Name: Un commutateur gène du singulier axée sur les récepteurs de l’Ecdysone pour délibérée Expression du transgène avec robustesse, réversibilité et perméabilité négligeable (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Découvrez comment moduler l'expression des transgènes avec le commutateur génique pEUI(+) et le tebufenozide dans les cellules HEK 293. Cette méthode offre un contrôle précis et réversible de l'activation génique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs remercient S-Y Choi (Université nationale de Chonnam) pour les précieux commentaires et de la lecture attentive de notre manuscrit. Ce travail a été soutenu par un fonds de recherche de l’Université nationale de Chungnam.

1. transgène Subcloning
<ol><li>Choisir un site de reconnaissance appropriée des enzymes de restriction (ou sites) à la STM de pEUI(+) et subclone du gène d’intérêt dans la direction désirée (Figure 1). Remarque : L’ankyrin épitope-tag EGFP ou drapeau répéter domaine 13 a (ANKRD13A) transgène a été sous-cloné dans site EcoRI du vecteur pEUI(+) à l’aide de T4 ADN polymérase dans un séquence ligature indépendant et19de la méthode de clonage.</li>
	<li>Linéariser la pEUI(+) avec EcoRI pendant 1 h à 37 ° C. Mélanger 50 ng/µL de linéarisé pEUI(+) 40 ng/µl d’amplifié par PCR EGFP ou ANKRD13A et réagissent avec la polymérase ADN T4 (1 U) pendant 1 min à température ambiante (RT) avant incubation sur la glace pendant 10 min. Ajouter 10 µL du mélange réactionnel directement à 100 µL de DH10B cellules compétentes pour la transformation suivante experiment. Remarque : Bien que plusieurs sites de reconnaissance d’enzyme de restriction ont été ajoutés à la STM de pEUI(+) (Figure 1 b), nous recommandons subcloning gène ciblé dans le site EcoRI, indépendant de la ligature clonage technologie19,20.</li>
	<li>Vérifier l’insert par séquençage et ensuite purifier l’ADN à l’aide d’un kit de purification de l’ADN qui convient pour la transfection.</li>
</ol>2. transitoire Transfection et traitement de Teb
<ol><li>Préparer quatre récipients de culture cellulaire (60 mm de diamètre) contenant fraîchement repiquées cellules HEK293 dans 5 mL de milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionnés de 5 à 10 % sérum fœtal (SVF) et antibiotiques (100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine). Ci-après, « milieu de culture cellulaire » ou simplement « milieu de la culture » représente le DMEM additionné de FBS et antibiotiques. Maintenir les cellules HEK293 à 37 ° C.</li>
	<li>Transfecter 1 µg d’ADN purifié dans les cellules HEK293 à densité de 50-60 % avec 3 µL de réactif de transfection. Ajouter le réactif de transfection à 200 µL de diluant (DMEM sans FBS et antibiotiques) contenant l’ADN. Après l’incubation du mélange réactionnel pour 30 min à ta, ajouter le mélange aux cellules HEK-293 sur la boîte de Pétri. Utilisez deux plats pour la transfection et laisser les deux autres n’est pas traité en tant que contrôles.</li>
	<li>Après 12 à 24 heures de la transfection, ajoutez Teb (concentration finale, 0,2 - 10 µmol) à l’un des échantillons transfectés et à des contrôles non transfectées. Laissez les deux autres échantillons n’est pas traités en tant que contrôles expérimentaux. Remarque : La solution mère de Teb (50 mM dissous dans le diméthylsulfoxyde) peut être diluée dans un milieu de culture cellulaire, DMEM ou solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration appropriée avant d’ajouter dans les cellules cultivées selon les paramètres expérimentaux. Toutefois, en raison de la faible solubilité de Teb en solution aqueuse, éviter de préparer un mélange maître avec une forte concentration de Teb dans le milieu ; au contraire, remplacer le milieu de culture cellulaire complet avec un milieu frais contenant Teb à la concentration désirée.</li>
	<li>Cultiver les cellules Teb-traités et non traités pendant 12 à 48 heures à 37 ° C.</li>
	<li>Si à l’aide de l' EGFP insert, analyser l’expression EGFP sous un microscope à fluorescence ( Figure 2). Dans le cas contraire, récolter les cellules pour un dosage immunoblotting.<ol>
<li>Pour le dosage d’immunoblotting, rincer les cellules deux fois avec du PBS glacée et puis les gratter à l’aide d’un grattoir de cellules.</li>
