Name: Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Découvrez la mutagénèse aléatoire ciblée du gène rpt4+ chez la levure à fission pour identifier des mutations déstabilisant l'hétérochromatine. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes épigénétiques de régulation génique.

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Soutien pour ce projet a été financé par le programme de recherche sciences fondamentales grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science et de la TIC (2016R1A2B2006354).

1. préparation des médias
<ol><li>Préparer extrait de levure avec suppléments (oui), oui sans adénine (Oui faible Ade), Pombe Glutamate moyen (PMG12) et PMG sans adénine (PMG-Ade) en mélangeant les composants tel que décrit dans le tableau 1. Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade ont tous les mêmes composants, mais l’adénine est absent de ce dernier.<ol>
<li>Utiliser le stock de sel (50 x) suivants : 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L de KCl, 2 g/L Na2donc4 dans de l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Utiliser la vitamine suivante (1, 000 x) stock : pantothénate de 1 g/L, 10 g/L d’acide nicotinique, inositol de 10 g/L, biotine de 10 mg/L dans l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Utiliser le minéraux suivant (10, 000 x) stock : 5 g/L d’acide borique, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L d’acide citrique dans l’eau distillée. Filtre à stériliser à l’aide d’un filtre de pores de 0,22 µm et conserver à 4 ° C. NOTE : Milieu Oui liquide est possible en omettant l’agar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stériliser le milieu et refroidir en dessous de 60 ° C en remuant avec une barre de remuer, à raison de 200 tr/min.</li>
	<li>Pour plaques Oui + G418 (G418), ajouter 1 mL/L G418 solution stock au milieu Oui.<ol>
<li>Utilisez le G418 suivants (1, 000 x) stock : 100 mg/mL G418 dans l’eau distillée. Filtre stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 µm pores, aliquot à tubes à centrifuger 1,5 mL et magasin à-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remuez pendant un autre 5-10 min et partie aliquote les médias en Pétri de 90 mm (1 L de moyennes aliquotes à peu près 40 boîtes de Pétri. Stocker les plaques à 4 ° C.</li>
</ol>2. clonage de rpt4 + et ses 5' / 3' UTR
<ol><li>Effectuer des PCR avec des amorces p1 et p2 (Figure 1 a) à l’aide de fission yeast ADN génomique (ADNg) comme le modèle dans un volume total de 50 µL (~ 1 µg ADN, enzymes de U 20, 1 x tampon de réaction), et appliquant les cycles de réaction décrites dans le tableau 2 pour amplifier une base de 3 315 fragment de paires (bp) comprenant rpt4 + et ses 5' / 3' UTR. Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit de purification13 comme indiqué par le fabricant (Figure 1 a).</li>
	<li>Digérer les pBlueScript KS(-) vector14 et le fragment d’ADN amplifié contenant rpt4 + avec ses 5' / 3' UTR avec BamH1 et Xho1 dans un volume total de 20 µL (~ 1 µg d’ADN, 20 U enzyme, 1 tampon de digestion x) à 37 ° C dans un bain d’eau pour les 16-18 h (Figure 1 b).</li>
	<li>Gel de purifier le vecteur digéré (gel d’agarose de 1,2 %) et l’ADN insérer par électrophorèse sur gel d’agarose TAE-basé (100 V, 1 h), exciser les bandes d’ADN de la taille désirée et isoler l’ADN avec un gel extraction kit15.</li>
	<li>Ligaturer le vecteur et l’insert d’ADN à l’aide de T4 DNA ligase en effectuant une réaction de ligature de 20 µL contenant de 50 à 100 ng du vecteur ADN, un ~ 3 fois excès molaire de l’ADN de l’insert, 400 U T4 DNA ligase et 1 x tampon de ligature. Incuber le mélange à 18 ° C pendant 16-18 h.</li>
