Un commutateur gène du singulier axée sur les récepteurs de l’Ecdysone pour délibérée Expression du transgène avec robustesse, réversibilité et perméabilité négligeable

L’objectif global de cette expérience est de moduler l’expression du transgène par l’administration de l’inducteur chimique tébufenozide. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire et moléculaire, par exemple lorsque vous devez stimuler l’expression d’un gène d’intérêt à un moment souhaité avec une force souhaitée. Le principal avantage de cette technique est qu’en combinant tous les éléments nécessaires à l’expression du transgène au sein d’un seul vecteur, l’expression du transgène peut être stimulée par l’administration de l’inducteur chimique tébufenozide.

Après avoir sous-cloné l’EGFP ou ANKRD13A transgènes selon le protocole textuel, préparez quatre boîtes de culture cellulaire contenant des cellules HEK 293 fraîchement passées dans cinq millilitres de DMEM complétés par cinq à 10 % de FBS et des antibiotiques, qui seront ci-après appelés milieu de culture. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules atteignent une densité de 50 à 60 %, ajoutez trois microlitres de réactif de transfection à 200 microlitres de diluant contenant l’ADN.

Après avoir incubé la réaction à température ambiante pendant 30 minutes, ajoutez le mélange dans les cellules HEK 293. Utilisez deux plats pour la transfection et laissez les deux autres non traités comme témoins. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 12 à 24 heures.

Après l’incubation, ajouter Teb à l’un des échantillons transfectés et à l’un des témoins non transfectés. Laissez les deux autres échantillons non traités en tant que témoins expérimentaux. Incuber les plaques pendant 12 à 48 heures.

Si vous utilisez l’insert EGFP, analysez l’expression de l’EGFP au microscope fluorescent. Sinon, pour récolter les cellules pour l’immunobuvardage, utilisez du PBS glacé pour rincer les cellules deux fois. Ensuite, utilisez un grattoir cellulaire pour les retirer de la plaque et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, faites tourner les tubes à 21 000 fois g et à 18 à 25 degrés Celsius pendant deux minutes. Ensuite, après avoir jeté le PBS, ajoutez 0,5 millilitre de réactif d’extraction de protéines de mammifères glacé, ou M-PER, et un inhibiteur de protéase à la pastille. Remettez les cellules en suspension avec plusieurs cycles de pipetage.

Ensuite, incubez la suspension cellulaire à 18 à 25 degrés Celsius et à température ambiante pendant 15 minutes. Faites tourner le lysat cellulaire à 21 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, transférez le surnageant aqueux dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et analysez-le par immunobuvardage avec les anticorps appropriés.

Pour éteindre les stimuli Teb, retirez le milieu de culture contenant Teb des cellules et utilisez du PBS préchauffé pour rincer les cellules deux fois. Ensuite, ajoutez un millilitre de trypsine à 0,25 % / EDTA et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant une minute. Ajoutez 10 millilitres de milieu de culture préchauffé et sans Teb aux cellules et utilisez un grattoir cellulaire pour les récolter.

Transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, faites tourner les cellules à 21 000 fois g et à 18 à 25 degrés Celsius pendant deux minutes. Remettez les cellules en suspension dans 50 millilitres de milieu de culture préchauffé et sans Teb, et transférez cinq millilitres de cellules dans trois boîtes de culture cellulaire fraîches de 60 millimètres.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24, 48 et 72 heures, respectivement. Enfin, récoltez les cellules à différents moments et mesurez les niveaux d’expression du transgène à l’aide de l’immunoblottage. Dans cette expérience qui a évalué l’activité et la fuite de pEUI-plus-EGFP, les transfectants vectoriels fictifs n’ont montré aucun signal fluorescent indépendamment du traitement Teb.

Cependant, les transfecteurs pEUI-plus-EGFP sont devenus progressivement sensibilisés à la quantité croissante de Teb. Plus important encore, les transfectants pEUI-plus-EGFP non traités avec Teb n’ont pas suscité de signaux EGFP détectables. Le ANKRD13A étiqueté FLAG a été utilisé pour valider davantage la réactivité de pEUI-plus à Teb.

Comme le montre ce western blot utilisant des anticorps anti-FLAG, les cellules HEK 293 transfectées ont présenté une forte expression ANKRD13A après un traitement de 24 heures avec Teb. De plus, la déplétion de Teb a démontré la réversibilité du commutateur du gène pEUI-plus, car ANKRD13A n’était plus détectable dans les cellules cultivées sans Teb. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de réaliser presque toute l’expérience dans des conditions exemptes de germes. Après cette procédure, d’autres méthodes, comme le système Tet-On ou Tet-Off, peuvent être appliquées pour exprimer différentiellement deux transgènes distincts. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la physiologie moléculaire au niveau cellulaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le vecteur de commutation de gène pEUI-plus dans le but d’induire l’expression du transgène à un moment souhaité avec une force souhaitée. N’oubliez pas que travailler avec le tébufénozide peut être dangereux et que des précautions, telles que le port d’une blouse de laboratoire, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.