		<li>Pour empiler les cellules, tournez en bas des récoltes dans un tube conique de 15 mL à 21 000 x g pendant 2 min à 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Après avoir jeté le PBS complètement, ajouter 0,5 mL de réactif d’extraction de protéines de mammifères glacee (M-par), ainsi que l’inhibiteur de la protéase (5 µL de 100 x cocktail inhibiteur de protéase), au culot si les cellules sont cultivées dans un plat de 60 mm.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules avec plusieurs cycles de pipetage et puis incuber les cellules en suspension pendant 15 min à 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Faire tourner la cellule lysate à 21 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Transvaser le surnageant aqueux dans un tube de microcentrifuge frais de 1,5 mL.</li>
		<li>Analyser le liquide surnageant par immunoblotting, suivant des protocoles standard avec des anticorps appropriés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. génération des lignées de cellules HEK293 Stable avec intégration génomique de la pEUI(+) Gene Switch
<ol><li>Transfecter 5-10 µg de le pEUI(+) purifié avec le transgène dans les cellules HEK293 anastomosé 50 à 60 % dans une boîte de Petri cellule de diamètre 90 mm, à l’aide de 15 à 30 µL de réactif de la transfection. Ajouter le réactif de transfection de 500 µL de diluant (DMEM sans FBS et antibiotiques) contenant l’ADN. Après l’incubation du mélange réactionnel pour 30 min à ta, ajouter le mélange aux cellules HEK-293 sur la boîte de Pétri.</li>
	<li>Après la transfection, permettre les transfectants à croître et à exprimer les produits des gènes puromycine-résistance dans le milieu de culture non sélectif (sans la puromycine) pendant 24 à 48 heures à 37 ° C.</li>
	<li>Dissocier les cellules de la vaisselle de la culture par trypsinisation. Après avoir jeté le milieu de culture, rincer les transfectants avec PBS préchauffé (37 ° C), ajouter 1 mL d’acide de 0,25 % trypsine/tétraacétique (EDTA) et incuber pendant 1 min à 37 ° C. Après la trempe la trypsine/EDTA en ajoutant le milieu de culture pré chauffé (10 mL, 37 ° C), récolter les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules, suivi par centrifugation dans un tube conique de 15 mL à 21 000 x g pendant 2 min à 18-25 ° C.</li>
	<li>Remettre en suspension les transfectants dans 50 mL de milieu de culture pré chauffé (37 ° C) et transfert 10 mL des cellules dans les récipients de culture de cellules fraîches 90 mm. La culture des cellules à 37 ° C jusqu'à la confluence de 50 à 60 % avant le traitement de la puromycine (en général, cela prend environ 24-48 h).</li>
	<li>Cultiver les transfectants à 37 ° C en milieu de culture cellulaire, additionné de la puromycine 3 µg/mL pendant 3-4 semaines. Au cours de la période de sélection, changer le milieu de culture cellulaire contenant la puromycine (3 µg/mL) tous les 2-3 jours pour maintenir la pression de sélection. Lorsque les cellules deviennent entièrement confluentes, divisez-les en suivant les procédures de mesures 3.3-3.4, avec milieu de culture contenant la puromycine. Jeter les cellules restantes dans le milieu de culture, si ne pas nécessaire. Remarque : Les conditions de sélection puromycine doivent être établies expérimentalement pour des types spécifiques de cellules. Nous avons utilisé 3 µg/mL de puromycine dans un milieu de culture cellulaire ; Cela était suffisant pour induire la mort cellulaire dans HEK293 non transfectées.</li>
	<li>Récolter les cellules provenant des colonies individuelles, à l’aide d’un cylindre de clonage et suivez les instructions du fabricant.<ol>
<li>Jeter le milieu de culture cellulaire. Rincez la plaque deux fois avec pré chauffé (37 ° C) PBS pour éliminer les cellules flottantes.</li>
		<li>À l’aide d’une pince stérile, remettre la bouteille de clonage les colonies individuelles.</li>
		<li>Ajouter 0,2 mL de 0,35 % trypsine/EDTA pour chaque cylindre.</li>
		<li>Incuber le plat à 37 ° C pendant 1 min, jusqu'à ce que les cellules sont détachés et puis ajoutez quelques gouttes de milieu de culture pré chauffé (37 ° C) pour les cylindres.</li>
		<li>Transférer les cellules de chaque cylindre à chaque puits d’une plaque 6 puits, avec 2 mL de milieu de culture et 1 µg/mL de puromycine dans chaque puits. Remarque : Lorsque les cellules deviennent confluentes, intensifier la culture. Clone(s) peut maintenant être établie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maintenir des clones individuels en milieu de culture cellulaire, additionné de 1 µg/mL de puromycine.</li>
	<li>Valider les colonies individuelles en testant leur sensibilité au traitement de Teb (concentration finale, 10 µM) pendant 24 h. Test de la réactivité des clones à l’ETB en analysant le niveau d’expression du transgène avec immunoblotting. Sélectionner un clone désiré (ou clones). Cultiver un Teb-traité et un échantillon non traité dans le milieu de culture pendant 12 à 48 heures à 37 ° C avant d’analyser le niveau d’induction du transgène. Le niveau d’expression du transgène peut être mesuré par immunoblotting, suivant les procédures de mesures 2.5.1 - 2.5.7.</li>