	<li>Transformer l’ADN ligaturé dans 100 µL d’e. coli DH5α en appliquant un choc thermique pour 70 s à 42 ° C. Ajouter 1 mL de LB et incuber pendant 1 heure à 37 ° C pendant la récupération. Effectuer la centrifugation (13 800 x g), jeter la surnageante, plaque tous les transformé e. coli cellules sur plaques LB-ampicilline (LA) et incuber à 37 ° C pendant 16 h.</li>
	<li>Prélever des colonies de 4-8 avec des cure-dents et cultiver une nuit à 37 ° C dans un milieu 3 mL LA.</li>
	<li>Isoler les plasmides avec un plasmide purification kit16 utilisés selon le protocole du fabricant et effectuez les digestions 5 µl analytique des enzymes de restriction du plasmide isolé, 5 U de chaque enzyme de restriction (BamH1 et Xho1) et 1 x tampon de restriction. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C au bain-marie pendant 3 h. confirmer le clonage en séquençant les plasmides de candidat.</li>
</ol>3. introduction de la Mutation silencieuse (Site de Restriction deXho1 )
<ol><li>Concevoir une paire d’amorces 33-bp (p3 et p4) qui contiennent la mutation souhaitée dans la séquence complémentaire dans le cas contraire.</li>
	<li>Effectuer des PCR avec haute fidélité polymérase17 (Figure 1) dans un volume total de 25 µL (10 ng de plasmide cloné, 2 µL de 10 mix amorce pmol, enzyme de U 2, 1 x tampon de réaction) en utilisant les paramètres répertoriés dans le tableau 3.</li>
	<li>Digérer le plasmide de modèle avec Dpnj’ai dans un volume total de 20 µL (20 enzyme U, 1 x tampon de digestion) à 37 ° C dans une eau de bain pour 1 h.</li>
	<li>Transformer, propager, isoler et séquencer le plasmide contenant la mutation silencieuse, tel que décrit dans les étapes 2,5-2,7. Remarque : La mutation silencieuse peut également être introduite à l’aide d’une méthode de clonage qui permet d’assemblage des fragments d’ADN multiples en une seule réaction18.</li>
</ol>4. aléatoire Mutagenesis of rpt4 + par PCR Erreurs
<ol><li>Effectuer des erreurs PCR, utilisant le plasmide avec la mutation silencieuse (siteXho1 ) comme le modèle, amorces p5 et p6, un volume total de 50 µL (la quantité de modèle défini à l’étape 4.1.1, 2 µL du mélange de primer 10 pmol, 2,5 enzyme U, 1 tampon de réaction de x) , et une polymérase spéciale qui est conçue pour générer une erreur haute débit19 (Figure 1). Apportez PCR comme indiqué dans le tableau 2.<ol>
<li>4-5 µg de plasmide modèle permettent de contrôler la fréquence de mutation de 1 bp/Ko (kilobases). Remarque : Une concentration élevée (> 500 ng/µL) de plasmide, qui peut être obtenu à l’aide d’un kit de mini prep20, est nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Électrophorèse sur gel permet de confirmer un produit PCR de 2670 bp (1,2 % gel d’agarose). Gel de purifier ce produit de la PCR comme indiqué au point 2.5.</li>
</ol>5. préparation de la Fusion des Fragments PCR (KAN, 3' UTR)
<ol><li>Effectuer la PCR à l’aide de pFA6a-KANMX621 comme modèle, amorces p7 et p8, et les conditions énumérées dans le tableau 4 pour obtenir le fragment de marqueur (KAN). Gel de purifier le fragment 1 480-bp qui en résulte comme indiqué au point 2.5 (Figure 1E).<ol>
<li>Vérifiez si le codon du gène ciblé pour la mutation et de la région codante de ses gènes adjacents sont séparés par plus de 500 bp. Le terminateur endogène ne peut servir alors que cette région est inférieur à 500 bp ; plutôt, le terminateur d’ADH doit être utilisé au lieu de la terminaison endogène. Les modifications de protocole requises pour utiliser le terminateur ADH sont présentées au tableau 5. Remarque : Ces modifications ne s’appliquent que lorsque le terminateur de l’ADH , qui est disponible dans le plasmide pFA6a-3 ha-KANMX6, est utilisé à la place le terminateur endogène.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer des PCR avec le cloné rpt4 +-contenant le vecteur comme le modèle et amorces p9 et p10 dans un volume total de 50 µL (20 ng de plasmide cloné, 2 µL de 10 mix amorce pmol, enzyme de U 2, 1 x tampon de réaction), en utilisant les conditions présentées dans le tableau 6. Gel de purifier le fragment d’UTR obtenu 506-bp 3' (Figure 1E).</li>
