Name: Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Apprenez la microinjection d'embryons de Diabrotica virgifera virgifera pour la transformation de la lignée germinale et l'édition du génome CRISPR/Cas9. Cette méthode permet d'étudier la biologie de ce ravageur et ses mécanismes de résistance.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une subvention du programme de recherche connaissances Corn Rootworm Monsanto, accorde un numéro AG/1005 (pour le MDL et YC) et fonds d’amorçage au MDL de NCSU. FC a été pris en charge par des subventions du programme de recherche de Monsanto Corn Rootworm connaissances (AG/1005) et la National Science Foundation, accorder numéro MCB-1244772 (au MDL). Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés. FC et MDL conçu et créé les expériences ; FC, PW et SP effectuaient les expériences ; FC et MDL ont analysé les résultats ; et FC, NG et le MDL a écrit le manuscrit. Nous remercions Teresa O'Leary, William Klobasa et Stephanie Gorski pour leur assistance d’experts en dépistage WCR. Nous remercions également m. Wade Français (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) pour des envois d’oeufs d’établir des colonies de laboratoire et en fournissant les protocoles d’élevage.

1. colonie-niveau élevage des adultes de la région des Caraïbes
<ol><li>Obtenir une quantité suffisante d’adultes de la région des Caraïbes (500-1 000) d’un laboratoire de recherche ou entreprise fiable (voir Table des matières pour obtenir un exemple) et les placer dans une cage de 30 cm3 . Remarque : L’utilisation d’une souche non diapause est fortement recommandée.</li>
	<li>Préparer l’alimentation artificielle WCR, suivant le protocole du fabricant et versez une couche de 1 cm d’épaisseur dans un récipient de 38 oz (voir Table des matières). Après avoir mélangé, stocker nourriture inutilisée, à 4 ° C pendant 2 mois.</li>
	<li>Mettre une boîte de Pétri (100 x 15 mm) avec alimentation adulte (10-15 g) dans une cage de 30 cm3 . Ajouter l’alimentation plus lorsque la nourriture est faible ou sec.</li>
	<li>Mettre un ballon (300 mL) avec de l’eau, recouvert d’une boule de coton, qui sert à maintenir en place un rouleau de coton (6 "x 3/8"), pour servir comme une source d’eau. Changez l’eau quand elle s’épuise.</li>
	<li>A 14:10 lumière cycle un insecte incubateur d’élevage et de maintenir WCR à 26 ° C avec une humidité de 60 %.</li>
</ol>2. l’alignement et la collecte des embryons
<ol><li>Faire une couveuse de collection à l’aide de 1 % d’agar dans de l’eau dans un stérile 100 x 15 mm2 boîte de Pétri. Conserver à 4 ° C après que l’agar se solidifie.</li>
	<li>Pour ramasser les œufs nouvellement posées, placer une seule couche de papier filtre, suivie de 4 couches d’étamine (chaque coupe à la taille) sur la surface de la gélose (Figure 1 a). NOTE : Étamine peut être réutilisé, après avoir été lavé à l’eau de Javel et stérilisés à l’autoclave, mais il n’est pas nécessaire de procéder à la première utilisation. Papier filtre ne doivent pas être réutilisé et ne doit pas être stérilisé.</li>
	<li>Placer les oeuf collection plaque en cage WCR plus tard dans la journée que possible (fin de journée de travail) et couvrir d’une tente de feuille d’étain. Laisser une nuit. Remarque : Avoir les lumières de 10:00 à 12 h 00 (14 h) retards de Ponte, ce qui facilite la collecte des oeufs plus jeunes pour microinjection sans exiger du personnel de laboratoire d’y placer la chambre de collection cage tard dans la nuit.</li>
	<li>Supprimer la couveuse de collection autour de 8 ou de 09:00</li>
	<li>Utiliser forceps pour ramasser 1 couche de gaze en temps et lieu dans un bécher (500 mL) d’eau. Laver les œufs hors de fromage en remuant doucement (Figure 1 b et 1c).</li>
	<li>Utiliser une pipette de l’ampoule pour transférer les oeufs dans un autre bécher (500 mL) d’eau. Répéter 2-3 x pour nettoyer les oeufs.</li>
	<li>Utilisez la pipette de l’ampoule pour transférer des oeufs sur papier filtre (Figure 1) tout en minimisant le montant du report de l’eau.</li>
	<li>Couper le papier filtre noir en lanières larges comme une lame de verre et de la bande fermement sur la diapositive pour s’assurer que le document repose à plat (Figure 2 a). NOTE : Papier filtre noir permet d’améliorer la visibilité sous le microscope en réduisant la quantité de lumière réfléchie.</li>
	<li>Appliquez de la colle non toxique (voir Table des matières pour obtenir un exemple) pour le papier filtre dans les ridules (Figure 2 b). Garder les lignes de colle plus mince que le diamètre d’un ovule afin d’éviter les œufs recouvert de colle.</li>
