Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo
April 11th, 2018
Nous présentons une méthode qui peut donner un aperçu de l’événements précoces qui sous-tendent la neurodégénérescence davantage et basée sur la technique de cerveau établies ex vivo , combinant les avantages des expériences in vivo et in vitro . En outre, il représente une occasion unique pour une comparaison directe du groupe traité et non traité dans le même plan anatomique.
L’objectif global de cette procédure est d’étudier simultanément deux hémitranches spéculaires obtenues à partir du même plan anatomique et de montrer les effets suite à un traitement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions cruciales dans le domaine des neurosciences moléculaires, telles que les événements primaires affectant les molécules clés impliquées dans les processus neurodégénératifs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut fournir et servir à réaliser des cascades moléculaires sous-jacentes à des événements neurodégénératifs.
Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des événements primaires survenant dans la neurodégénérescence, elle peut également être appliquée pour étudier des modèles animaux de différents troubles ou d’autres propriétés d’organes et de tissus. Commencez par préparer deux fluides céphalo-rachidien artificiels différents. L’un utilisé pour le tranchage du cerveau, et l’autre pour l’étape d’incubation.
Après avoir préparé le tranchage ACSF, mélangez la solution et conservez-la sur de la glace. De même, préparez l’enregistrement ACSF, mais conservez-le à température ambiante. Oxygénez les deux solutions.
Ensuite, préparez les instruments pour la décapitation et l’ablation du cerveau à la hotte de dissection. Ensuite, configurez les paramètres du vibratome. Réglez l’épaisseur de la tranche selon vos besoins.
Comme trois cents microns. Réglez la fréquence à sept et la vitesse à six. Ensuite, insérez la chambre du vibratome et entourez-la de glace.
Pour la section du cerveau, ouverture de la valve carbogen pour oxygéner le tranchage ACSF. Sélectionnez le débit minimum d’environ deux millilitres par minute. Maintenant, dans deux tubes de 15 millilitres, préparez les conditions tus.
Chargez un tube avec 10 millimètres de l’ACSF d’enregistrement comme contrôle. Chargez l’autre avec les 10 millilitres d’enregistrement ACSF enrichis du traitement. Dans ce cas, deux micromolaires de T30.
Vortex les deux tubes et gardez-les sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires. Inciser la peau sur le crâne avec une lame chirurgicale. Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez le crâne le long de la ligne médiane de la partie postérieure à l’os au-dessus des bulbes olfactifs.
Ensuite, tirez latéralement sur les deux côtés du crâne à l’aide d’une pince pour accéder au cerveau. Insérez une spatule ventralement dans le cerveau. Retirez-le doucement et gardez-le hydraté dans de l’ACSF glacé pendant environ cinq minutes.
Après le repos dans l’ACSF froid, transférez le cerveau dans un papier filtre. Et après avoir retiré le cervelet, collez le cerveau verticalement sur le disque de vibratome. Transférez-le ensuite dans la chambre de sectionnement remplie de tranchage glacé ACSF.
Commencez maintenant le flux d’oxygène vers la solution de la chambre. Ajustez ensuite l’intervalle de coupe et procédez à la section du cerveau. Collectez les sections contenant la région d’intérêt à l’aide de méthodes standard.
Maintenant, divisez soigneusement chaque section avec de petits ciseaux le long de la ligne médiane pour obtenir deux hémitranches spéculaires. Utilisez chaque paire d’hémitranches pour le contrôle et l’état traité. Après avoir été divisés, laissez reposer les hémisections dans la chambre du vibratome pendant cinq à dix minutes.
Après le repos, transférez doucement les hémisections à l’aide d’une pipette en verre dans un pot bouillonnant contenant de l’enregistrement ACSF à température ambiante. Laissez ensuite les hémisections récupérer pendant environ 30 minutes avant de continuer. Pendant la pause, chargez trois flacons en verre de trois millilitres d’ACSF d’enregistrement pour le groupe témoin et trois flacons de trois millilitres d’ACSF enrichi de T30 pour le groupe traité.
Après le repos de 30 minutes, dans les cinq minutes, transférez l’échantillon dans les bains. Chargez d’abord les hémitranches consécutives dans la solution de contrôle à l’aide d’un pinceau. Ensuite, à l’aide d’une brosse différente, transférez les hémisections controlatérales dans la solution de traitement.
Ensuite, scellez les flacons avec des bouchons en plastique contenant des aiguilles de calibre 21 pour l’administration du carbogène à l’échantillon. Fournir de l’oxygène à un débit minimal, tel que deux millilitres par minute pour éviter tout mouvement du tissu cérébral entraînant d’éventuels dommages mécaniques au tissu. La configuration est terminée.
Commencez maintenant une incubation de cinq heures. Après l’incubation, arrêtez le flux d’oxygène et débouchez les flacons. Transférez ensuite délicatement les hémitranches à l’aide de la brosse appropriée dans des tubes de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de tampon de lyse maintenu sur de la glace.
Ensuite, à l’aide de pilons séparés, homogénéisez chaque tissu. Terminez les étapes de transfert et d’homogénéisation en 10 à 15 minutes pour les six échantillons. Maintenant, centrifugez les échantillons homogénéisés à 1 000 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après l’essorage, transférez les surnageants dans de nouveaux tubes et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. L’administration d’un peptide toxique, le T30, dans le cerveau antérieur du basilic contenant des hémisections a eu trois effets spécifiques sur les tissus. Il a modulé l’expression du récepteur nicotinique alpha-sept, la phosphorylation de Tau et l’expression de la bêta-amyloïde.