</ol>6. la génération de la construction de la Transformation de Fusion PCR (Figure 1E)
<ol><li>Préparer les 3 fragments (mutagénisé rpt4 +KAN et la région 3' UTR) à 50 ng/µL.</li>
	<li>Effectuer la fusion que PCR des trois fragments à l’aide d’amorces p11 et p12, tel que décrit dans le tableau 7. (Le protocole de fusion PCR est une modification du protocole original22.) Purifier le principal produit PCR 4 398-bp.<ol>
<li>Utilisez rpt4 +: KAN:3'UTR des fragments à un ratio de 1:3:1 pour des résultats optimaux. Remarque : Le montant total de l’ADN de l’insert ne doit pas dépasser 500 ng. La quantité recommandée de rpt4 +: KAN:3'UTR est 50 ng:150 ng:50 ng. La région de mutagénisé est d’environ 1,6 Ko, donc le nombre de colonies de levures qui rendrait compte de toutes les combinaisons possibles de chaque base étant muté à trois autres minimum est de 1 600 x 3 = 4 800 colonies. Parce qu’une des réactions de transformation entraîne généralement des colonies de 400-500, au moins 10 réactions d’une valeur de fusion PCR construire est nécessaire. Ce besoin peut être vérifiée en augmentant tout simplement la quantité de réaction (c'est-à-dire, le nombre de tubes PCR) par un facteur de dix.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. transformation de levure par électroporation (Figure 1F)
<ol><li>Inoculer levure à 10 mL de milieu Oui à saturation en incubant il pendant plus de 16 h.</li>
	<li>Diluer les cellules à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,2 dans 200 mL de milieu Oui et incuber à 30 ° C sous agitation pendant 5-6 h, à OD600 = 0,6 - 0,8.</li>
	<li>Concentrer les cellules à OD600 = 30, renoncer à quatre tubes coniques de 50 mL et refroidir sur glace pendant 10 min.</li>
	<li>Récolter les cellules en effectuant la centrifugation à 1 050 x g pendant 3 min à 4 ° C. Placer les tubes et 10 electro-cuves sur la glace. Effectuez les étapes 7.3 à 7,8 sur glace.</li>
	<li>Jeter le surnageant et ajouter 15 mL de 1,2 M sorbitol. Secouer doucement les tubes pour remettre en suspension les cellules.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 1050 x g pendant 3 min à 4 ° C.</li>
	<li>Répétez les étapes 7.4 et 7.5. Jeter le surnageant. Ajouter 500 µL de 1,2 M sorbitol dans chaque tube, remettre les cellules en suspension et recueillir toutes les cellules dans un tube conique de 15 ml.</li>
	<li>Ajouter 1,2 M sorbitol à 2,4 mL (OD600 = 10 / 0,2 mL). Maintenir le tube sur la glace.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de cellules sorbitol-suspendu (Assurez-vous qu’ils sont totalement suspendus) dans un tube de EP contenant la fusion PCR construire, bien mélanger et transférer l’échantillon dans une cuvette-electro.</li>
	<li>Electroporate les cellules avec les options suivantes : champignons, ShS (2.00kV, 1 impulsion).</li>
	<li>Ajouter 600 µL de 1,2 M sorbitol à chaque electro-cuvette pour un volume total de 800 µL et s’étend ensuite les cellules sur quatre assiettes Oui (200 µL/plaque). Dix electro-cuvettes distribuera à 40 Oui plaques.</li>
	<li>Incuber les plaques à 30 ° C pendant 24 h.</li>
	<li>Exécuter l’électrodéposition de réplique pour YES + G418 et incuber les boîtes à 30 ° C pendant 3 jours.</li>
</ol>8. sélection des Mutants hétérochromatine-déstabilisant et en recherchant les faux positifs
<ol><li>Pour chaque plaque Oui + G418, effectuer le placage réplique à Oui-Ade (faible Ade) et plaques de PMG-Ade (N° Ade). Incuber les boîtes de répliques pendant 1 à 2 jours à 30 ° C, jusqu'à ce que certaines des colonies sur les plaques Oui-Ade montrent une coloration rouge (Figure 1).</li>