	<li>Utilisez un pinceau fin pour déplacer doucement les oeufs WCR un de leur papier de filtre à la ligne de colle. Essayez du pondre sur la colle avant il se dessèche et garder distance au moins un œuf entre chaque oeuf.</li>
	<li>Maximiser l’efficacité de l’injection en plaçant plusieurs lignes d’oeufs sur un papier filtre diapositive (Figure 3).</li>
	<li>Une fois tous les oeufs sont disposés sur le papier filtre, attendez jusqu'à ce que toute la colle sèche avant microinjection. Remarque : Pour transformation de la lignée germinale et génome CRISPR/Cas9-mediated édition, injecter tous les embryons avant midi (12:00) afin que le plus ancien embryon est vieux de pas plus de 19 h. Toutefois, pour RNAi, il n’y a aucun délai de prescription parce que, dans la région des Caraïbes, dsRNA peut se déplacer entre les cellules. En fait, pour RNAi, meilleurs taux de survie peuvent entraîner des embryons de vieillissement.</li>
</ol>3. préparation du plasmide DNAs et aiguilles d’Injection
<ol><li>Préparer l’ADN de plasmide surenroulé haute qualité à l’aide d’une endotoxine-free FM commerciale nécessaire (voir la Table des matières pour obtenir un exemple).</li>
	<li>Pour préparer la solution injectable, vérifier la concentration de chaque plasmide et ensuite combiner plasmides d’assistance (concentration finale de 250 ng/µL), plasmide donneur (concentration finale de 750 ng/µL) et tampon rouge de phénol (concentration finale de 20 %). Vortex la solution brièvement et centrifuger pendant 3 min à la vitesse maximale à précipiter les particules qui peuvent boucher l’aiguille.</li>
	<li>Tirez sur les aiguilles de verre borosilicate (D.I. 0,58 mm, longueur 10 cm, 1 mm de diamètre extérieur) à l’aide d’un extracteur de micropipette de type Flaming/Brown. Pour le stockage, fixer les aiguilles a tiré sur la bande adhésive double-face dans une boîte de Pétri ou autre contenant transparent. Remarque : Pour le système d’extracteur de micropipette, les paramètres utilisés ont été : chaleur = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Remblayez l’aiguille d’injection à l’aide d’un micro-chargeur Astuce (voir Table des matières) pour pipette 0,5 - 1,0 µL vers le bas à l’intérieur de l’aiguille, près de l’extrémité effilée. Enlever les bulles de la pointe de l’aiguille si un quelconque se produit.</li>
	<li>Insérer l’aiguille d’injection dans le porte aiguille.</li>
	<li>Ouvrir la pointe de l’aiguille en coupant délicatement avec une belle paire de pinces, doucement toucher/glisser la pointe sur la lame de verre ou de la lamelle couvre-objet. Remarque : L’objectif est d’avoir l’ouverture plus petite qui permet encore le mélange de l’injection de sortir (petites ouvertures exigent généralement la pression d’injection plus élevée). Biseauté aiguilles ne nécessitent pas cette étape car ils sont déjà ouverts.</li>
</ol>4. la microinjection et soins après l’injection
<ol><li>À l’aide d’un pinceau fin, soigneusement mouiller la surface de 1 à 3 oeufs à l’eau stérile, introduire l’aiguille et injecter la solution. Injecter chaque œuf avant que la surface ne sèche. Vous recherchez l’apparence une petite quantité de couleur rouge à l’intérieur des oeufs pendant l’injection pour indiquer la microinjection réussie. Écraser ou supprimer des œufs qui semblent endommagés, vide, ou dans le cas contraire, ne peut pas être injectés. Remarque : Bien que la pression d’injection varie en fonction de l’aiguille perce, 10-13 psi est un bon point de départ.</li>
	<li>Après que tous les oeufs sont injectés, retirez le papier filtre la lame de verre.</li>
	<li>Placer le filtre en papier sur la surface d’un plat de 1 % d’agar (décrit ci-dessus).</li>
	<li>Film plastique paraffine permet de sceller le plat et mettre dans un insecte de 26 ° C, incubateur d’élevage pendant 12 jours. NOTE : Le film de paraffine afin de prévenir la contamination croisée des moisissures entre les plats. Cependant, tout autre traitement pour empêcher la croissance bactérienne pourrait réduire la survie des embryons injectées.</li>
</ol>5. mise en culture et l’éclosion des embryons
<ol><li>Commencez à regarder les embryons 12 jours après l’injection pour les larves nouvellement écloses et continuer tous les jours pendant les 2 prochaines semaines.</li>
	<li>Le transfert de larves, à l’aide d’une brosse fine, à une boîte d’élevage avec maïs germé et le sol. NOTE : Moule peut s’étendre dans le plat d’agar, mais les larves écloront encore dans la plupart des cas. Recherchez les larves délicatement dans le moule pour les attraper tous. Certaines larves peuvent déplacer dans le couvercle du plat et pourraient se coincer dans la condensation.</li>
	<li>Arrière des larves à 26 ° C, suivant la norme WCR élevage méthodes25.</li>
</ol>