</ol>4. l’appauvrissement de Teb
<ol><li>Étancher les stimuli Teb en remplaçant Teb contenant un milieu de culture cellulaire avec un milieu sans Teb. Remarque : Il est recommandé de remplacer les milieux de culture sans premier réensemencement des cellules sur une nouvelle boîte de Pétri. Teb résiduel semble s’accrocher à la vaisselle en plastique et va susciter une expression forte expérience du transgène. Avant le réensemencement des cellules sur une plaque de culture nouvelle, rincer les cellules récoltées plusieurs fois avec milieu de culture ou PBS.<ol>
<li>Dissocier les cellules de la vaisselle de la culture par trypsinisation. Après avoir jeté l’ETB contenant le milieu de culture, rincer les cellules stimulées par Teb deux fois avec du PBS préchauffé (37 ° C), ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine/EDTA et incuber pendant 1 min à 37 ° C. Après la trempe la trypsine/EDTA en ajoutant préchauffé Teb-free culture medium (10 mL, 37 ° C), récolter les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules, suivi par centrifugation dans un tube conique de 15 mL à 21 000 x g pendant 2 min à 18-25 ° C.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 50 mL de milieu de culture pré chauffé exempt de Teb (37 ° C) et transfert 5 mL des cellules dans trois récipients de culture de cellules fraîches de 60 mm. La culture des cellules à 37 ° C pendant 24, 48 et 72 h respectivement.</li>
		<li>Récolter les cellules à des moments différents et mesurer le niveau d’expression du transgène en utilisant immunoblotting. Remarque : Dans ces conditions expérimentales, l’expression du transgène est devenu indétectable environ 3 jours après la culture des cellules dans le milieu culturel sans Teb (Figure 3). Le niveau d’expression du transgène peut être mesuré par immunoblotting, comme par les Etapes 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li>
<li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+gene+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li>
<li>Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuzuki%2C+Y+%22Viral+Gene+Therapy%22">Viral Gene Therapy</a>. Xu, K. , InTech. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system">http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system</a> 285-309 (2011).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells%3A+principles+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li>
<li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP%2FmTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+and+mTOR%3A+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29(2012).</li>
<li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+uses+of+mifepristone+%28MFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li>
<li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+properties+of+mifepristone%3A+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contraception%22%5BJournal%5D)">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li>
<li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li>
<li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam+Horm%22%5BJournal%5D)">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li>
<li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li>
<li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor%3A+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression%2C+and+reduced+size%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367(2016).</li>
<li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li>
<li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-inducible%2C+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li>
<li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li>
<li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N%27-benzoyl-N-%28tert-butyl%29benzohydrazide%3A+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li>
<li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li>
<li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide%2C+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li>
<li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li>
<li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149(2014).</li>
<li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+for+Gene+Therapy%3A+Translational+and+Clinical+Outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li>
<li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li>
<li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li>
</ol>