	<li>Comparer les plaques Oui-Ade et PMG-Ade et sélectionner des cellules qui montrent les rose ou gris sur la plaque de YES-Ade et poussent également sur la plaque de la PMG-Ade. Ne sélectionnez pas de colonies sans croissance sur PMG-Ade, car ils sont des faux positifs (par exemple, ce qui reflète que la cassette KAN a été intégrée à un site non visés ailleurs dans le génome).</li>
	<li>Prendre environ 1 x 105 cellules de chaque colonie et incuber à 10 µL de solution SPZ contenant 2,5 mg/mL zymolyase 100 T à 37 ° C pendant au moins 30 min. utilisation 1 µL de cette solution pour réaliser que le modèle de départ pour colony PCR (Figure 1 H).<ol>
<li>Faire SPZ (50 mL) en mélangeant 30 mL 2 M sorbitol, 4,05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 et 15 mL d’eau distillée (pH final, 7,5). Échantillons (5 mL) peuvent être complétées avec zymolyase et conservées en aliquotes de 500 µL à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer l’électrophorèse sur gel (gel d’agarose à 1.2 %, 180V, 20 min) pour visualiser les résultats de + la PCR sur colonie. Sélectionnez les réactions qui présentent des bandes PCR de taille correcte et digèrent 5 µL de chaque produit de la réaction avec XhoI (4 enzyme U, 1 tampon de digestion x, bain-marie à 37 ° C, 1 h) pour écarter les faux positifs (Figure 1 H).</li>
	<li>Effectuer l’électrophorèse sur gel pour visualiser les XhoI condensés (1,2 % gel d’Agarose, 180 V, 20 min). Marquer les colonies dont les produits PCR sont recoupées par XhoIet leur patch Oui + G418 plaques (Figure 1I).</li>
	<li>Isoler ADNg provenant des cellules de levure de fission et de réaliser le séquençage des produits PCR23. Comparer la séquence obtenue avec la séquence de type sauvage à identifier les mutations (Figure 1I).</li>
	<li>Directement ré-introduire le mutation(s) à cellules de type sauvage en les transformant avec fusion des constructions amplifiées par PCR à partir de cellules mutantes23. Utilisez le spotting pour confirmer le phénotype dans les cellules mutantes nouvellement formées (Figure 1J).<ol>
<li>Construction de transformation de fusion peut facilement être amplifiée par PCR avec des amorces p1 et p10 utilisant l’ADN génomique de mutants comme modèle dans un volume total de 50 µL (~ 1 µg ADN, enzymes de U 20, 1 x tampon de réaction) et en appliquant les cycles de réaction décrites dans tableau 2 . Transformation de la construction peut être faite en suivant les étapes 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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 <a target="_blank" href="https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx">https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx</a> (2000).</li>
<li>Seo, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+is+directly+involved+in+the+regulation+of+heterochromatin+spreading+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Tang, N. H., et al. <a target="_blank" href="https://peerj.com/preprints/3377/">Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body.</a> PeerJ Preprints. 5, e3377v3371(2017).</li>
<li>Rasooly, A., Weisz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+activities+of+phloxine+B+and+other+halogenated+fluoresceins+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).</li>
<li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis by PCR.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Mutagenèse aléatoire via Erreurs PCR est un puissant outil pour générer un bassin diversifié de mutants dans une région donnée. Cette technique est particulièrement utile pour les études visant à évaluer la fonction d’une protéine dans une circonstance particulière. Par exemple, nous avons utilisé ici Erreurs PCR afin d’évaluer la fonction de la sous-unité de protéasome 19 s, Rpt4, dans l’entretien de l’hétérochromatine. En faisant varier la région ciblée par la PCR erreurs et ajuster les conditions de projection, nous a...

