matrice et à mûrir sur environ 10 jours.

Si elles sont plaquées à la densité décrite, les cultures réussies contiendront 50 à 100 sphéroïdes par goutte de matrice. Les lumières peuvent être relativement claires comme chez les CFTR de type sauvage ou remplies de débris cellulaires et de mucus comme chez les sphéroïdes de la mucoviscidose. Le masquage pour délimiter la zone luminale des sphéroïdes est démontré dans ces deux panneaux.

Voici des exemples de cultures de sphéroïdes mal formées et infructueuses. Comme l’illustrent ces graphiques d’essais fonctionnels, les sphéroïdes de sujets atteints de CFTR de type sauvage devraient gonfler pendant plus d’une heure lorsqu’ils sont stimulés et devraient gonfler moins ou rétrécir s’ils sont stimulés en présence de l’inhibiteur de CFTR inh-172. Les sphéroïdes d’un sujet homozygote pour F508del-CFTR doivent rétrécir ou gonfler très légèrement avec l’augmentation du gonflement ou moins de rétrécissement lorsqu’ils sont corrigés pharmacologiquement avec les modulateurs CFTR VX809 et VX770.

Une fois maîtrisé, l’ensemencement des sphéroïdes des cellules nasales peut se faire en 15 à 20 minutes s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des procédures de fonctionnement propres à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité afin de minimiser le risque de contamination de l’échantillon et d’éviter tout risque pour votre propre santé. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la fixation, la coloration et la microscopie peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la morphologie et la composition cellulaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des sphéroïdes de cellules nasales humaines primaires qui peuvent être utilisés comme un test personnalisé de la fonction CFTR. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains primaires peut être dangereux et que des précautions telles que l’utilisation appropriée d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.