Nous n’avons aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.

Le principal inconvénient de l’utilisation d’un commutateur d’expression de gène binaire est la nécessité d’offrir simultanément deux plasmides distincts (pilote et effectrices) dans la cellule cible. Cela peut conduire à une répartition inégale des plasmides et aboutir à une réponse incohérente du commutateur pour les inducteurs1,2,3. Une autre lacune du système deux-vecteur est qu’un minimum de deux tours de sélection antibiot...

Plusieurs gènes différents commutateurs ont été étudiés pour leur capacité à précisément régulent l’expression de transgènes dans les cultures cellulaires et des modèles animaux, avec des degrés de succès1,2,3. Des systèmes de commutation de gènes potentiels se réunisse plusieurs critères stricts, notamment : précise directionnelle expression du transgène, réactivité de la fonction du dosage et temps à inducteurs, de perméabilité négligeable du promoteur, de réversibilité du transgène activation par le biais de suppression de l’inducteur et des niveaux de toxicité inducteur tolérables de lignées cellulaires et les animaux de laboratoire1,2,3. Plusieurs inducteurs de petites molécules ont été exploitées, y compris la tétracycline4,5, la rapamycine6,7,8, mifépristone9,10, et l’ecdysone11,12,13,14. En général, ces systèmes nécessitent au moins deux plasmides contenant deux ou trois unités discrètes d’expression, un ou deux qui composent un élément régulateur (plasmide inducteur) qui lie un inducteur de petite molécule d’acquérir l’activité transcriptionnelle ; et un autre plasmide (plasmide effecteur) contenant le transgène sous le contrôle d’une région régulatrice de l’ADN qui permet l’accès de l’élément réglementaire lié aux inducteur. Le principal inconvénient du système binaire est qu’il exige l’introduction concomitante de deux vecteurs (inducteur et effectrices) dans la cellule cible. Dans les expériences d’expression transitoire transgène, la transfection simultanée des deux plasmides produit inévitablement une population de cellules qui est transfectées avec l’inducteur ou l’effecteur isolément ou conjointement transfectées inégalement. En outre, le système binaire nécessite au moins deux tours de sélection antibiotique d’établir des lignées cellulaires stables, qui est longue et laborieuse. Ainsi, combinant tous les composants requis pour l’expression du transgène et de réglementation dans un unique vecteur serait idéale pour garantir l’expression simultanée de tous les éléments requis dans une seule cellule et permettre la régulation de l’expression du transgène Grâce à un traitement avec des inducteurs de petites molécules.
Pour remédier aux insuffisances des commutateurs de gène binaire, nous avons développé récemment un commutateur de gène du singulier, utilisant un Drosophila melanogaster axée sur les EcR gène inductible système15. L’ecdysone intervient dans l’expression des gènes, lorsqu’il se lie à l’hétérodimère EcR/ultraspiracle (USP), qui induit à son tour la liaison du recueil d’ADN des éléments régulateurs3,11. Le récepteur de vertébrés retinoid X (RXR), un orthologues d’insecte USP, recrute des EcR pour former un actif activateur de la transcription16. Ainsi, pour l’expression ciblée d’un transgène dans les cellules de vertébrés ou d’un tissu, le recueil et le RXR doivent être conjointement exprimé simultanément avant étant stimulée par l’ecdysone ou ses agonistes. Étant donné que la fonctionnalité d’hétérodimères du commutateur génique à base EcR peut être influencée par paquet niveau, RXR endogène et al. remplacé les domaines de liaison à l’ADN de l’EcR et l’activation avec le liant à l’ADN de GAL4 hétérologue, herpès simplex virus protéine vmw65 domaines d’activation (VP16) fondu vers le domaine de liaison du ligand EcR, qui ensuite devenue insensible aux RXR endogène et forme un homodimère pour obtenir de l’activité transcriptionnelle17. Le commutateur de gène axée sur les EcR a été encore amélioré par la construction d’une protéine chimérique composée d’un minimum domaine d’activation VP16 combiné avec GvEcR, qui forme un homodimère et localisée dans le cytosol en l’absence de l’agoniste de l’ecdysone, Teb16, 18. En se liant à Teb, le GvEcR a changé sa localisation subcellulaire du cytosol vers le noyau de reconnaître un promoteur hybride composé du poisson-zèbre E1b promoteur minimal combiné avec un tandem dix répété séquences d’activation en amont (HES) pour initier la transcription du gène cible16.
Pour simplifier le gène axée sur les EcR rapporté antérieurement commutateurs16,18, nous avons combiné les dispositifs binaires du système dans un vecteur unique équipé de tous les éléments requis pour stimuler l’expression transgénique et ensuite désignée le vecteur généré récemment, pEUI(+) (nombre de GenBank accession : KP123436, la Figure 1 a)15. Le processeur d’effets en réponse à la GvEcR (ci-après pilote) se compose de dix tandem SAMU répète à côté d’un promoteur minimal E1b suivi d’un site multiple de clonage (MCS) avec des séquences de reconnaissance EcoRI PmlI, NheI, société, AfeI et AflII (Figure 1 b). En outre, pour faciliter la sélection des transfecté des cellules, une puromycine de pilotée par le promoteur SV40 N-acétyl-transférase (PAC) a été placée entre le pilote et effecteur de maintenir les lignées cellulaires stables (Figure 1).
Les auteurs décrivent un protocole détaillé pour la modulation transitoire et stable de transgene expression à l’aide de pEUI(+). En outre, nous fournissons des instructions détaillées pour l’utilisation réussie de Teb comme un agoniste de l’ecdysone.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>La licence du brevet a été transférée à TransLab Inc.</td></tr><tr><td>Réactif de transfection Gene-Fect</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre de clonage</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire</td><td>SPL sciences de la vie</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>souris FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-alpha tubuline</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre de clonage</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Protein Réactif d’extraction</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Inhibiteur de protéase Cock. III</td><td>T& I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