La génétique vers l’avant est une méthode classique dans lequel chercheurs cherchent des mutants naturels qui présentent un phénotype particulier et effectuent des analyses génétiques. Dans la génétique inverse, les mutations sont introduites dans un gène d’intérêt et le phénotype est examiné. Dans ce dernier cas, la mutagénèse aléatoire d’un gène cible est souvent utilisé pour générer un groupe de mutants qui sont ensuite sélectionnés pour les phénotypes désirés, comme la sensibilité à la température ou modifié l’activité enzymatique. Diverses méthodes peuvent être utilisées pour réaliser la mutagénèse aléatoire, y compris les erreurs PCR1; D’irradiation UV2; mutagènes chimiques, tels que le méthanesulfonate d’éthyle (EMS) ou l’acide nitreux3; l’utilisation de souches mutantes temporaire, telles que celles surexprimant mutD5 4; et ADN brassage5.
Nous décrivons ici une stratégie inverse-génétique dans laquelle nous utilisons Erreurs PCR pour générer des piscines mutantes d’un gène cible dans la levure de fission. Comme on pourrait le deviner de son nom, cette méthode génère des mutations en introduisant délibérément des erreurs pendant l’ACP. Contrairement aux autres méthodes de mutagenèse, erreurs PCR permet à l’utilisateur de définir la région à être mutagénisées tant. Ceci est particulièrement utile dans les efforts déployés pour étudier la fonction d’une protéine/domaine d’intérêt.
Pour illustrer cette procédure de mutagénèse aléatoire, dans les présentes utilisons-nous rpt4 +, qui code pour la sous-unité de protéasome 19 s, par exemple. Rpt4 a démontré avoir protéolyse indépendante des fonctions dans les organismes autres que fission levure6,7,8,9, et un défaut de protéolyse pourrait causer des effets indirects en altérant les protéines niveaux. Nous avons, par conséquent, projeté pour les mutants qui a déclenché les changements indépendants de protéolyse, dans le but d’étudier la fonction du protéasome sur hétérochromatine.
PCR erreurs peut être appliqué à n’importe quelle région du gène par le réglage de l’emplacement auquel lient les amorces. Mutants qui montrent le changement phénotypique souhaité peuvent être identifiés avec des journalistes appropriés. Ici, nous avons utilisé un journaliste ade6 + inséré au centromère 1 externe "répétition" (otr) région10. L’hétérochromatine constitutive est formé à cette région11, alors que le journaliste ade6 + est réduit au silence à l’état sauvage ; Ceci est indiqué par colonies rouges10. Une mutation qui déstabilise l’hétérochromatine constitutive au centromère donneront lieu à l’expression du reporter ade6 + qui est visualisée comme colonies blanches.