<ol><li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm%3A+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li>
<li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629(2011).</li>
<li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19991107592">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li>
<li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="https://digitalcommons.unl.edu/entomologyfacpub/87/">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li>
<li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoselle%2C+R+%22Annual+report+for+1959%2C+cooperative+extension+work+in+entomology%22">Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology</a>. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).</li>
<li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).</li>
<li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li>
<li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li>
<li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162(2010).</li>
<li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li>
<li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li>
<li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li>
<li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li>
<li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li>
<li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breakage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li>
<li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction%3A+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/81/1/410/935020">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li>
<li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li>
<li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li>
<li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+marker+for+transgenic+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li>
<li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1570-7458.1976.tb02591.x/abstract">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li>
<li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium+embryogenesis%3A+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+transgenesis%3A+methods+and+applications%22">Insect transgenesis: methods and applications</a>. , CRC Press. (2000).</li>
<li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor%2Fhelper+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li>
<li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11(2007).</li>
<li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgene-based%2C+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Même si la microinjection de WCR avec ARN doubles brins aux fins de l’ARNi a été signalé9, il s’agit du premier protocole à établir des pratiques exemplaires pour microinjecting precellular embryons WCR, un processus essentiel pour mener la transformation de la lignée germinale et/ou CRISPR/Cas9 génome de montage chez cette espèce. Microinjection réussie d’embryons WCR est tributaire de nombreux facteurs, comme c’est l’efficacité de la transformation. Ci-dessous sont quelques-unes des principales ...