un commutateur gène du singulier axée sur les récepteurs de l’ecdysone pour délibérée expression du transgène avec robustesse, réversibilité et perméabilité négligeable

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Un contrôle précis de l’expression du transgène est souhaitable dans les études cliniques et biologiques. Cependant, parce que la fonction binaire d’interrupteurs de gène actuellement employé exige le transfert de deux unités d’expression thérapeutique simultanément en une seule cellule, l’application pratique du système pour la thérapie génique est limitée. Pour simplifier le système d’expression de transgènes, nous avons généré un commutateur de gène dénommé pEUI(+) qui englobe un ensemble complet de modules d’expression du transgène dans un vecteur unique. Comprenant le domaine de liaison à l’ADN de GAL4 et mis à jour le recueil (GvEcR), un domaine d’activation minimal VP16 fusionné avec un domaine de liaison à l’ADN de GAL4, mais aussi un mis à jour le récepteur de l’ecdysone Drosophila (EcR), le commutateur de gène du singulier nouvellement mis au point est très sensible à l’administration d’un inducteur chimique d’une manière dépendante du temps et dosage. Le vecteur pEUI(+) est un outil potentiellement puissant pour améliorer le contrôle de l’expression du transgène en recherche en biologie et en études précliniques. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la modulation d’une expression du transgène transitoire et stable en utilisant le vecteur pEUI(+) par le traitement de tébufénozide (Teb). En outre, nous partageons des orientations importantes pour l’utilisation de Teb comme un inducteur chimique.

Le commutateur axée sur les GvEcR du singulier gène est représenté dans la Figure 1 a. Le vecteur de pEUI(+) a été optimisé pour l’expression de transgènes réglementés par le traitement avec Teb. La région d’effecteur des pEUI(+) comprend un 10xUAS et un E1b promoteur minimal suivie d’une MCS contenant les sites de reconnaissance d’enzyme de restriction EcoRI, PmlI, NheI, société, AfeI et AflII. Un signal de poly SV40 a été ajouté derrière le MCS (<strong cla...

Nous présentons ici un protocole pour la modulation de transgene expression à l’aide de pEUI(+) du singulier gène interrupteur par traitement tébufénozide.

Un commutateur gène du singulier axée sur les récepteurs de l’Ecdysone pour délibérée Expression du transgène avec robustesse, réversibilité et perméabilité négligeable

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

L’objectif global de cette expérience est de moduler l’expression du transgène par l’administration de l’inducteur chimique tébufenozide. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire et moléculaire, par exemple lorsque vous devez stimuler l’expression d’un gène d’intérêt à un moment souhaité avec une force souhaitée. Le principal avantage de cette technique est qu’en combinant tous les éléments nécessaires à l’expression du transgène au sein d’un seul vecteur, l’expression du transgène peut être stimulée par l’administration de l’inducteur chimique tébufenozide.Après avoir sous-cloné l’EGFP ou ANKRD13A transgènes selon le protocole textuel, préparez quatre boîtes de culture cellulaire contenant des cellules HEK 293 fraîchement passées dans cinq millilitres de DMEM complétés par cinq à 10 % de FBS et des antibiotiques, qui seront ci-après appelés milieu de culture. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules atteignent une densité de 50 à 60 %, ajoutez trois microlitres de réactif de transfection à 200 microlitres de diluant contenant l’ADN.Après avoir incubé la réaction à température ambiante pendant 30 minu

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

La production de C. elegans Les transgènes via Recombineering avec le GalK Marqueurs de sélection

Variation phénotypique des traits peut résulter de mutations dans le cis-régulation élément (CRE) des séquences que les modèles de contrôle l'expression des gènes. Méthodes pour une utilisation dérivée de Drosophila melanogaster peuvent comparer quantitativement les niveaux de la répartition spatiale et temporelle de l'expression génique médiée par des variantes de la CRE modifiés ou naturelle.