Le récepteur nicotinique a montré une augmentation significative de l’hémitranche rostrale traitée, tandis que la tranche intermédiaire n’a révélé aucun changement entre les deux conditions. Dans la section postérieure, une réduction significative était présente dans la partie exposée T30. Les niveaux de Tau phosphorylée ont été significativement augmentés dans la région antérieure.
D’autre part, les deux autres sections du basilic avant le cerveau ne montrent aucune différence significative entre les conditions. La bêta-amyloïde a été significativement augmentée après l’exposition à la T30 dans les hémisections rostrale et intermédiaire. Cependant, dans la lame codale, il n’y avait pas d’effet mesurable sur l’expression de la bêta-amyloïde.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures si elle est correctement exécutée.
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Aperçu
Cette étude présente une technique ex-vivo du cerveau pour étudier les premiers événements neurodégénératifs en utilisant des demi-tranches appariées pour une analyse comparative. La méthode permet une surveillance directe des conditions traitées et non traitées dans le même cadre anatomique, offrant des aperçus sur les changements moléculaires clés associés à la neurodégénérescence.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Neurodégénérescence
- Biologie cellulaire et moléculaire
Contexte
- Les processus neurodégénératifs impactent les voies de signalisation critiques dans la santé neuronale.
- L'investigation de ces processus au niveau moléculaire est essentielle pour comprendre les mécanismes de la maladie.
- Les modèles comparatifs dans la même structure anatomique permettent des aperçus plus précis.
Objectif de l'étude
- Examiner les effets du traitement sur les événements moléculaires associés à la neurodégénérescence.
- Fournir une méthode qui peut également être adaptée pour différents modèles animaux ou investigations de tissus.
- Analyser les principaux changements moléculaires en réponse à divers traitements.
Méthodes utilisées
- Des tranches cérébrales ex-vivo ont été utilisées, en se concentrant sur des demi-tranches appariées du même cerveau pour les conditions témoins et traitées.
- L'étude a utilisé un peptide toxique, T30, pour évaluer son impact sur des marqueurs moléculaires spécifiques dans le cerveau basal.
- Les étapes clés comprenaient la préparation de fluides cérébrospinaux artificiels (ACSF), le sectionnement du cerveau, l'incubation et l'homogénéisation pour l'analyse ultérieure.
Principaux résultats
- Le traitement T30 a provoqué des changements significatifs dans l'expression des récepteurs nicotiniques alpha sept, la phosphorylation de la tau et les niveaux de bêta-amyloïde dans diverses régions du cerveau.
- Des augmentations notables des niveaux de tau phosphorylée et de bêta-amyloïde ont été observées, soulignant la capacité de la méthode à révéler des mécanismes neurodégénératifs critiques.
- Cette approche soutient l'inférence de cascades moléculaires spécifiques comme cibles pertinentes pour la recherche sur la neurodégénérescence.
Conclusions
- Cette technique permet une investigation simultanée des événements neurodégénératifs avec des comparaisons directes, facilitant une compréhension plus approfondie des mécanismes de la maladie.
- Les résultats suggèrent des voies pour une exploration plus approfondie des cibles moléculaires dans la neurodégénérescence et potentiellement d'autres troubles.
- Les connaissances acquises peuvent éclairer les stratégies thérapeutiques et faire progresser l'étude des maladies neurodégénératives.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This ex-vivo brain slice method enables direct comparison of treated and untreated tissue from the same anatomical region, supporting mechanistic de-risking in early neurodegeneration target validation. By preserving cytoarchitecture and local functionality, it provides a physiologically relevant system for evaluating molecular responses to toxic peptides or drug candidates. The approach enhances predictive confidence in lead identification by revealing site-specific, dose-dependent, and time-dependent changes in AD-relevant biomarkers.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring differential expression of α7-nAChR, p-Tau, and Aβ across brain subregions.
- Operational Value: Enables paired hemislice controls to reduce biological variability and improve assay sensitivity.
- Strategic Value: Supports target de-risking through spatially resolved biomarker readouts in disease-relevant circuits.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative molecular readouts (receptor expression, phosphorylation, protein levels) for compound screening.
- Operational Value: Uses standardized ACSF perfusion and oxygenation to ensure reproducible slice viability.
- Strategic Value: Facilitates dose-response and time-course assays in a single animal, improving throughput and reducing resource use.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models early AD-like molecular changes in the basal forebrain, a region selectively affected in neurodegeneration.
- Operational Value: Allows multi-region analysis from one brain, increasing data yield per animal.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions by linking target engagement to downstream pathophysiological markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, bridging target engagement assays to phenotypic screening by providing mechanistic readouts in a disease-relevant neural system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neurodegenerative cascades via spatially resolved biomarker analysis.
- Screening: Enables standardized, reproducible compound testing with quantitative molecular outputs.
- Analytics: Delivers multiplexed readouts (receptor, phospho-protein, amyloid) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects molecular changes in basal forebrain to AD pathology, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Reusable across treatment conditions, time points, and brain regions from a single preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic de-risking of neurodegenerative pathways.
- Operational Value: Standardized tissue preparation and incubation ensure reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by identifying ineffective targets early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on target-specific biomarker modulation.
Implementation Considerations
- Expertise in neuroanatomy and vibratory sectioning is required to obtain viable hemislices.
- Instrumentation includes a vibratome, oxygenation system, and temperature-controlled incubation setup.
- Standardization of ACSF composition, slice thickness, and perfusion rates is critical for reproducibility.
- Adaptation to other brain regions or species may require optimization of slicing and recovery parameters.
- Tissue viability limits experimental windows, necessitating timely processing post-sectioning.