La chrysomèle du maïs (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, est un important ravageur du maïs1. Fait intéressant, WCR semble surmonter contrôle mesure plus rapidement que les parasites agricoles plus car ils ont non seulement s’adapter physiologiquement, mais aussi sur le plan comportemental2,3,4,5, 6. au cours de la dernière décennie, l’interférence ARN (ARNi), un outil puissant de la génomique fonctionnel, a été étudiée comme une méthode de contrôle possibles pour WCR7,8et a également été utilisé comme un moyen pour étudier les gènes fonction9. Cependant, alors que l’ARNi est fréquemment effectuée par microinjection d’ARN double brin (dsRNA) chez d’autres espèces, Arni axée sur l’injection est rare dans la région des Caraïbes. En fait, il y a seulement quelques rapports d’Arni par microinjection d’ARNdb dans WCR9. La raison en est que WCR peut atteindre des hauts niveaux de gène knockdown par ingestion de dsRNA7,10, permettant même l’étude des effets embryonnaires en se nourrissant de dsRNA à la mère de11. Tandis que cette méthode rend WCR un excellent sujet pour l’analyse génomique fonctionnelle par Arni, il a ralenti le progrès sur l’élaboration de méthodologies pour la microinjection embryonnaire chez cette espèce.
Malgré la puissance de l’ARNi, il y a quelques inconvénients. Par exemple, pas de tous les gènes répondent également à Arni. Cette variabilité peut faire interpréter les résultats d’un essai de génomique fonctionnelle plus difficile. En outre, Arni est transitoire et ne génère pas de mutations héréditaires. En revanche, la transformation de cellules germinales, un autre outil génomique fonctionnelle, peut générer des mutations héréditaires par insertion d’un élément transposable marqué dans le génome12,13. Cela rend la transformation de la lignée germinale un excellent outil pour la création de souches mutantes pour utilisation dans les études génétiques à long terme. Transformation peut également être utilisée pour secourir une mutation en remettant une copie fonctionnelle du gène d’un génome mutant14. En outre, la transformation de la lignée germinale est la pierre angulaire d’une grande variété de techniques de génétique moléculaire. En plus assommant et/ou la fonction du gène de sauvetage, transformation de la lignée germinale peut être utilisée pour enhancer piégeage15, gène piégeage16, axée sur la famille Gal4 l’expression ectopique17et pangénomique mutagénèse18.
Plus récemment, des outils qui permettent le montage sophistiqué du génome ont été développés. Ces outils comprennent la Transcription Activator-Like effecteur nucléases (TALEN) et les CRISPR/Cas9-nucléase système19,20. L’avantage de ces nouveaux outils est qu’ils offrent aux chercheurs la capacité d’induire une rupture d’ADN double-brin à presque n’importe quel endroit dans presque n’importe quel génome. Une fois que l’induit, ces pauses peuvent être réparés par le biais de deux extrémités non homologue rejoindre, qui peuvent introduire des suppressions ou insertions dans le gène ciblé, ou réparation axés sur l’homologie, qui, en présence d’une construction machinée, peut catalyser la remplacement de gènes ensemble ou régions génétiques21,22. Cependant, ces méthodes nécessitent microinjection de DNA, RNA et/ou de protéine dans des embryons de très jeunes.
Ce qui est important, contrairement à l’ARN doubles brins utilisé pour Arni, les acides nucléiques et les protéines utilisées pour la lignée germinale transformation et la modification du génome ne peut pas franchir facilement les membranes cellulaires. Par conséquent, microinjection de plasmide DNAs, ARNm et/ou protéines doit avoir lieu pendant l’étape du blastoderme syncytial (c'est-à-dire avant que l’embryon insecte cellularizes). Ce qui rend le moment des injections un facteur critique. Par exemple, chez Drosophila melanogaster, embryons doivent être injectés dans les deux heures après que les oeufs poser12. Par conséquent, élaboration d’un protocole de microinjection embryonnaires réussie pour la région des Caraïbes doit tenir compte les meilleures conditions pour la pose d’ovule de la femme, ainsi que la meilleure méthode pour recueillir des quantités suffisantes d’embryons precellular.
Un effort pour apporter un large éventail d’outils génétiques moléculaires sur la biologie de la WCR exige l’élaboration de méthodes de collecte et de microinjecting precellular embryons WCR. Ici, nous fournissons des instructions détaillées, ainsi que des trucs et astuces, pour aider les autres à utiliser des techniques axées sur la transformation dans la recherche de la région des Caraïbes. En plus d’étendre des technologies transgéniques à WCR devant servir à des études de génomique fonctionnelles, ces techniques permettent aussi puissant nouvelles stratégies de contrôle de ravageurs comme gène lecteur23,24 à tester dans ce économiquement important lutte antiparasitaire.

