Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

L’objectif global de cette mutagenèse aléatoire est de dépister les mutations qui déstabilisent l’hétérochromatine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hétérochromatine, telles que les facteurs qui régulent la formation et le maintien de l’hétérochromatine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut cibler spécifiquement un gène souhaité pour la mutagénèse, même si le gène est essentiel.

Pour commencer, préparez l’extrait de levure avec des suppléments, ou OUI, sans adénine, le milieu de glutamate Pombe, ou PMG, et le PMG sans adénine, en mélangeant les composants comme indiqué dans ce tableau. Après l’autoclave et l’ajout de G418 si nécessaire, remuez le milieu pendant encore cinq à dix minutes. Ensuite, aliquote le milieu dans des boîtes de Pétri de 90 millilitres et conservez les plaques à quatre degrés Celsius.

À l’aide du rpt4 positif cloné, avec ses cinq UTR premiers et ses trois premiers UTR et sa mutation silencieuse, ainsi que les amorces p5 et p6 et une polymérase spéciale, conçue pour générer un taux d’erreur élevé, effectuez une PCR sujette aux erreurs dans un volume total de 50 microlitres. Après avoir généré une construction de transformation-fusion, selon le protocole de texte, inoculez dix millilitres de milieu YES avec de la levure et incubez-le pendant plus de 16 heures jusqu’à saturation. Utilisez 200 millilitres de milieu YES pour diluer les cellules à une DO 600 de 0,2 et incubez la culture à 30 degrés Celsius en agitant pendant cinq à six heures jusqu’à une DO 600 de 0,6 à 0,8.

Calculez le volume des cellules dont la somme est égale à OD600 de 30. Ensuite, distribuez les cellules dans quatre tubes coniques de 50 millilitres et refroidissez-les sur de la glace pendant 10 minutes. Récoltez les cellules par centrifugation à 1050 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Ensuite, placez les tubes microfuges avec la cassette d’ADN et 10 cuvettes électro sur de la glace. Pendant qu’il est encore sur de la glace, jetez le surnageant et ajoutez 15 millilitres de sorbitol à 1,2 molaire, secouez doucement les tubes pour remettre les cellules en suspension, puis centrifugez les cellules à 1050 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Jetez le surnageant et effectuez un deuxième lavage au sorbitol.

Après la centrifugation, jeter le surnageant. Ensuite, remettez les cellules en suspension et rassemblez-les toutes dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 1,2 molaire de sorbitol jusqu’à 2,4 millilitres.

Gardez le tube de cellules sur de la glace. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de cellules suspendues au sorbitol dans un tube contenant la construction de la PCR de fusion, mélangez bien et transférez l’échantillon dans une cuvette électrique. Il est important de ne pas utiliser une quantité excessive de cassette PCR, car cela donnerait des erreurs de décharge.

Électroporez les cellules à l’aide des options suivantes : ajoutez 600 microlitres de sorbitol 1,2 molaire dans chaque cuvette électrique pour un volume total de 800 microlitres. Ensuite, répartissez les cellules sur quatre plaques YES. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 24 heures.

Ensuite, effectuez une réplique du placage sur YES plus G418 avant d’incuber les plaques pendant trois jours supplémentaires. Pour chaque plaque YES plus G418, effectuez une réplique du placage à YES sans adénine et PMG sans plaques d’adénine. Incuber les répliques des plaques à 30 degrés Celsius pendant un à deux jours jusqu’à ce que certaines des colonies sur les plaques YES sans adénine présentent une coloration blanche.

Comparez OUI sans adénine et PMG sans plaques d’adénine et sélectionnez des cellules qui apparaissent en rose ou en blanc sur la plaque OUI sans adénine, et qui se développent également sur la plaque PMG sans adénine. Ne sélectionnez pas de colonies sans croissance sur PMG sans adénine, car ce sont des faux positifs. Choisissez chaque colonie et ajoutez-la à 10 microlitres de solution SPZ contenant 2,5 milligrammes par millilitre de zymolyase 100T.

Ensuite, incubez les colonies à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Après l’incubation, utilisez un microlitre de cette solution comme modèle de départ pour la PCR de la colonie. Après avoir digéré les colonies sélectionnées et effectué l’électrophorèse sur gel conformément au protocole textuel, marquez les colonies dont les produits PCR ont été coupés par XHO1 et patchez-les sur les plaques YES plus G418.

Suite à l’isolement de l’ADNg à partir de cellules de levure à fission, et au séquençage des produits PCR selon le protocole texte, comparer la séquence obtenue avec la séquence de type sauvage pour identifier les mutations. Une fois que les mutations sont réintroduites dans les cellules de type sauvage, utilisez le spotting pour confirmer le phénotype dans les cellules mutantes nouvellement fabriquées. Les mutants rpt4 générés à l’aide du protocole démontré dans cette vidéo peuvent être analysés en évaluant les couleurs des colonies.

Comme le montre cette figure, les colonies ont été repérées sur les plaques correspondantes en diminuant le nombre de cellules. Le rapporteur d’adénine inséré dans la région de l’hétérochromatine est réduit au silence dans les cellules de type sauvage et produit des colonies rouges sur YES sans plaques d’adénine. Une fois que l’hétérochromatine est déstabilisée et que le rapporteur d’adénine est exprimé, des colonies blanches peuvent être observées sur le OUI sans plaques d’adénine comme on le voit avec le mutant clr4-delta.

Les mutants rpt4 criblés sont, comme le montre, le mutant rpt4-1 présentant la déstabilisation de l’hétérochromatine la plus sévère. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines pour obtenir les mutants souhaités. Lors de cette procédure, il est important d’éliminer les faux positifs car ils sont plus fréquents que prévu.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la purification des protéines et les tests d’activité enzymatique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la nature des protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des mutants dans un gène cible avec le phénotype souhaité.