Comparaison quantitative des Cis-Regulatory Element (CRE) Activités dans transgéniques Drosophila melanogaster</em

Source : Berens, C. et al. Application d’un système d’expression inductible pour étudier l’interférence des facteurs de virulence bactérienne avec la signalisation intracellulaire. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre l’utilisation d’un système d’expression inductible pour identifier où la protéine effectrice bactérienne CaeB perturbe la cascade apoptotique de l’hôte. Il décrit les étapes pour transfecter les cellules exprimant CaeB avec un système sensible à la tétracycline afin d’induire...

Transfection d’un système d’expression génique inductible dans des cellules exprimant une protéine efectoire bactérienne

Cette vidéo démontre le système d’expression génique de la tétracycline, ou Tet-On, dans un modèle murin. En présence de doxycycline, un dérivé de la tétracycline, le système Tet-On constitué de la protéine transactivatrice inverse contrôlée par la tétracycline s’active et exprime le gène d’intérêt.

Expression génique inductible basée sur le système régulable Tet-On in vivo : un système d’expression génique induit par la tétracycline pour l’activation de la transcription du gène cible dans un modèle murin

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour la construction rapide des facteurs de transcription artificiels (atfs) avec les journalistes de la GFP apparentées et la quantification de la capacité des carburants de remplacement à stimuler l'expression de la GFP par cytométrie de flux.

Synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec Reporters base GFP

La méthode décrite ici est utilisée pour induire la cascade de signalisation apoptotique à des étapes définies afin de disséquer l’activité d’une protéine effectrice bactérienne anti-apoptotique. Cette méthode peut également être utilisée pour l’expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer l’interférence avec d’autres voies de signalisation.

L&#39;application d&#39;un système d&#39;expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

Nous présentons ici une méthode pour générer des systèmes de transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile en remplaçant le premier exon codante des gènes avec les pilotes de la transcription. La méthode CRISPR/Cas9 met une séquence transactivateur en vertu du règlement endogène d’un gène remplacé et par conséquent facilite transctivator expression exclusivement dans des modèles spatio-temporels de gène-spécifique.

Une stratégie efficace pour générer des systèmes de Transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour générer un modèle de système dans lequel la transcription d’un gène endogène d’intérêt peut être conditionnellement contrôlée dans les animaux vivants ou de cellules à l’aide d’activator, renforcée lac répresseur et tet .

Application in vivo de la système de télécommande pour la Manipulation d’Expression des gènes endogènes

Le contrôle fiable des cellules de mammifères sensibles à la lumière nécessite la normalisation des méthodes optogénétiques. Pour atteindre cet objectif, cette étude décrit un pipeline de construction de circuits géniques, d’ingénierie cellulaire, de fonctionnement de l’équipement optogénétique et de tests de vérification pour normaliser l’étude de l’expression des gènes induite par la lumière en utilisant un circuit génique optogénétique à rétroaction négative comme étude de cas.

Ingénierie et contrôle fiables des circuits génétiques optogénétiques stables dans les cellules de mammifères

Cette étude décrit une méthode pour des expériences à haut débit utilisant un réseau de LED imprimées en 3D pour optimiser l’expression génique inductible par la lumière dans HEK293T cellules.

Optimisation rapide d’un système inductible par la lumière pour contrôler l’expression génique de mammifères

Découvrez comment moduler l'expression des transgènes avec le commutateur génique pEUI(+) et le tebufenozide dans les cellules HEK 293. Cette méthode offre un contrôle précis et réversible de l'activation génique.

Un commutateur gène du singulier axée sur les récepteurs de l’Ecdysone pour délibérée Expression du transgène avec robustesse, réversibilité et perméabilité négligeable (Vidéo) | JoVE Journal

Un commutateur gène du singulier axée sur les récepteurs de l’Ecdysone pour délibérée Expression du transgène avec robustesse, réversibilité et perméabilité négligeable

Explorer plus de vidéos