<table><tbody><tr><td>Papier filtre qualitatif (noir)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>Pour micro-injection d’œufs</td></tr><tr><td>Contenants de 1 oz&nbsp ;</td><td>Anny’s Vaisselle en plastique</td><td>ASET101</td><td>Récipient à œufs</td></tr><tr><td>Gélose Drosophile Type II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Substrat pour plat de ponte WCR</td></tr><tr><td>Pince poids plume&nbsp ;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Manipulation des larves et des nymphes</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Laver le maïs et la vaisselle</td></tr><tr><td>Trucker’s Favorite Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Maïs pour l’alimentation Système</td></tr> de <tr><td>micro-injection WCR (fait maison)</td><td>NA</td><td>Pièces et instructions disponibles sur demande</td><td>Contrôle la pression d’injection (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Colle non toxique Elmer’s</td><td>Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Coller des œufs sur du papier filtre</td></tr><tr><td>epTIPS Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Remplissage des aiguilles</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Maïs germé /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp ; Cercles de papier filtre de qualité quantitative</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Fabrication d’une gélose pour la ponte d’œufs/9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Laver la vaisselle</td></tr><tr><td>Lames de microscope ordinaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Maintien du papier filtre et des œufs pour micro-injection</td></tr><tr><td>Chrysomèle des racines du maïs de l’Ouest sans substitut de pollen</td><td>Frontier Agricultural Sciences&nbsp ;</td><td>F9766B</td><td>WCR régime artificiel adulte</td></tr><tr><td>Boules de coton, Grand</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Fermer la fiole</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL Pipettes de transfert à petite ampoule</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Collecter et transférer des œufs</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Stéréomicroscope à fluorescence&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp ;</td><td>Dépistage du BFR</td></tr><tr><td>DsRed Set de filtres pour stéréomicroscope à fluorescence</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Filtre d’excitation : 510-560 nm, filtre d’émission : 590-650 nm</td></tr><tr><td>Filtre EGFP</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Filtre d’excitation : 440&ndash ; 520 nm, filtre anti-émissions : 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Cage pour colonie adulte</td></tr><tr><td>Pinceau miniature</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micromanipulateur à manette</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Micromanipulateur et porte-aiguille</td></tr><tr><td>Microscope Platine XY Platine</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Scène de microscope (adaptée pour une utilisation avec stéréoscope)</td></tr><tr><td>Grade 90 Cheesecloth</td><td>Online Fabric Store</td><td>CHEE90</td><td>Pour la ponte</td></tr><tr><td>Film de paraffine en plastique&nbsp ;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>Sceller la guérisse après microinjection/Rouleau 4 po x 125 pi</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Percival Percival&nbsp ;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR chambre de culture (incubateur d’élevage d’insectes)</td></tr><tr><td>Erlenmeyer à bouche étroite Flacons</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Réservoir d’eau pour colonie d’adultes&nbsp ;</td></tr><tr><td>Griffin Low Form Beakers</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>Pour la dorure à l’œuf</td></tr><tr><td>Rouleaux de coton tressé</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Utilisation dans l’approvisionnement en eau d’une colonie d’adultes</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>Pour plaques diététiques</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Tampon de micro-injection</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipiette à base laser</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-2000/G</td><td>Extracteur d’aiguille/Chaleur = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Couche arable</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Sol pour la culture</td></tr> <tr><td>du cronReloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Sac de gélose après microinjection/5x7</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Fabrication de gélose pour la ponte d’œufs/ 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR chambre d’accouplement à paire unique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Conteneurs de 38 oz</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Boîte d’élevage de larves/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Conteneur de charcuterie en plastique translucide micro-ondable</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Boîte d’élevage de larves/16 oz</td></tr><tr><td>Portée de micro-injection&nbsp ;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Lunette de micro-injection équipée d’une platine XY</td></tr><tr><td>Standard Capillaires en verre</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Aiguilles de micro-injection</td></tr><tr><td>Chrysomèles adultes du maïs occidental Recherche</td> aérospatiale <td>centrale nord Laboratoire</td><td>Souche non diapase</td><td>Demande du laboratoire du Dr Bryan Wade French</td></tr><tr><td>Kit Midi ADN plasmidique</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Purification d’ADN plasmidique prêt à l’injection</td></tr></tbody></table>

microinjection de western chrysomèle des racines du maïs, diabrotica virgifera virgifera, embryons de transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome crispr/cas9

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

La chrysomèle des racines du maïs (BFR) est un important ravageur du maïs et est bien connu pour sa capacité à s’adapter rapidement aux stratégies de lutte antiparasitaire. Bien que l’interférence ARN (ARNi) s’est avéré pour être un outil puissant pour étudier la biologie de la région des Caraïbes, il a ses limites. Plus précisément, Arni elle-même est transitoire (c'est-à-dire n’entraîne pas une hérédité mendélienne à long terme du phénotype associé), et il exige la connaissance de la séquence d’ADN du gène cible. Ce dernier peut être limitant si le phénotype d’intérêt est contrôlé par des gènes mal conservés, ou encore roman, parce que l’identification des cibles utiles serait difficile, voire impossible. Par conséquent, le nombre d’outils dans la boîte à outils génomique de WCR devrait être élargi par le développement de méthodes qui pourraient être utilisés pour créer des souches mutantes stables et activer les sondages indépendants de séquence du génome du BFR. Dans les présentes, nous détaillons les méthodes utilisées pour recueillir et microinject des embryons de WCR precellular avec les acides nucléiques. Alors que les protocoles décrits dans les présentes visent à la création de WCR transgénique, CRISPR/Cas9-génome réaliser un montage pourrait aussi en utilisant les mêmes protocoles, avec la seule différence étant la composition de la solution injectée dans les embryons.

