Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

L’objectif global de ce modèle de peau sphéroïde de mélanome organotypique 3D est de récapituler à la fois l’architecture et la complexité multicellulaire d’un organe ou d’une tumeur in vivo tout en permettant une intervention expérimentale systématique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le mélanome, telles que l’interaction tumeur-hôte et l’intervention thérapeutique. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut mimer l’architecture 3D des métastases non vascularisées in vivo.

Les implications de cette technique s’étendent à ce que la thérapie du mélanome car elle reflète l’hétérogénéité tumorale. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car la qualité des cellules primaires est déterminante et aucun antibiotique n’est utilisé pendant le processus cellulaire. Les implications de cette technique s’étendent à ce que le traitement du mélanome car elle reflète l’hétérogénéité tumorale.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il est très important de manipuler correctement le modèle 3D de la peau du mélanome. Pour commencer, cultivez des cellules de mélanome 451LU en utilisant un milieu RPMI contenant 10 % de FCS, selon les protocoles généraux de culture cellulaire. Pour générer des sphéroïdes de mélanome, lavez les cellules de mélanome cultivées dans du PBS.

Ajoutez ensuite cinq millilitres d’une fois trypsine EDTA dans PBS. Incuber pendant trois à cinq minutes à température ambiante. Ajouter cinq millilitres de RPMI contenant 10 % de FCS pour neutraliser la trypsine.

Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger. Centrifuger à 200 fois g pendant cinq minutes pour récolter les cellules. Mettez à nouveau en suspension la pastille de cellule dans un RPMI contenant 10 % de FCS.

Ensuite, comptez les cellules et diluez la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de 10 000 cellules par millilitre. À l’aide d’une multipipette électronique, faites 40 à 25 microlitres de suspension cellulaire sur la surface intérieure du couvercle d’une boîte de culture cellulaire stérile non adhésive de 10 centimètres. Ensuite, retournez le couvercle d’un mouvement rapide et fluide et placez-le sur la boîte de culture cellulaire contenant cinq millilitres de PBS.

Cultivez les plats suspendus à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 14 jours. Cinq jours après le repérage initial de la goutte, utilisez un distributeur électronique pour ajouter 10 microlitres de RPMI contenant 10 % de FCS à chaque goutte. Après 10 à 15 jours, récoltez les sphéroïdes en les rinçant doucement du couvercle avec du PBS.

Collectez les sphéroïdes dans une boîte de culture cellulaire fraîche non adhésive. Pour générer la contrepartie cutanée des reconstructions cutanées, placez des inserts de membrane de huit micromètres dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Pour chaque insert, remettre en suspension 100 000 fibroblastes dans une solution de neutralisation de gel.

Ensuite, mélangez rapidement la suspension de fibroblastes avec du collagène de type un dans un rapport de un à trois dans un volume final de 500 microlitres sans former de bulles. Ensuite, à l’aide d’une pipette, ajoutez la suspension à chaque insert. À l’intérieur d’une hotte stérile, placez les inserts à température ambiante sans fluide pendant 30 minutes pour permettre aux gels dermiques de se déposer.

Ensuite, couvrez les gels avec le DMEM et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Après l’incubation d’une nuit, retirez le DMEM des gels dermiques et déséquilibrez-les avec de l’EGM pendant deux heures à 37 degrés Celsius pour générer la contrepartie épidermique de la reconstruction cutanée. Ensuite, utilisez une pipette pour retirer l’EGM des gels.

Ensuite, ensemencez soigneusement 100 000 kératinocytes, remis en suspension dans 100 microlitres d’EGM sur chaque gel. Incuber les reconstructions pendant une heure et demie à 37 degrés Celsius pour permettre aux kératinocytes d’adhérer au gel dermique. À l’aide d’une pointe de pipette, retirez délicatement le gel résiduel de la paroi de l’insert.

Ensuite, couvrez chaque reconstruction avec 800 microlitres d’EGM et cultivez pendant sept jours à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Retirez soigneusement le gel résiduel de la paroi intérieure à l’aide d’une petite pointe de pipette large. Le huitième jour, placez les inserts dans des puits séparés d’une plaque à six puits.

Ensuite, ajoutez 1,2 à 1,4 de mélanome métastatique moyen à chaque puits pour couvrir uniquement la base de la peau reconstruite. Ensuite, incubez pendant 10 à 17 jours à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Ajoutez seulement 1,2 à 1,4 ml de milieu de mélanome métastatique dans chaque puits afin que la peau reconstruite soit alimentée en milieu à partir du fond du puits, mais qu’elle ne soit pas recouverte de milieu.

Pour intégrer les sphéroïdes de mélanome dans la contrepartie cutanée de la reconstruction complète de la peau, utilisez du PBS pour rincer soigneusement les sphéroïdes du couvercle d’une boîte de culture cellulaire suspendue. Pour chaque reconstruction complète de la peau, prélevez 10 à 20 sphéroïdes dans une boîte de culture cellulaire stérile et non adhésive. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirez soigneusement l’excès de PBS.

Ensuite, aspirez les sphéroïdes dans un volume minimal d’EGM. Ensuite, transférez-les dans le volume requis de solution de neutralisation de gel, contenant 100 000 fibroblastes. Pour chaque insert, mélangez la suspension sphéroïde avec du collagène de type un dans un rapport de un à trois dans un volume final de 500 microlitres.

Enfin, générez des reconstructions organotypiques complètes de la peau comme décrit dans le protocole décrit précédemment. La peau humaine normale est comparée à la reconstruction de la peau pour valider la reconstruction organotypique de la peau en 3D. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des coupes de paraffine montre que le derme et l’épiderme de la peau reconstruite sont comparables à ceux des peaux normales.

La peau humaine normale et la reconstruction cutanée sont analysées immunohistochimiquement pour comparer la différenciation épidermique. L’immunocoloration contre les marqueurs de stratification épidermique, à savoir la kératine 14, la kératine 10 et l’involucrine et la filaracine, indique des niveaux similaires de différenciation de la kératine entre la peau reconstruite et la peau normale. L’immunocoloration contre la laminine cinq indique que la lame basale est formée pour relier physiologiquement les homologues épidermiques et dermiques de la peau reconstruite, comme la peau normale.

La coloration à l’hématoxyline à l’éosine de la section de paraffine de la peau du mélanome indique que la distribution cellulaire des sphéroïdes du mélanome est similaire à celle des métastases cutanées du mélanome humain non vascularisé in vivo. L’examen histologique révèle la présence d’une sous-population périphérique proliférante et d’une sous-population nécrotique centrale des cellules du mélanome. Une fois maîtrisée, cette technique pourrait être réalisée en 40 jours environ, si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser des cellules primaires de la meilleure qualité. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs sur le mélanome pour explorer la réactivité in vitro dans un environnement imitant in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer un modèle de peau de mélanome organotypique 3D humain.