<table><tbody><tr><td><fort>1. Média</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td>Sulfate d’adénine</tr><tr><td></td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracile&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull ; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Phtalate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull ; 7H2O&nbsp ;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&bull ; 4H2O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Molybdate de sodium dihydraté</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&bull ; 5H2O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Acide nicotinique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasique</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, généticine</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>2. Réactions enzymatiques</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS ADN polymérase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>Pour la mutagénèse dirigée</td></tr><tr><td>GeneMorphII Kit de mutagenèse aléatoire</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>Pour la PCR sujette aux erreurs</td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>Pour la PCR de fusion</td></tr><tr><td>Ex Taq&nbsp ; ADN polymérase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>Pour la PCR générale</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>3. Equipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen carré, noir</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>Pour</td></tr><tr><td>réplique Outil de placage</td><td>réplique VWR</td><td>25395-380</td><td>Pour réplique</td></tr><tr><td>Électroporateur MicroPulser</td><td>Biorad</td><td>1652100&nbsp ;</td><td>Pour la transformation de la levure à fission</td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation, espace de 0,2 cm</td><td>Biorad</td><td>1652086&nbsp ;</td><td>Pour la transformation de la levure à fission</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>pour la réaction de rampe de PCR de fusion&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Mutagenèse aléatoire d’un gène cible est couramment utilisée pour identifier les mutations qui donnent le phénotype souhaité. Des méthodes qui peuvent être utilisés pour réaliser la mutagénèse aléatoire, erreurs PCR est une stratégie pratique et efficace pour générer un bassin diversifié des mutants (i.e., une bibliothèque mutante). Erreurs PCR est la méthode de choix quand un chercheur veut muter une région prédéfinie, comme la région codante d’un gène tout en laissant les autres régions génomiques pas affectée. Après que la bibliothèque mutante est amplifiée par PCR sujette aux erreurs, il doit être cloné dans un plasmide approprié. La taille de la bibliothèque générée par PCR erreurs est limitée par l’efficacité de l’étape de clonage. Toutefois, dans la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe, l’étape de clonage peut être remplacée par l’utilisation d’une fusion très efficace en une seule étape PCR pour générer des constructions pour la transformation. Mutants de phénotypes désirées peuvent sélectionner à l’aide de reporters appropriés. Nous décrivons ici cette stratégie en détail, par exemple, un journaliste inséré à l’hétérochromatine centromérique.

Les mutants Rpt4 acquises en suivant les procédures décrites dans la Figure 1 peuvent être analysés en évaluant les couleurs des colonies. Les couleurs des colonies sont repérées sur les plaques pertinentes en diminuant le nombre de cellules dans la Figure 2. Le journaliste ade6 + inséré dans la région de l’hétérochromatine est réduit au silence dans le type sauvage et montre des colonies rouges en plaque Oui-Ade. Une fo...

Cet article décrit une méthodologie détaillée pour la mutagénèse aléatoire d’un gène cible chez la levure. À titre d’exemple, nous ciblons rpt4 +, qui code une sous-unité du protéasome 19 s et écran pour les mutations qui déstabilisent l’hétérochromatine.

Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

L’objectif global de cette mutagenèse aléatoire est de dépister les mutations qui déstabilisent l’hétérochromatine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hétérochromatine, telles que les facteurs qui régulent la formation et le maintien de l’hétérochromatine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut cibler spécifiquement un gène souhaité pour la mutagénèse, même si le gène est essentiel.Pour commencer, préparez l’extrait de levure avec des suppléments, ou OUI, sans adénine, le milieu de glutamate Pombe, ou PMG, et le PMG sans adénine, en mélangeant les composants comme indiqué dans ce tableau. Après l’autoclave et l’ajout de G418 si nécessaire, remuez le milieu pendant encore cinq à dix minutes. Ensuite, aliquote le milieu dans des boîtes de Pétri de 90 millilitres et conservez les plaques à quatre degrés Celsius.