Une considération importante lors de l’élaboration de ce protocole était le stade de développement embryonnaire à l’époque de microinjection. Transformation de la lignée germinale exige expressément, microinjection d’ADN avant cellularisation embryonnaire. C’est parce que l’ADN ne peut facilement traverser les membranes cellulaires. Tentatives pour visualiser les étapes du développement embryonnaire de BFR en utilisant un colorant nucléaire ont échoué parce que les dechorionation d’embryo...

Nous présentons ici des protocoles pour la collecte et microinjecting maïs precellular embryons de la chrysomèle des racines du afin d’effectuer des analyses génomiques fonctionnelles telles que la transformation de la lignée germinale et CRISPR/Cas9-génome édition.

Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

L’objectif global de ce protocole de micro-injection est de modifier le génome de la chrysomèle des racines du maïs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la biologie de la chrysomèle des racines du maïs occidental et sa capacité à surmonter rapidement les méthodes de lutte antiparasitaire telles que la toxine BT et le RANI. Outre les chrysomèles des racines du maïs de l’Ouest, cette méthode peut également être appliquée à des espèces similaires, telles que les chrysomèles des racines du sud et du nord.J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsqu’on m’a demandé d’aider avec la RANI basée sur l’injection chez la chrysomèle des racines du maïs occidental dans les années 90. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal. Parce que l’élevage de chrysomèles des racines du maïs de l’Ouest en laboratoire demande beaucoup de main-d’œuvre.Et les taux de survie restent faibles avec la technologie actuelle. Obtenez entre 500 et 1 000 adultes de chrysomèles non diapauses auprès d’une entreprise ou d’un laboratoire de recherche fiable. Et les loger dans des cages de 30 centimètres cubes.Conservez le régime artificiel standard contre la chrysomèle des racines dans des récipients de stockage des aliments d’environ un centimètre de profondeur. Les aliments non utilisés peuvent être conservés à quatre degrés Celsius jusqu’à deux mois. Pour nourrir la chrysomèle, chargez des boîtes de Pétri de 100 centimètres avec 10 à 15 grammes de nourriture.Chargez un plat de nourriture dans chaque cage de chrysomèle. Et reconstituez-le lorsque les réserves s’épuisent ou que le régime s’assèche. Gardez également un réservoir d’eau de 300 millilitres, recouvert d’une boule de coton, dans chaque cage pour servir de source d’eau.Changez l’eau lorsqu’elle est basse. Maintenez la chrysomèle des racines en cage à 26 degrés Celsius avec 60 % d’humidité et un cycle de lumière de 14/10 dans un incubateur d’élevage d’insectes. Éteignez les lumières plus tard dans la journée, par exemple à minuit, afin que les œufs soient pondus avant les heures de travail du matin.Tout d’abord, collectez les embryons. Pour une surface de collecte d’œufs, chargez une boîte de Pétri de 100 millimètres avec 30 millilitres de gélose à 1 % et de l’eau. Ensuite, placez une seule couche de papier filtre sur l’agar, suivie de quatre couches d’étamine.Chaque couche doit être coupée à la bonne taille. Ensuite, le plus tard possible dans la journée, placez la plaque de collecte des œufs dans la cage à racines et couvrez-la d’une tente en papier d’aluminium. Puis, le lendemain matin, retirez la chambre de collecte des œufs.À l’aide d’une pince, prélevez une couche d’étamine à la fois et placez-la dans un bécher de 500 millilitres rempli d’eau. Lavez les œufs de l’étamine en les remuant dans l’eau. Ensuite, à l’aide d’une pipette à bulbe, transférez les œufs dans un autre bécher d’eau comme étape de lavage.Effectuez deux ou trois lavages de cette manière. Ensuite, déposez les œufs nettoyés sur du papier filtre avec le moins d’eau possible. Ensuite, préparez une diapositive en collant un morceau de papier filtre noir à plat sur la diapositive pour améliorer le contraste.Ensuite, versez de fines lignes de colle non toxique sur le papier qui sera utilisé pour fixer les œufs. Gardez la colle sous la circonférence d’un œuf. Pendant que la colle est humide, utilisez un pinceau fin pour placer les œufs sur la ligne de colle.Gardez au moins une distance d’un œuf entre chaque œuf. Préparez plusieurs rangées d’œufs par lame. Les ovules doivent maintenant être injectés dans les 30 minutes.Maintenant, combinez le plasmide auxiliaire, le plasmide donneur et le tampon rouge de phénol. Utilisez des plasmides super enroulés de haute qualité, fabriqués avec un kit commercial sans endotoxines. Fortex brièvement pour mélanger.Ensuite, faites tourner les particules pendant trois minutes à la vitesse maximale. Ensuite, le remblayage a tiré des aiguilles en verre borosilicaté avec 0,5 à 1 microlitre de solution d’injection. Si des bulles se forment, assurez-vous de les enlever.Ensuite, fixez l’aiguille d’injection au micromanipulateur. Maintenant, si nécessaire, au microscope, cassez doucement la pointe de l’aiguille scellée à l’aide d’une paire de pinces fines ou en touchant doucement la pointe dans une barrière de verre. Essayez de faire la plus petite ouverture possible qui libère la solution d’injection.Avant d’injecter les œufs de chrysomèles, utilisez un pinceau fin pour mouiller soigneusement la surface d’un à trois œufs préparés avec de l’eau stérile. Ensuite, injectez les embryons mouillés. Insérez doucement l’aiguille au milieu de l’embryon et injectez un petit volume de solution.Commencez par utiliser une pression de 10 à 13 psi et ajustez la pression au besoin. Les embryons secs ont une forme ronde distincte, en prémouillant chaque embryon avec de l’eau, ils changeront de forme et ramolliront la coquille de l’œuf, permettant ainsi à l’aiguille de pénétrer facilement. Un embryon injecté avec succès aura une petite quantité de couleur rouge.Si un œuf a été endommagé, a l’air étrange ou ne peut pas être injecté, écrasez-le ou retirez-le de la lame. Une fois tous les œufs injectés, déplacez le papier filtre contenant les œufs dans une assiette à 1 % de gélose. Ensuite, scellez le plat avec un film de paraffine et incubez-le à 26 degrés Celsius jusqu’à ce que les larves éclosent.12 jours après l’injection, commencez à vérifier la présence de larves tous les jours pendant les deux prochaines semaines. Transférez les larves à l’aide d’une brosse fine dans une boîte d’élevage avec du maïs germé et de la terre pour les élever dans des conditions standard. La transformation germinale de la chrysomèle des racines a été tentée en co-injectant un plasmide porteur de transposase avec un plasmide porteur de transposon dans des embryons précellulaires.Chez les 26 survivants, chaque expression EFP a été utilisée pour dépister l’insertion d’éléments donneurs. Bien que des descendants thoracents aient été identifiés, le criblage d’embryons de chrysomèles avec une source de lumière intense s’est avéré mortel. Le cycle suivant de transformation germinale a utilisé un gène de protéine fluorescente rouge piloté par un promoteur constitutivement actif de Drosophila melanogaster.Les taux de survie se sont améliorés, mais une seule larve SD rouge positive a été enregistrée. Ensuite, les embryons ont été micro-injectés avec un tampon seul ou avec des plasmides d’ADN de donneur aidants et marqués thorescentements. Un ratio similaire d’embryons éclos lorsqu’ils sont injectés avec des plasmides ou un tampon seul.Et il est intéressant de noter que seulement environ la moitié des embryons non injectés ont éclos. Cela a mis la létalité de la manipulation des embryons pour l’injection aussi élevée que la réalisation de l’injection. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de micro-injecter des embryons de maïs occidental.Une fois maîtrisés, deux à trois cents embryons peuvent être injectés par heure en utilisant cette technique. Cette méthode est redevable aux techniques développées pour la transformation germinale de Drosophila melanogaster qui servent de modèles applicables à de nombreuses autres espèces. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’édition du génome basée sur CRISPR/Cas9 peuvent être effectuées pour effectuer des mutations ciblées dans le génome du Western Corn Rootwall.Afin de répondre à des questions spécifiques sur la fonction du génome.