À l’aide du rpt4 positif cloné, avec ses cinq UTR premiers et ses trois premiers UTR et sa mutation silencieuse, ainsi que les amorces p5 et p6 et une polymérase spéciale, conçue pour générer un taux d’erreur élevé, effectuez une PCR sujette aux erreurs dans un volume total de 50 microlitres. Après avoir généré une construction de transformation-fusion, selon le protocole de texte, inoculez dix millilitres de milieu YES avec de la levure et incubez-le pendant plus de 16 heures jusqu’à saturation. Utilisez 200 millilitres de milieu YES pour diluer les cellules à une DO 600 de 0,2 et incubez la culture à 30 degrés Celsius en agitant pendant cinq à six heures jusqu’à une DO 600 de 0,6 à 0,8.Calculez le volume des cellules dont la somme est égale à OD600 de 30. Ensuite, distribuez les cellules dans quatre tubes coniques de 50 millilitres et refroidissez-les sur de la glace pendant 10 minutes. Récoltez les cellules par centrifugation à 1050 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes.Ensuite, placez les tubes microfuges avec la cassette d’ADN et 10 cuvettes électro sur de la glace. Pendant qu’il est encore sur de la glace, jetez le surnageant et ajoutez 15 millilitres de sorbitol à 1,2 molaire, secouez doucement les tubes pour remettre les cellules en suspension, puis centrifugez les cellules à 1050 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Jetez le surnageant et effectuez un deuxième lavage au sorbitol.Après la centrifugation, jeter le surnageant. Ensuite, remettez les cellules en suspension et rassemblez-les toutes dans un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 1,2 molaire de sorbitol jusqu’à 2,4 millilitres.Gardez le tube de cellules sur de la glace. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de cellules suspendues au sorbitol dans un tube contenant la construction de la PCR de fusion, mélangez bien et transférez l’échantillon dans une cuvette électrique. Il est important de ne pas utiliser une quantité excessive de cassette PCR, car cela donnerait des erreurs de décharge.Électroporez les cellules à l’aide des options suivantes : ajoutez 600 microlitres de sorbitol 1,2 molaire dans chaque cuvette électrique pour un volume total de 800 microlitres. Ensuite, répartissez les cellules sur quatre plaques YES. Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 24 heures.Ensuite, effectuez une réplique du placage sur YES plus G418 avant d’incuber les plaques pendant trois jours supplémentaires. Pour chaque plaque YES plus G418, effectuez une réplique du placage à YES sans adénine et PMG sans plaques d’adénine. Incuber les répliques des plaques à 30 degrés Celsius pendant un à deux jours jusqu’à ce que certaines des colonies sur les plaques YES sans adénine présentent une coloration blanche.Comparez OUI sans adénine et PMG sans plaques d’adénine et sélectionnez des cellules qui apparaissent en rose ou en blanc sur la plaque OUI sans adénine, et qui se développent également sur la plaque PMG sans adénine. Ne sélectionnez pas de colonies sans croissance sur PMG sans adénine, car ce sont des faux positifs. Choisissez chaque colonie et ajoutez-la à 10 microlitres de solution SPZ contenant 2,5 milligrammes par millilitre de zymolyase 100T.Ensuite, incubez les colonies à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Après l’incubation, utilisez un microlitre de cette solution comme modèle de départ pour la PCR de la colonie. Après avoir digéré les colonies sélectionnées et effectué l’électrophorèse sur gel conformément au protocole textuel, marquez les colonies dont les produits PCR ont été coupés par XHO1 et patchez-les sur les plaques YES plus G418.Suite à l’isolement de l’ADNg à partir de cellules de levure à fission, et au séquençage des produits PCR selon le protocole texte, comparer la séquence obtenue avec la séquence de type sauvage pour identifier les mutations. Une fois que les mutations sont réintroduites dans les cellules de type sauvage, utilisez le spotting pour confirmer le phénotype dans les cellules mutantes nouvellement fabriquées. Les mutants rpt4 générés à l’aide du protocole démontré dans cette vidéo peuvent être analysés en évaluant les couleurs des colonies.Comme le montre cette figure, les colonies ont été repérées sur les plaques correspondantes en diminuant le nombre de cellules. Le rapporteur d’adénine inséré dans la région de l’hétérochromatine est réduit au silence dans les cellules de type sauvage et produit des colonies rouges sur YES sans plaques d’adénine. Une fois que l’hétérochromatine est déstabilisée et que le rapporteur d’adénine est exprimé, des colonies blanches peuvent être observées sur le OUI sans plaques d’adénine comme on le voit avec le mutant clr4-delta.Les mutants rpt4 criblés sont, comme le montre, le mutant rpt4-1 présentant la déstabilisation de l’hétérochromatine la plus sévère. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines pour obtenir les mutants souhaités. Lors de cette procédure, il est important d’éliminer les faux positifs car ils sont plus fréquents que prévu.Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la purification des protéines et les tests d’activité enzymatique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la nature des protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des mutants dans un gène cible avec le phénotype souhaité.

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Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure (Vidéo) | JoVE Journal

Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

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