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Cette vidéo décrit la microinjection, une méthode courante de création de souches transgéniques de C. elegans. Dans l’exemple, nous verrons la micro-injection utilisée pour introduire un complexe ribonucléoprotéique (RNP) pour l’édition de gènes basés sur CRISPR.

Microinjection de gonades : une méthode d’administration de composés directement dans la lignée germinale de C. elegans

La mouche méditerranéenne des fruits (medfly) Ceratitis capitata (Diptera : Tephritidae) est un ravageur mondial de l’agriculture. Une meilleure compréhension de sa biologie est essentielle pour contrôler les populations de mouches et ainsi réduire l’impact économique. La micro-injection embryonnaire est un outil fondamental permettant à la fois la transformation de la lignée germinale et l’étude de la génétique inverse chez cette espèce.

Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Microinjection d’embryons Nasonia vitripennis est un procédé essentiel pour générer des modifications héréditaires génome. Décrite ici est une procédure détaillée pour la microinjection et la transplantation d’embryons Nasonia vitripennis , ce qui facilitera grandement la manipulation du génome futur chez cet organisme.

Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome Nasonia vitripennis

Ce protocole décrit les procédures de micro-injection pour les embryons de Culex quinquefasciatus qui sont optimisées pour fonctionner avec les outils d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Cette technique peut générer efficacement des mutations germinales héréditaires spécifiques au site qui peuvent être utilisées pour construire des technologies génétiques dans ce vecteur de maladie peu étudié.

Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.

Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica

Ici, nous décrivons les méthodes d’injections pupales et adultes efficaces dans Nasonia vitripennis comme des alternatives accessibles à la microinjection embryonnaire, permettant l’analyse fonctionnelle des gènes d’intérêt en utilisant soit le silence de l’ARN via l’interférence ARN (ARNi), soit l’élimination du gène via l’édition du génome CRISPR / Cas9.

Injections de nymphes et d’adultes pour l’arNi et l’édition de gènes CRISPR chez Nasonia vitripennis

Ce protocole détaille les étapes de la mutagenèse ciblée CRISPR/Cas9 chez les mouches du sable : collecte d’embryons, injection, élevage et identification d’insectes ainsi que sélection de mutations d’intérêt.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjection embryonnaire pour CRISPR/Cas9 Mutagenesis

De nombreuses caractéristiques de l’eusocialité des insectes reposent sur la communication au sein de la colonie et la division du travail. La manipulation génétique des gènes régulateurs clés dans les embryons de fourmis par micro-injection et mutagénèse médiée par CRISPR donne un aperçu de la nature du comportement altruiste chez les insectes eusociaux.

Injections d’embryons pour la mutagenèse médiée par CRISPR dans le saltateur Harpegnathos de fourmi

Présenté ici est un protocole de micro-injection d’embryon Helicoverpa armigera (Hübner) et d’identification de mutant knockout créé par l’édition du génome CRISPR / Cas9. Les insectes mutants permettent de poursuivre les recherches sur la fonction des gènes et l’interaction entre différents gènes in vivo.

Microinjection embryonnaire et identification des mutants Knockout de l’Helicoverpa Armigera éditée par le génome CRISPR/Cas9 (Hübner)

Voici des protocoles pour la collecte et la microinjection d’embryons de cicadelles de maïs précellulaires dans le but de modifier leur génome via l’édition du génome basée sur CRISPR / Cas9 ou pour l’ajout d’éléments transposables marqués par transformation germinale.

Microinjection de cicadelle de maïs, Peregrinus maidis, embryons pour l’édition du génome CRISPR / Cas9

Cet article démontre l’ingénierie du génome médiée par CRISPR-Cas9 chez Steinernema hermaphroditum, un nématode entomopathogène (EPN : parasite insecte) et un modèle génétique émergent. La technologie décrite est utile pour créer des mutants, permettant d’élucider les fonctions géniques en biologie des nématodes pertinentes pour la symbiose mutualiste et parasitaire.

Mutagenèse basée sur CRISPR-Cas9 dans le nématode entomopathogène Steinernema hermaphroditum et le maintien des lignées mutantes

Apprenez la microinjection d'embryons de Diabrotica virgifera virgifera pour la transformation de la lignée germinale et l'édition du génome CRISPR/Cas9. Cette méthode permet d'étudier la biologie de ce ravageur et ses mécanismes de résistance.

Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9 (Vidéo) | JoVE Journal

Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9

Explorer plus de vidéos